We thank Drs. Alison Heffer and Yong Lu for setting up the microinjection apparatus and sharing their invaluable knowledge and experience with insect RNAi. This work was supported by the National Institutes of Health (R01GM113230 to L.P.).

The authors have nothing to disclose.

洗練されたモデル系（マウス、ハエ、ワーム）の数が少ないが、20 世紀中に開発されたが、21世紀には、世界中の研究室で開発中の新しい動物系の波を見ています。これらの新しいシステムは、科学者が唯一の「標準」モデル系を用いて探索することができません比較、進化の質問に対応することができます。新モデルのこの展開は、迅速な実験室培養方法の開発、遺伝子同定、および新種で機能的なアプローチが必要です。ここでは、実験室および胚のRNAi、親のRNAi、およびこの甲虫における表現型解析のためのステップバイステップのプロトコルでD. maculatusを飼育するための手順が提示されました。目標は、これらの記述は、独自の実験でD. maculatusを使用すると、追加の新モデル種を開発するためにここに提示アプローチの使用を作るために他の人を励ますことです。 D. maculatusのリットルながら、ABのコロニーが維持するために非常に簡単です、この種の飼育の一つの制限は、食品の彼らのソースとしてカブトムシに与えられたウエットキャットフードの不快臭です。これを避けるために、このようなホエー/大豆プロテインパウダー、チーズ、地上ドッグフード、および粉ミルクなどの代替食品は、湿度を変化させるために湿った綿の有無にかかわらず試験しました。接地ドッグフードは、最も効果的な代替であり、定期的なコロニー供給するために使用することができます。サバイバルは湿った綿の有無にかかわらず、相対湿度80％でちょうどドライドッグフードで飼育ケージ内で卵から大人まで（&gt; 90％）優れた添加しました。卵を大量に収集するときしかし、生殖能力を高めるために卵を収集する際に、ウェットキャットフードと、このダイエットを補充する必要があるかもしれません。ドッグフードを使用する場合は調整さドッグフードは54産卵を阻害することが見出されたように、古い食品は、定期的に除去されるべきです。 71避難所としてドッグフードキブル（KR、予備的な結果）、コルク、木材、紙、および他の材料を使用することもできます。興味深いことに、ゴミムシダマシの甲虫の幼虫を使用して、発泡スチロールの生分解は、72を報告されています。したがって、これは、D. maculatus幼虫について試験しました。ヤングD. maculatus幼虫のみ発泡スチロールやアスベスト含有物質と濡れた綿と成人期まで生存した（データは示されていない）が、彼らは食べて、これらの材料を消化するかどうか決定されていません。 このレポートでは、D. maculatusにおける機能的遺伝学的研究を実施するための第1の詳細なプロトコルです。 RNAiの使用は、ここに新しいモデルシステムにこの技術の拡張を表します。いくつかの具体的な観察はD. maculatusおよびその他の非モデル種におけるRNAiノックダウン実験に関して注目に値します。まず、RNAiはD. maculatusのに有効であることを保証するために、ここで使用されるD. maculatusの同じ菌株を使用すべきです。証拠は、異なる株がのRNAi Pの変化を示すことがコクヌストモドキからありますhenotypes 24,73、および変異体の表現型は、多くの場合、モデル種74-76の遺伝的背景に依存性を示します。また、in situハイブリダイゼーションを含む他のプロトコル、のひずみ依存性のための事例証拠があります。第二に、注射の適切なタイミングはD. maculatusで成功したRNAiのために重要です。キューティクルが完全に硬化したした後にやや反し、segmacoriaは、最も簡単に、少なくとも2日羽化後、貫通しています。したがって、4処女雌 - 8日羽化後には使用すべきです。古い女性が新たにeclosed女性より低い繁殖力を体験するため、注入には適していません。第三に、dsRNAは女性の腹部の内部の圧力によって押し出されるかもしれ注入。注射後のdsRNAの大量を失う可能性を最小限に抑えるには、（6.2.8）を注射後〜5秒間腹部に針を保持し、その後、ゆっくりとそれを削除。一方、中またはまもなく女性の腹部を押す避けます注射後。この問題によって発生偏った結果を回避するために、表現型分析のために（毎日〜200胚）十分な子孫を得るために、各dsRNAのために少なくとも8人の女性を注入。第四に、高い卵の収量は、注射後に表現型分析のために、公正なデータを提供するために重要です。平均して、各D. maculatusの女性は、毎日約35-55胚を生成します。卵の収量は、集団の大きさ、女性の年齢、湿度、食品の可用性、温度（データは示していない）、および他の環境要因54に依存します。通常、女性が25℃よりも30℃以上を置きます。第五に、未孵化胚を孵化した幼虫によりcannibalizedすることができます。未孵化胚は通常、より深刻な影響を受けている間孵化した幼虫としては、通常、野生型のようなまたは唯一の軽度の影響を受けている、D. maculatusの幼虫のこの習慣は、定量的な表現型解析で偏った結果を引き起こす可能性があります。そのため、可能な限り早期に孵化した幼虫の除去を強くお勧めします。 私たちの研究室では、この種を含む生理、生態、そして大きな関心の害虫駆除・アールの多くの側面が、D. maculatusセグメンテーションに焦点を当てています。胚発生およびセグメンテーションを研究するため、D. maculatusの幼虫の背側に暗く着色された一連のストライプは、異常な開発のための自然なマーカーとして役立つことができます。また、幼虫の着色されたストライプに根ざし特性剛毛セグメントの指標として用いることができます。これらの形態学的特徴は、一緒に軽度または中等度に影響を受けた胚は孵化に生き残ることができる知見と、基本的なボディープランをパターニングに関与するメカニズムを研究するためのD. maculatusモデルの利点です。 