Siamo grati alla Fondazione Boettcher e l'associazione sclerosi laterale amiotrofica (n. 17-II-344) per il loro supporto di questa ricerca.

tutte le procedure che coinvolgono i topi sono state approvate dal comitato di uso e University of Colorado-Anschutz Medical Campus istituzionali Animal Care (91813(05)1D).
 1. giorno 1: primaria (1°) Immunostaining con l'albumina di siero bovino (BSA) blocco <ol><li>asciugato all'aria sezioni congelate del muscolo del hindlimb del mouse (ad esempio, tibiale anteriore, soleo) montate su vetrini caricati per ~ 30 min 11. disegnare un bordo intorno alle sezioni utilizzando una penna PAP barriera idrofoba.</li>
	<li>Posto ~ 250 µ l di 5% BSA/tampone fosfato salino (BSA/PBS) su ogni diapositiva per bloccare il legame non specifico anticorpo. Incubare i vetrini a temperatura ambiente per 1 h.</li>
	<li>Mentre il blocco, 01:50 di preparare diluizioni dell'anticorpo 1 ° surnatante nel 5% BSA/PBS (tutti sono anticorpi monoclonali di topo; cfr. tabella 1 6 , 12); preparare 250 µ l di soluzione per ogni diapositiva. Mantenere 1° anticorpo scorte e diluizioni su Ice.</li>
</ol> <img alt="Table 1" src="/files/ftp_upload/56024/56024table1.jpg" /> tabella 1: anticorpi primari utilizzati per distinguere MyHCs.
<ol start="4"> <li>a seguito di aspirazione della soluzione blocco 5% BSA/PBS, aggiungere 250 µ l della diluizione di anticorpo 1° alle diapositive appropriate. Aggiungere 250 µ l di 5% BSA/PBS al controllo di negativo solo anticorpo secondario (2°) scivola.</li>
	<li>Incubare a 4 ° C per 24-48 h in un ambiente umido. 
	Nota: Una capsula di Petri rivestito in alluminio con filtro di carta inumidito può servire come una camera di incubazione adatto.</li>
</ol> 2. Giorno 2:2 ° Immunostaining con anticorpi fluorescenti <ol><li>aspirare la soluzione di anticorpo di 1° o 5% BSA/PBS soluzione di controllo. Lavare tutte le diapositive tre volte, 10 min con 5% BSA.</li>
	<li>Durante il lavaggio, preparare diluizioni 1: 200 degli anticorpi purificati, coniugati fluoroforo 2 ° nel 5% BSA/PBS (Vedi tabella 2, sono tutti anti-topo di capra). Preparare 250 µ l di soluzione per ogni diapositiva. Tenere all'oscuro su Ice. anticorpi coniugati fluoroforo a 2°</li>
</ol> <img alt="Table 2" src="/files/ftp_upload/56024/56024table2.jpg" /> tabella 2: anticorpi secondari coniugati fluoroforo utilizzato per visualizzare primario riconoscimento dell'anticorpo di MyHCs.
<ol start="3"> <li>a seguito di aspirazione della terza applicazione di soluzione bloccante di 5% BSA/PBS, aggiungere 250 µ l della diluizione di anticorpo 2° a tutte le diapositive. Incubare per 90 min a temperatura ambiente in un ambiente buio, umido.</li>
	<li>Soluzione di anticorpo 2° aspirato. Lavare tutte le diapositive tre volte, 10 min con 5% BSA/PBS.</li>
	<li>Risciacquare con PBS. Secco per 10 min.</li>
	<li>Montare il coprioggetto con un mezzo di montaggio acquoso non permanente, bassa viscosità.</li>
	<li>Quando asciutto, sigillare i bordi di diapositiva con smalto. Asciugare e conservare in un contenitore scuro.</li>
</ol> 3. Diapositive con epifluorescenza di imaging <ol><li>pulire i vetrini con un piccolo, 70% imbevuto di etanolo lab-wipe.</li>
	<li>Ottenere immagini digitali di sezioni di muscolo immunostained utilizzando un microscopio a epifluorescenza dotato di un apparecchio fotografico (Vedi la Tabella materiali).
	<ol><li>Selezionare un'area di circa 1 mm 2 (obiettivo 10x, NA 1,4).</li>
		Filtro passa-lungo di <li>Vedi fluorescenza degli anticorpi coniugati Alexa 488 2° tramite un 505 nm. Mostra la fluorescenza generata da eccitazione degli anticorpi coniugati Alexa 594 2° tramite un filtro di passa-lungo 595 nm. Digitalizzare immagini con un computer PC equipaggiato con un software di imaging compatibile. Includere la barra della scala da imaging software per analisi successive.</li>
	</ol></li></ol> 4. Analisi delle immagini con Fiji Nota: prima di procedere con l'analisi, Fiji (disponibile gratuitamente dal National Institutes of Health, Bethesda, MD) deve essere installato tramite https://imagej.net/Fiji/Downloads. Inoltre, la macro utilizzata in questo processo è fornita nel File supplementare. Inserire il file di macro in una directory accessibile.
<ol><li>Carico un campo chiaro l'immagine di una sezione selezionata in Fiji. Passare al plugin &#8594; segmentazione &#8594; segmentazione Weka Trainable.</li>
	<li>Al fine di stabilire le zone cellulari della sezione, tracciare una linea su una fibra e fare clic &#34; aggiungere alla classe 1 &#34;. Quindi, tracciare una linea sullo spazio tra le fibre e fare clic &#34; aggiungere alla classe 2 &#34; per contrassegnare i domini extracellulari. Ripetere fino a quando ci sono 5-10 etichette in ogni classe.
	<ol><li>Clic treno classificatore. La sovrapposizione risultante di rosso e verde, aggiungere altre etichette manualmente (Vedi punto 4.2) a pezzi in modo non corretto segmentate dell'immagine, se necessario. Ripetere fino a fibre (rosso) in modo appropriato sono separati dallo spazio tra le fibre (verde).</li>