最後に、高度に制御された実験-含む負の制御などのGFPのdsRNAなどを実施し、それぞれのための2つの非重複標的領域をテストすることの重要性に起因effecに誤解を避けるために重要な遺伝子は、ありますそれ自体は注射のTSおよびオフターゲット効果。 D. maculatusの場合は、4から6μgの（/μlの2または3μgの2μlの）dsRNAは、各女性に注入し、dsRNAは、200〜250 bpの長さでした。金額やプロトコルの他の詳細は、開発中または異なる生理学的/代謝プロセスの後半で機能する遺伝子を標的場合、最適化する必要があるかもしれません。以前の発見は、CのF1世代は15 エレガンス超えRNAi効果を次の世代に渡すことができることを示しました。 RNAiによるセグメンテーション欠陥の斜線のD. maculatusの幼虫の少数派は、成人期まで生き残ることができると再生することができます。予備実験は、F2世代の明らかな欠陥を明らかにすることができませんでした。今後の研究は、この種におけるRNAiの世代間の影響を明らかにすることができます。

1998年には、火とメロは、二本鎖RNA（dsRNA）が線虫（Caenorhabditis elegans）1における遺伝子機能の抑制を誘導することができることを報告しました。該dsRNAによって誘発この応答は、RNA干渉（RNAi）と命名し、そしてそのようなRNAiを介した遺伝子サイレンシングは、動物、植物、および真菌2-7に保存されることが報告されました。植物や一部の動物において、RNAi機能は、全身、意味の効果が（8月10日に概説）のdsRNAが直接導入されていない他の細胞/組織に広がることができます。科学者たちは、それによって直接（11月14日に見直さ）ゲノムを操作することなく、遺伝子機能をノックダウン、目的の遺伝子を標的とするためのdsRNAを設計することにより、この内因性細胞RNAi応答を利用してきました。 RNAiは、次のような利点のために機能的研究のための強力なツールです。まず、偶数最小限の遺伝子配列情報を用いて、遺伝子は、RNAiを使用して標的化することができます。これは、STのために特に重要ですゲノムやトランスクリプトームデータを欠く非モデル生物のudies。第二に、RNAi応答がロバスト全身である生物で、RNAiを介した遺伝子ノックダウンは、ほぼすべての発達段階で行うことができます。この機能は、多面的な遺伝子の機能を研究するために非常に有用です。第三に、いくつかの場合には、RNAi効果を表現型子孫15,16において観察されるように、生殖腺および子孫に広がります。単一注入親によって生成多数の子孫は、卵を直接操作することなく検査することができるように、親のRNAi（pRNAi）として知られるこの現象は、胚発生に影響を与える遺伝子について特に有利です。これらの理由から、pRNAiを選択する方法です。 pRNAiが無効である場合は、卵形成のために必要な遺伝子のために、たとえば、その後、胚のRNAi（eRNAi）を使用する必要があります。 dsRNAの量は強い欠陥に弱い生成する範囲にわたって変化させることができる送達という点で第四に、RNAiは、対立遺伝子シリーズの等価物を生成するために使用することができます。表現型のようなグラデーションは、遺伝子は致命的である複雑なプロセスおよび/または機能の完全な喪失に関与しているときに遺伝子機能を理解するのに役立つことができます。第五に、dsRNAの配信は、特に堅牢な全身のRNAi応答を示す動物では、一般的に簡単で、実現可能です。 dsRNAは、マイクロインジェクション1,5、摂食/摂取17,18、浸漬、19,20およびウイルス/細菌媒介送達21,22によって導入することができます。第六に、いくつかの遺伝子ターゲティング/編集方法とは異なり、変異を有する生物をスクリーニングするまたはRNAiを用いた場合にホモ接合体を生成するための遺伝的交雑を行う必要はありません。したがって、遺伝子機能を研究するための多くの他の技術と比較して、RNAiは、速く、安価であり、かつ大規模なスクリーニング23-25に適用することができます。 RNAiの広範なユーティリティがbeyon研究のために利用可能な種の範囲を拡大し、生物の広い範囲で機能的研究を遂行するための手段を提供します遺伝的ツールが開発されているために、従来のモデルシステムをdは。例えば、非モデル系を用いた研究は、異なる開発モードを表すか、別個の形態学的特徴26〜29を示す種由来のオルソログの機能を比較することにより、遺伝子および遺伝子ネットワークの進化への洞察を得るために必要とされます。研究のこれらのタイプは、印加されたと基本の両方の研究のための影響で、生物多様性のより良い理解を提供します。 地球上で最大の動物群である、昆虫は多様性のメカニズムを探求する絶好の機会を提供します。また、昆虫は、一般的に小さく、短いライフサイクル、高い繁殖力を持っている、と研究室の後部に簡単です。過去20年間において、RNAiが正常に双翅目（真のハエ）5を含む、注文にまたがる昆虫で適用されてきた、鱗翅目（蝶や蛾）30、鞘翅目（甲虫）16,31、膜翅目（sawf嘘、ハチ、アリやハチ）32、半翅目（真のバグ）、等翅目（シロアリ）34、Blattodea（ゴキブリ）35、直翅目（コオロギ、バッタ、イナゴ、とキリギリス）36と、シラミ目（シラミ）37。 RNAiの成功のアプリケーションは、エクジソンが42シグナル伝達、初期胚発生におけるパターン形成の研究のための機能データ（前後軸32、背腹軸28、セグメンテーション26,38）、性別決意39,40、キチン/キューティクルの生合成41を提供してきました社会的行動43、およびより多くの。彼らは（44-46に概説）害虫防除のために有用である可能性があるという点で異なる昆虫種のために開発されたRNAi法は、付加的な有益であり得ます。 RNAi効果は、非保存領域を標的とするために選択されている限り、遺伝子特異的なだけでなく、種特異的であろう。の生存に不可欠な遺伝子を標的ミツバチやカイコなどの有益な昆虫種については、感染を制御するためのウイルスまたは寄生虫は、これらの種47,48を保護するための新規な戦略を提供することができます。 