	</ol></li> <li>Clic &#34; probabilità di ottenere &#34; e salvare l'immagine in una cartella nuova con etichetta.</li>
	<li>Ripetere la procedura di cui sopra (punti 4.2-4.3) con l'immagine fluorescente prelevato dallo stesso campo. Etichetta immunostained fibre come &#34; classe 1 &#34; e tutte le regioni non fluorescenti come &#34; classe 2 &#34;. Salvare la mappa di probabilità risultante nella stessa cartella in cui è memorizzata l'immagine trasformati brightfield.</li>
	<li>Aprire una delle mappe di probabilità precedentemente salvato in Fiji. Disegnare una linea retta nella barra della scala fornita dal software di imaging. Vai a analizzare &#8594; impostare scala. Modificare i parametri (cioè, distanza nota, unità di lunghezza) al loro valori appropriati come dato dalla barra della scala, quindi controllare il &#34; Global &#34; casella per standardizzare la scala per ogni immagine.</li>
	<li>Passa al plugin &#8594; macro &#8594; eseguire &#8594; Tyagi et al fibra quantificazione macro.ijm (vedere il File supplementare). Immediatamente, verrà visualizzato un riquadro di navigazione. Aprire l'immagine &#39; cartella host s; verrà visualizzata una finestra di dialogo. Per ogni finestra di dialogo, modificare il &#34; sfondo &#34; a discesa valore per &#34; luce. &#34; Nota: la cartella ora verrà popolata con immagini dei contorni della fibra e file di software di calcolo dei risultati (CSA e Feret diametro sono più pertinenti allo quantificare la morfologia delle fibre; parametri misurati possono essere regolati in analizzare impostare misure). Dati di morfologia fibra generati dalla funzione di poro-analisi di Fiji saranno trasferiti automaticamente ai file di software di foglio di calcolo per entrambe le immagini fluorescenti e luminose campo.</li>
	<li>Calcolare la frazione di fibre che esprime un determinato MyHC in un campo dividendo il numero di fibre fluorescenti nel campo per il numero di fibre totale nell'immagine corrispondente campo luminoso.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essentiality+of+histo-+and+cytochemical+studies+of+skeletal+muscle+in+the+investigation+of+neuromuscular+disease.">The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease.</a> Neurol. 12, 778-784 (1962).</li><li>Dobrowolny, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+is+a+primary+target+of+SOD1G93A-mediated+toxicity.">Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity.</a> Cell Metab. 8, 425-436 (2008).</li><li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricting+calcium+currents+is+required+for+correct+fiber+type+specification+in+skeletal+muscle.">Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle.</a> Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).</li><li>Guth, L., Samaha, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+the+histochemical+demonstration+of+actomyosin+ATPase.">Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase.</a> Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).</li><li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat,+mouse,+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis.">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li><li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains.">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++permeation+and/or+binding+to+Cav1.1+fine-tunes+skeletal+muscle+Ca2++signaling+to+sustain+muscle+function.">Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function.</a> Skelet Muscle. 5 (4), (2015).</li><li>Sawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-step+immunostaining+method+to+visualize+rodent+muscle+fiber+type+within+a+single+specimen.">A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen.</a> PLoS One. 11 (11), (2016).</li><li>Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+image+analysis+tool+for+the+classification+of+muscle+fibre+type+using+immunohistochemical+staining.">Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining.</a> Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).</li><li>Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+immunohistochemical+classification+of+skeletal+muscle+fibres+in+mouse.">A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse.</a> Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), (2015).</li><li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres.">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).</li><li>Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+fiber+types+in+C57Bl6j+mice.">Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice.</a> Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).</li><li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles.">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li><li>Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+and+skeletal+muscle+adaptations+to+voluntary+wheel+running+in+the+mouse.">Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).</li></ol>