Dermestes maculatus（D. maculatus）、一般名の非表示カブトムシは、南極大陸を除く世界的に分布しています。完全変態の昆虫としては、D. maculatusのライフサイクルは、胚、幼虫、さなぎ、および成体期（ 図1）が含まれています。それは肉を餌にするので、D. maculatusは死んだ動物を骸骨にするために美術館に使用され、法医学昆虫学者は、死亡49,50の時間を推定するためにそれを使用することができます。 D. maculatusは死体、乾燥肉、チーズ、および他の昆虫の蛹/繭などの動物性食品に供給し、このように家計へのダメージ、保存された食品、シルク、チーズ、肉産業51,52の原因となります。この甲虫でRNAiを適用すると、その経済的影響を最小化するための効率的かつ環境に優しい方法を提供することができます。私たちの研究室では、新しいメートルとしてD. maculatusを使用していますセグメンテーション53を研究するodel昆虫。それはそれの有用な種は短期および長期の生殖発達の間の移行を検討すること、中間胚の開発者であるとして、実験室飼育の影響を受けやすいことに加えて、D. maculatusは、基礎研究のために重要です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig1.jpg" /> 図1：D. maculatusのライフサイクル。示されているように異なるライフステージでのD. maculatusの写真、。卵から大人までのライフサイクルは、より低い温度でより長い30℃で3週間かかりますが。 （A、F）産まれたての胚は、長さ約1.5ミリメートル、淡黄色の楕円形に白です。胚は〜30℃で55時間かかります。 （B、C、およびG）幼虫が暗く着色されたストライプを有しており、毛で覆われています。幼虫は、環境に応じて、いくつかの齢を通過し、その長さは1オーバーセンチにまで拡張することができます。 （D、H） </strオング&gt;ヤング蛹は淡黄色です。 30℃で7日間 - 蛹化は〜5かかります。 （E、I）間もなく羽化後、暗い色素沈着は、大人のカブトムシの体の上に表示されます。大人数ヶ月まで生きることができ、一人の女性が生涯にわたって胚の数百人を置くことができます。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 以前、我々は、RNAiは、D. maculatus 53における遺伝子機能のノックダウンに有効であることが示されました。ここでは実験室でD. maculatusコロニーを飼育経験は、胚と親の両方のRNAiセットアップ、注射、注射後のケア、および表現型解析のためのステップバイステップのプロトコルと一緒に共有されています。 D. maculatusで質問に対処するための詳細な情報を提供するだけでなく、foの潜在的な重要性を持っているだけでなく、ここで紹介したdsRNA媒介遺伝子ノックダウンと分析方法rの他の非モデル甲虫/昆虫種でRNAiを適用します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dermestes maculatus live beetles</td>
			<td style="width:140px;">Our lab or Carolina Biological Supply</td>
			<td style="width:119px;">#144168</td>
			<td style="width:167px;">Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wet cat food</td>
			<td style="width:140px;">Fancy Feast</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry dog food</td>
			<td style="width:140px;">Purina Puppy Chow</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Can buy at most pet food and grocery stores</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Insect cage (size medium, 30.5x19x20.3 cm)</td>
			<td style="width:140px;">Exo Terra</td>
			<td>PT2260</td>
			<td>For colony maintenance. Can use larger cage if needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Insect cage (size mini, 17.8x10.2x12.7 cm)</td>
			<td style="width:140px;">Exo Terra</td>
			<td>PT2250</td>
			<td>For embryo collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:140px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89038-968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cotton ball</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">22-456-883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Megascript T7 transcription kit</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td>For 40 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pneumatic pump</td>