Gli autori non hanno nessun conflitto di interessi di divulgare.

Qui, abbiamo fornito direzione utile per l'identificazione dei tipi di fibra muscolare scheletrica. In tal modo, descriviamo un nuovo algoritmo per l'analisi dei dati.
Poiché in gran parte, i nostri risultati confermano quelli di precedenti rapporti5,8,10 e riflettono le nostre misurazioni manuali, l'algoritmo sembra essere accurata. Ancora, abbiamo incontrato alcuni trabocchetti sperimentale infrequenti inclusi i bordi poco chiaro fibra risultanti dal sezionamento artefatto. L'impatto di questi elementi può essere minimizzato attraverso sezionamento attenta e vigile esame della sezione trasformati prima dell'analisi. In particolare, less-than-ottimali segmentazione di immagini può essere aggirato attraverso più cicli di riclassificazione sulla stessa immagine per ottenere il contrasto più nitido.
La fase più cruciale nel nostro protocollo è passo 4.2 in cui si prevedono le zone cellulari ed extracellulari della sezione tracciando una linea su una determinata fibra, distinguendo quindi una "classe 1" o "classe 2". Ovviamente, questa distinzione manuale è fondamentale perché determina i confini delle fibre muscolari; un errore in questo passaggio influirà negativamente la valutazione delle dimensioni della fibra.
In questo studio, abbiamo sondato sezioni per sola MyHC in una determinata sezione seriale. Tuttavia, alcune fibre, quali le fibre ibride, esprimono due tipi di MyHC, indicativo di sovrapposizione profili metabolici/funzionali (ad es., tipo IIX e tipo IIB). Così, le frazioni di fibra-tipo sommato a un valore &#62; 1 per il soleo e tibiale anteriore (Figura 4A). Fibre ibride possono essere identificati con doppio- o addirittura triple-, etichettatura protocolli come quelli descritti da Lee et al. 7e Bloemberg e Quadrilatero5, rispettivamente. D'importanza, il nostro metodo di analisi può essere applicato a questi protocolli di colorazione più complessi. Un'altra limitazione del nostro protocollo è che non è completamente automatico; Tuttavia, crediamo che questa concessione minore assicura che il nostro metodo non comprometta rigore per motivi di velocità.
Mentre le composizioni MyHC di muscoli anteriori sia soleo e tibiale, osservati in questo studio riflettono i risultati di precedenti studi5,6,7,10,14 , ci sono alcuni contrasti con precedenti studi per quanto riguarda la valutazione del CSA. Ad esempio, le nostre misurazioni di CSA medio sono un po ' più piccoli di quelli segnalati da Bloemberg e Quadrilatero5 e da Allen et al. 15 In particolare, le nostre misurazioni di CSA ha variato da 539.86 ± 24.44 µm2 1319.50 ± 57,472 µm attraverso tipi della fibra mentre loro ha misurato circa 735.7 ± 31,2 µm2 3073.8 ± 51,32µm. Tuttavia, i nostri valori più strettamente si assomigliano a quelli osservati da Augusto et al. 13 e Lucas et al. 6 , che ha riferito CSAs medio che vanno da 436 ± 605 µm2 a 2404 ± 412.5 µm2 e 815 ± 221 µm2 a 1904 ± 570 µm2, rispettivamente. Così, alcuni variabilità nell'analisi morfometrica delle fibre hindlimb del mouse esiste attraverso la letteratura.
Immunohistochemistry presenta un modo efficiente per etichettare e classificare le fibre muscolari in base al loro contenuto MyHC. Quantificazione accurata degli esperimenti di immunoistochimica è essenziale per rendere significative conclusioni sui dati; a tal fine, un metodo che può automatizzare le parti noiose di analisi è una utile, soprattutto quando centinaia o addirittura migliaia di fibre deve essere misurati e classificati. Oltre a fornire misure simili alle osservazioni manuale, il nostro algoritmo fornisce una valutazione accurata di questi dati senza pregiudizi; Questo vantaggio sopra misurazioni manuali assicura rigore scientifico. A questo proposito, la nostra metodologia può essere utile nella caratterizzazione degli effetti delle manipolazioni genetiche e sperimentali che hanno un impatto l'integrità del muscolo. In particolare, immunohistochemistry MyHC accoppiato con il nostro metodo di analisi rapide possono essere impiegati per valutare i cambiamenti morfologici e metabolici nel muscolo dei modelli di malattia come distrofie muscolari, ALS e cancro cachessia. Inoltre, l'efficacia degli interventi che impedire l'atrofia o causare l'ipertrofia può anche essere valutato.

Esso è stato conosciuto per qualche tempo che il muscolo scheletrico è composto da singole fibre di molti tipi1. Inizialmente, due gruppi di fibre sono state caratterizzate in base alle loro proprietà contrattili e denominato, in modo appropriato, slow-twitch (tipo I) e rapide (tipo II). Queste categorie sono stati ulteriormente distinti sulla base del metabolismo della fibra. Da allora tipo I fibre sono ricche di mitocondri e affidamento sul metabolismo ossidativo, essi sono stati chiariti da robustamente positiva nicotinammide adenina dinucleotide-tetrazolio reduttasi (NADH-TR) diaforasi2 o succinato deidrogenasi (SDH)3 la macchiatura. Al contrario, fibre di tipo II hanno esibito minore e gradi variabili di NADH-TR diaforasi o SDH macchiatura e sono stati divisi in due sottogruppi di contrazione rapida (tipo IIA e tipo IIB) un po' rozzamente basato sulle loro capacità ossidativa relativa. Queste distinzioni tra le fibre hanno state visualizzate in modo più efficace di miosina-ATPasi-miosinica dove tipo I fibre macchia scure dopo una pre-incubazione a pH 4.0 e fibre di tipo IIB assorbono precipitato seguenti pre-incubazione a pH 10.0 con le fibre di tipo IIA la macchiatura intermedio4.
Più recentemente, la macchiatura di immunohistochemical delle isoforme della miosina catena pesante (MyHC) è emerso come discriminatore più fine di fibra-tipo5. Tipo I, tipo IIA e tipo IIB fibre possono essere tutti identificati con precisione sulla base del loro profilo MyHC. Inoltre, un altro tipo di contrazione rapida metabolicamente intermedio-fibra, tipo IIX, è stato identificato6. Fibre ibride che esprimono più MyHC inoltre sono stati confermati5,7,8. Alcune specie come il gatto e il babbuino non sono noti a rapidi tipo IIB MyHCs6. Se MyHC immunostaining è attualmente la valutazione dello stato-of-the-art della composizione del muscolo, l'analisi dei dati ottenuti tramite questa tecnica è ingombrante e richiede molto tempo senza assistenza automatizzata. A tal fine, una manciata di metodi semi-automatici per analizzare questi dati sono stati sviluppati5,9,10. Qui, presentiamo un protocollo relativamente standard per l'identificazione immunohistochemical di fibra muscolare-tipo5,7,8,10, insieme a un romanzo semi-automatizzato algoritmo che accelera l'analisi della morfologia del tipo di fibra e fibra con precisione.

<table width="974">
	<colgroup>
		<col style="width:226pt" width="301" />
		<col style="width:140pt" width="187" />
		<col style="width:172pt" width="229" />
		<col style="width:193pt" width="257" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Bovine Serum Albumin</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A9418-100G</td>
			<td class="xl66" style="width:193pt" width="257">5% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="41" style="height:30.75pt">
			<td class="xl65" height="41" style="width:226pt;height:30.75pt" width="301">Hydrophobic Barrier Pap Pen</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Scientific Device Laboratory</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">9804-02</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Microscope Slides</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Globe Scientific</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">1358W</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Coverglass</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">12-544-E</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Immumount</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl68" style="width:172pt" width="229">9990402</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Nail Polish</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">L&#39;Oreal</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="41" style="height:30.75pt">
			<td class="xl65" height="41" style="width:226pt;height:30.75pt" width="301">Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">Discontinued</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">SPOT RT/KE</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">SPOT Imaging Solutions</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">RT940</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Dell Optiplex</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">BA-F8 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monoclonal mouse IgG2b; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">SC-71 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monclonal mouse IgG1; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">BF-F3 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monoclonal mouse IgGM; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">6H1 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monoclonal mouse IgGM; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Alexa Fluor 594 anti-IgG2b</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Invitrogen</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A21145</td>
			<td class="xl66">goat anti-mouse; 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Alexa Fluor 488 anti-IgG1</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Invitrogen</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A21121</td>
			<td class="xl66">goat anti-mouse;1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Alexa Fluor 594 anti-IgGM</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Invitrogen</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A21044</td>
			<td class="xl66">goat anti-mouse;1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">OCT</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Sakura Finetek</td>
			<td class="xl68" style="width:172pt" width="229">4583</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">isopentane</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">O3551-4</td>
			<td class="xl66">cool with liguid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">PBS</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Fisher Bioreagents</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">BP665-1</td>
			<td class="xl66">10X, dilute to 1X</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Kim wipes</td>
			<td class="xl66">Kimberly-Clark</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">06-666A</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated analysis of mouse skeletal muscle morphology and fiber-type composition

Per anni, distinzioni tra tipi di fibre muscolari scheletriche sono state visualizzate meglio macchiando di miosina-atpasi. Più recentemente, la macchiatura di immunohistochemical delle isoforme della miosina catena pesante (MyHC) è emerso come discriminatore più preciso del tipo di fibra. Tipo I, tipo IIA, tipo IIX e fibre di tipo IIB possono ora essere identificati con precisione sulla base del loro profilo MyHC; Tuttavia, l'analisi manuale di questi dati può essere lento e giù-destra noioso. A questo proposito, rapida e accurata valutazione della morfologia e composizione di fibra-tipo è uno strumento molto desiderabile. Qui, presentiamo un protocollo per la macchiatura di immunohistochemical di state-of-the-art di MyHCs nelle sezioni congelate ottenute dal muscolo del hindlimb del mouse in concerto con un algoritmo romanzo semi-automatizzato che accelera l'analisi della morfologia del tipo di fibra e fibra. Come previsto, il muscolo soleo visualizzato macchiatura per tipo I e fibre IIA, ma non per fibre di tipo IIX o tipo IIB. D'altra parte, il muscolo anteriore di tibialis era composto principalmente da fibre di tipo IIX e tipo IIB, una piccola frazione delle fibre di tipo IIA e poco o nessun fibre di tipo I. Varie trasformazioni di immagine sono state utilizzate per generare mappe di probabilità ai fini della misurazione di diversi aspetti della morfologia delle fibre (cioè, area della sezione trasversale (CSA), diametro Feret massima e minima). I valori ottenuti per questi parametri sono stati poi confrontati con valori ottenuti manualmente. Sono state osservate differenze significative tra una delle due modalità di analisi per quanto riguarda il CSA, diametro Feret massima o minima (tutti p &#62; 0,05), che indica la precisione del nostro metodo. Così, il nostro protocollo di analisi immunostaining può essere applicato per l'indagine degli effetti sulla composizione del muscolo in molti modelli di invecchiamento e di miopatia.

Muscoli del hindlimb (cioè, tibiale anteriore, soleo) sezionati da un topo C57BL/6 maschio di età sconosciuta erano flash congelati affondando una muffa di plastica che contiene il muscolo in OCT composto in isopentano raffreddato ad azoto liquido. Quindi, utilizzando un cryotome, erano taglio a-20 ° C e trasferite al vetro caricati positivamente diverse diapositive12sezioni di serie di 8-10 µm.
Abbiamo scelto il tibiale anteriore e soleo perché questi muscoli sono composti principalmente di fibre a contrazione rapida e lenta, rispettivamente13,14. A seguito di immunoistochimica per singolo tipo I, IIA, IIX e IIB MyHCs, campo chiaro e fluorescenti immagini sono state catturate. I pannelli a sinistra della Figura 1 Visualizza sezioni di un immunostained muscolo soleo con il tipo I, IIA, IIX e IIB MyHC specifici anticorpi elencati nella tabella 1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56024/56024fig1.jpg"> 
Figura 1 : La macchiatura di Immunohistochemical di MyHC tipo I, IIA, IIX e IIB nel muscolo soleo mouse. Pannelli a sinistra Visualizza immagini fluorescenti ottenute da sezioni di un muscolo soleo del mouse sondato con gli anticorpi primari diretti di tipo I (BA-F8; A), tipo IIA (SC-71; B), digitare IIX (6h 1; C) e tipo IIB (BF-F3; D) MyHCs. Pannelli di destra Visualizza le sezioni in cui è stato omesso l'anticorpo primario utilizzato nell'esperimento raffigurato nel pannello di sinistra corrispondente. Bar = 100 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56024/56024fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
In particolare, abbiamo osservato notevoli frazioni delle fibre di tipo I (Figura 1A, sinistra) e tipo IIA MyHCs (Figura 1B, sinistra) con una discreta quantità di fibre rimanenti visualizzati da macchiatura positiva per tipo IIX MyHCs (Figura 1C, sinistra). Al contrario, praticamente fibre di tipo IIB non erano evidenti (Figura 1D, sinistra). Queste osservazioni sono coerenti con i rapporti precedenti che muscoli soleo sono composti principalmente di tipo I, tipo IIA e tipo IIX fibre (meno così) con quasi nessun tipo IIB fibre5,10,12. D'importanza, nessuna macchiatura è stata osservata nelle sezioni in cui l'anticorpo primario era stato omesso dal protocollo, dimostrando la specificità degli anticorpi (Figura 1A-D, pannelli di destra).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56024/56024fig2.jpg"> 
Figura 2 : La macchiatura di Immunohistochemical di MyHC tipo IIB, IIX, IIA e io nel muscolo anteriore di tibialis mouse. Pannelli a sinistra Visualizza immagini fluorescenti ottenute da sezioni di un muscolo anteriore di tibialis mouse sondato con gli anticorpi primari diretti di tipo IIB (A), digitare IIX (B), tipo IIA (C) e (D) MyHCs di tipo I. Pannelli di destra Visualizza le sezioni in cui è stato omesso l'anticorpo primario utilizzato nell'esperimento raffigurato nel pannello di sinistra adiacente. Bar = 100 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56024/56024fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Abbiamo anche macchiato tibialis muscoli anteriori con gli anticorpi di cui sopra. Tibialis muscoli anteriori sono stati composti principalmente di fibre di tipo IIB e tipo IIX MyHC-positive (Figura 2A-B, pannelli a sinistra) con i più piccoli contributi da fibre di tipo IIA MyHCs (Figura 2C, sinistra); praticamente nessun fibre esprimendo tipo ho MyHC fossi osservato (Figura 2D, sinistra). I nostri dati che indicano che il mouse tibiale anteriore è composto principalmente di contrazione veloce tipo IIA, tipo IIB e fibre di tipo IIX sono coerente con precedenti studi5,10,13. Ancora una volta, nessuna macchiatura è stata osservata nelle sezioni in cui l'anticorpo primario era stato omesso dal protocollo (Figura 2A-D, pannelli di destra).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56024/56024fig3.jpg"> 
Figura 3 : Fibra computerizzato iterati segmentazione. Campo chiaro l'immagine di una sezione anteriore di tibialis mouse (A). Trasformazione della stessa immagine usando il nostro algoritmo semi-automatizzato (B). Immagine fluorescente della stessa sezione risultati immunostaining del tipo MyHC IIA (C). Immagine di trasformazione Mostra unico tipo MyHC IIA-esprimendo fibre (D). Bar = 100 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56024/56024fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Ai fini dell'analisi morfometrica, campo chiaro immagini dei campi immunostained inoltre sono stati ottenuti. L'esempio mostrato in Figura 3A è da una sezione di muscolo anteriore di tibialis sondata con SC-71 anticorpi diretti verso tipo IIA MyHCs13. Utilizzando il nostro algoritmo originale semi-automatizzato, parecchie trasformazioni di immagine sono state utilizzate per generare mappe di probabilità dalle immagini campo chiaro. Una trasformazione tipica immagine derivata dall'immagine brightfield mostrato in Figura 3A è presentata nella Figura 3B. Utilizzando la trasformazione e la funzione di analisi di poro delle Figi, abbiamo misurato il CSA medio (± 891.4 45.0 µm2), massimo (46,9 ± 1.3 µm) e minimo (26.0 ± 0,8 µm) media Feret diametri di ogni fibra nel campo. Per verificare la fedeltà delle nostre misurazioni, inoltre abbiamo valutato questi parametri nell'immagine brightfield manualmente. Il cattivo CSA (867.0 ± 52,0 µm2), massimo (45,7 ± 3.5 µm) e minimo (25,6 ± 1,9 µm) significa Feret diametri ottenuti utilizzando il metodo di acquisizione manuale più noioso non erano significativamente differenti dal metodo semi-automatico (tutti p &#62; spaiato 0,05, t-test; Tabella 3).
<img alt="Table 3" src alt="Table 3"></img alt="Table 3" src>= "/ files/ftp_upload/56024/56024table3.jpg" / > 
Tabella 3: fibra morfologia e composizione di immunostained muscolo anteriore di tibialis per tipo I, IIA, IIB e IIX MyHCs come determinato da metodi analitici manuali e semiautomatici. Dire fibra CSA, dire Feret diametri e tipo MyHC, in un mouse tibiale anteriore, quantificati tramite valutazione tradizionale manuale contro l'algoritmo presentato. Siete pregati di notare che combinate frazioni superino un valore di 1 per la presenza di fibre che esprimono più tipi MyHC.
Figura 3 C Mostra un'immagine fluorescente della stessa campo immunostained con gli anticorpi diretti verso tipo IIA MyHCs. Fibre marcate positivamente nel campo sono stati selezionati dal numero (Figura 3D) e serve a determinare la frazione delle fibre di tipo IIA MyHC-esprimendo dividendo per il numero totale di fibre nel campo di trasformazione campo chiaro (tabella 3 ). La media CSA, massimo e minimo Feret diametri delle fibre di tipo IIA sono stati poi valutati (tabella 3). La proporzione di tipo I, fibre di tipo IIX e tipo IIB, così come le loro dimensioni, sono stati determinati ripetendo questo protocollo in sezioni seriali immunostained con BA-F8, 6h 1 e BF-F3 anticorpi, rispettivamente6,12(tabella 4 ; Figura 4 A-D).
<img alt="Table 4" src="/files/ftp_upload/56024/56024table4.jpg"> 
Tabella 4: MyHC contenuto e morfologia in mouse soleo e tibiale anteriore. Composizioni di tipo fibra di sezioni rappresentative del soleo e tibiale anteriore. Quantificazione del CSA media, massimi e minimi Feret diametri di tipo I, tipo IIA, tipo IIX e tipo IIB nel soleo e tibiale anteriore sono mostrati. Dati sono riportati come valori medi.
Abbiamo anche valutato questi parametri in un campo ottenuti dal muscolo soleo (tabella 4; Figura 4 A-D). 3.052 e 2.876 singole fibre sono stati contati per il tibiale anteriore e muscoli soleo, rispettivamente. Presi insieme, questi dati dimostrano la fattibilità del nostro metodo in analisi morfometrica e tipo di fibra.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56024/56024fig4.jpg"> 
Figura 4 : Dati di analisi morfometrica riepilogo. Composizioni di fibra-tipo di sezioni rappresentative del tibiale anteriore e muscoli soleo (A). Quantificazione della media CSA, assicurando e massima Feret diametri di tipo I, tipo IIA, tipo IIX e tipo IIB fivers in entrambe le anteriort tibialis e soleo sono mostrati in (B-D). I dati sono dati come dire valori. differenze significative tra il tibiale anteriore e soleo sono indicati (* denota p &#60; 0,05: * * denota p &#60; 0,01; * * * denota p &#60; 0,005; t-test). 3.052 e 2.876 singole fibre sono stati contati per il tibiale anteriore e muscoli soleo, rispettivamente. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56024/56024fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplemental File" src="/files/ftp_upload/56024/56024supfile.jpg"> 
File supplementare: macro di quantificazione di fibra. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56024/Tyagi_etal_fiber_quantification_macro" target="_blank">Per favore clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

La macchiatura di Immunohistochemical delle isoforme della catena pesante della miosina è emerso come il discriminatore di state-of-the-art di fibra del muscolo scheletrico-tipo (cioè, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Qui, presentiamo un protocollo di colorazione insieme a un algoritmo romanzo semi-automatico che facilita la rapida valutazione della morfologia del tipo di fibra e fibra.

Analisi semi-automatica del Mouse del muscolo scheletrico morfologia e composizione di fibra-tipo

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

semi-automated-analysis-mouse-skeletal-muscle-morphology-fiber-type

Nanyang Technological University

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Medicine

10.3K Views.  University of Colorado School of Medicine. La macchiatura di Immunohistochemical delle isoforme della catena pesante della miosina è emerso come il discriminatore di state-of-the-art di fibra del muscolo scheletrico-tipo (cioè, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Qui, presentiamo un protocollo di colorazione insieme a un algoritmo romanzo semi-automatico che facilita la rapida valutazione della morfologia del tipo di fibra e fibra.

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Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

Myo-meccanico Analisi dei isolata del muscolo scheletrico

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

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Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably adaptable to environmental factors1 such as hypertrophy by resistance exercise and atrophy by disuse. It thereby exhibits remodeling and adaptations to stressors (heat, ischemia, heavy metals, etc.)2,3. Damage can occur to muscle by a muscle exerting force while lengthening, the so-called eccentric contraction4. The contractile proteins can be damaged in such exertions and need to be repaired, degraded and/or resynthesized; these functions are not part of the contractile proteins, but of other much less abundant proteins in the cell. To determine what subset of proteins is involved in the amelioration of this type of damage, a global proteome must be established prior to exercise5 and then followed subsequent to the exercise to determine the differential protein expression and thereby highlight candidate proteins in the adaptations to damage and its repair. Furthermore, most studies of skeletal muscle have been conducted on the male of the species and hence may not be representative of female muscle. 
In this article we present a method for extracting proteins reproducibly from male and female muscles, and separating them by two-dimensional gel electrophoresis followed by high resolution digital imaging6. This provides a protocol for spots (and subsequently identified proteins) that show a statistically significant (p &lt; 0.05) two-fold increase or decrease, appear or disappear from the control state. These are then excised, digested with trypsin and separated by high-pressure liquid chromatography coupled to a mass spectrometer (LC/MS) for protein identification (LC/MS/MS)5. This methodology (Figure 1) can be used on many tissues with little to no modification (liver, brain, heart etc.).

A straight-forward set of methods to isolate and determine the identity of the most abundant proteins expressed in skeletal muscle. About 800 spots are discerned on a two-dimensional gel from 10 mg muscle; this allows for the determination of gender-specific protein expression. These methods will give equivalent results in most tissues.

Sesso Dimorfismo muscolo scheletrico da Proteomica

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

Assessment of Right Ventricular Structure and Function in Mouse Model of Pulmonary Artery Constriction by Transthoracic Echocardiography

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, the RV is significantly affected in pulmonary diseases such as pulmonary artery hypertension (PAH). In addition, the RV is remarkably sensitive to cardiac pathologies, including left ventricular (LV) dysfunction, valvular disease or RV infarction4. To understand the role of RV in the pathogenesis of cardiac diseases, a reliable and noninvasive method to access the RV structurally and functionally is essential.
A noninvasive trans-thoracic echocardiography (TTE) based methodology was established and validated for monitoring dynamic changes in RV structure and function in adult mice. To impose RV stress, we employed a surgical model of pulmonary artery constriction (PAC) and measured the RV response over a 7-day period using a high-frequency ultrasound microimaging system. Sham operated mice were used as controls. Images were acquired in lightly anesthetized mice at baseline (before surgery), day 0 (immediately post-surgery), day 3, and day 7 (post-surgery). Data was analyzed offline using software.
Several acoustic windows (B, M, and Color Doppler modes), which can be consistently obtained in mice, allowed for reliable and reproducible measurement of RV structure (including RV wall thickness, end-diastolic&#160;and end-systolic dimensions), and function (fractional area change, fractional shortening, PA peak velocity, and peak pressure gradient) in normal mice and following PAC.
Using this method, the pressure-gradient resulting from PAC was accurately measured in real-time using Color Doppler mode and was comparable to direct pressure measurements performed with a Millar high-fidelity microtip catheter. Taken together, these data demonstrate that RV measurements obtained from various complimentary views using echocardiography are reliable, reproducible and can provide insights regarding RV structure and function. This method will enable a better understanding of the role of RV cardiac dysfunction.

Right ventricle (RV) dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease, yet limited methodologies are available for its evaluation. Recent advances in ultrasound imaging provide a noninvasive and accurate option for longitudinal RV study. Herein, we detail a step-by-step echocardiographic method using a murine model of RV pressure overload.

Valutazione del ventricolo destro Struttura e funzione in modello murino di polmonare Arteria Costrizione da ecocardiografia transtoracica

Emerging clinical data support the notion that RV dysfunction is critical to the pathogenesis of cardiovascular disease and heart failure1-3. Moreover, ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

Scheletrici Procedure biopsia muscolare dell&#39;uomo con la tecnica Bergström Modificato

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Quantitative Magnetic Resonance Imaging of Skeletal Muscle Disease

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of living systems. Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using qMRI methods. The MRI acquisition protocol begins with localizer images (used to locate the position of the body and tissue of interest within the MRI system), quality control measurements of relevant magnetic field distributions, and structural imaging for general anatomical characterization. The qMRI portion of the protocol includes measurements of the longitudinal and transverse relaxation time constants (T1 and T2, respectively). Also acquired are diffusion-tensor MRI data, in which water diffusivity is measured and used to infer pathological processes such as edema. Quantitative magnetization transfer imaging is used to characterize the relative tissue content of macromolecular and free water protons. Lastly, fat-water MRI methods are used to characterize fibro-adipose tissue replacement of muscle. In addition to describing the data acquisition and analysis procedures, this paper also discusses the potential problems associated with these methods, the analysis and interpretation of the data, MRI safety, and strategies for artifact reduction and protocol optimization.

Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using non-invasive magnetic resonance imaging methods.

Quantitative Magnetic Resonance Imaging di malattia muscolare scheletrico

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

Umano<em&gt; vasto laterale</em&gt; Biopsia muscolare scheletrico Utilizzando la Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Induction and Assessment of Exertional Skeletal Muscle Damage in Humans

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery in humans. Herein we discuss the design of an eccentric exercise protocol to induce damage in the quadriceps muscles, marked by changes in strength, soreness, and plasma creatine kinase levels. This method is simple, ethical, and widely applicable since it is performed in human participants and eliminates the interspecies translation of the results. Subjects perform 300 maximal eccentric contractions of the knee extensor muscles at a speed of 120&#176;/sec on an isokinetic dynamometer. The extent of the damage is measurable using relatively non-invasive isokinetic and isometric measures of strength loss, soreness, and plasma creatine kinase levels over several days following the exercise. Therefore, its application can be directed to specific populations in an attempt to identify mechanisms for muscle adaptation and regeneration.

This article describes a safe and reliable method to induce and quantify exertional skeletal muscle damage in human subjects.

Induzione e valutazione di Exertional scheletrico danno muscolare negli esseri umani

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery ...

Echocardiographic and Histological Examination of Cardiac Morphology in the Mouse

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed in mice is high. Phenotypic characterization of these mouse models also requires the examination of cardiac function and morphology. Echocardiography and magnetic resonance imaging (MRI) are commonly used approaches to characterize cardiac function and morphology in mice. Echocardiographic and MRI equipment specialized for use in small rodents is&#160;expensive and requires a dedicated space. This protocol describes cardiac measurements in mice using a clinical echocardiographic system with a 15 MHz human vascular probe. Measurements are performed on anesthetized adult mice. At least three image sequences are recorded and analyzed for each animal in M-mode in the parasternal short-axis view. Afterwards, cardiac histological examination is performed, and cardiomyocyte diameters are determined on hematoxylin-eosin- or wheat germ agglutinin (WGA)-stained paraffin sections. Vessel density is determined morphometrically after Pecam-1 immunostaining. The protocol has been applied successfully to pharmacological studies and different genetic animal models under baseline conditions, as well as after experimental myocardial infarction by the permanent ligation of the left anterior descending coronary artery (LAD). In our experience, echocardiographic investigation is limited to anesthetized animals and is feasible in adult mice weighing at least 25 g.

Echocardiographic examination is frequently used in mice. Expensive high-resolution ultrasound devices have been developed for this purpose. This protocol describes an affordable echocardiographic procedure combined with histological morphometric analyses to determine cardiac morphology.

Esame ecocardiografico ed istologico della morfologia cardiaca nel topo

An increasing number of genetically modified mouse models has become available in recent years. Moreover, the number of pharmacological studies performed ...

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate utilization, and behaviors such as food intake and physical activity can provide important information regarding the underlying mechanisms of disease. Given the importance of body composition and metabolism to the development of obesity and its subsequent sequelae, it is necessary to make accurate measures of these parameters in the pre-clinical research setting. Advances in technology over the past few decades have made it possible to derive these measures in rodent models in a non-invasive and longitudinal fashion. Consequently, these metabolic measures have proven useful when assessing the response of genetic manipulations (for example knockout or transgenic mice, viral knock-down or overexpression of genes), experimental drug/compound screening and dietary, behavioral or physical activity interventions. Herein, we describe the protocols used to measure body composition and metabolic parameters using an animal monitoring system in chow-fed and high fat diet-fed mice.

This protocol describes the use of a body composition analyzer and metabolic animal monitoring system to characterize body composition and metabolic parameters in mice. An obesity model induced by high-fat feeding is used as an example for the application of these techniques.

Analisi metabolica ingabbiamento in topi alta Fed grasso e della composizione corporea

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel interventions have remained elusive. This is likely due, in part, to a reliance on preclinical prevention models investigating the effects of genetic manipulations or pharmacological treatments on atherosclerosis development rather than the established disease. Also, results of these studies are often confounding because of the use of superficial lesion analyses and a lack of characterization of lesion cell populations. To help overcome these translational hurdles, we propose an increased reliance on intervention models that employ investigation of changes in cellular composition at a single cell level by immunofluorescent staining and confocal microscopy. To this end, we describe a protocol for testing a putative therapeutic agent in a murine intervention model including a systematic approach for animal dissection, embedding, sectioning, staining, and quantification of brachiocephalic artery lesions. In addition, due to the phenotypic diversity of cells within late-stage atherosclerotic lesions, we describe the importance of using cell-specific, inducible lineage tracing mouse systems and how this can be leveraged for unbiased characterization of atherosclerotic lesion cell populations. Together, these strategies may assist vascular biologists to more accurately model therapeutic interventions and analyze atherosclerotic disease and will hopefully translate into a higher rate of success in clinical trials.

We propose a standardized protocol to characterize the cellular composition of late-stage murine atherosclerotic lesions including systematic methods of animal dissection, tissue embedding, sectioning, staining, and analysis of brachiocephalic arteries from atheroprone smooth muscle cell lineage tracing mice.

Analisi quantitativa della composizione cellulare nelle lesioni aterosclerotiche avanzate del muscolo liscio delle cellule Lineage-Tracing topi

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...