			<td style="width:140px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">PV830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Capillary holder</td>
			<td style="width:140px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:140px;">NARISHIGE</td>
			<td style="width:119px;">MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Black filter paper (90 mm)</td>
			<td style="width:140px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">28342-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Food coloring (green)</td>
			<td>McCormick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Borosilicate glass capillary</td>
			<td style="width:140px;">Hilgenberg</td>
			<td style="width:119px;">1406119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Needle puller (micropipette puller)</td>
			<td style="width:140px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope glass slide</td>
			<td>WorldWide Life Sciences Division</td>
			<td style="width:119px;">41351157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sealing film (Parafilm M)</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Model 801 Syringe (10 &#181;l )</td>
			<td style="width:140px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7642-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle (32-gauge)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7762-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fixation Solution (Pampel&#39;s)</td>
			<td>BioQuip Products, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1184C</td>
			<td>Toxic, needs to be handled in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forcep (DUMONT #5)</td>
			<td style="width:140px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cover slip (24X50 mm, No. 1.5)</td>
			<td style="width:140px;">Globe Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1415-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting microscopy for embryo injection</td>
			<td style="width:140px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization</td>
			<td style="width:140px;">Zeiss</td>
			<td colspan="2">SteREO Discover. V12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DIC microscopy</td>
			<td style="width:140px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">AXIO Imager. M1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rearing and double-stranded rna-mediated gene knockdown in the hide beetle, dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

著者らの研究室は、昆虫53,55内のセグメンテーションを制御する遺伝子の機能進化を研究するためにRNAi技術を使用しています。すべての昆虫がセグメント化されているが、このプロセスを制御する遺伝子は、昆虫の放射線26,38,56-63中に発散したと思われます。 ショウジョウバエにおける遺伝子スクリーニングは、身体セグメント64-70の形成を促進するための責任を負う9対ルールセグメント遺伝子のセットを同定しました。ここでは、これらの遺伝子のいずれかのオルソログ、 対になった （PRD）は 、D. maculatusにおける遺伝子機能を研究するためのRNAiの有用性を文書化するために使用されます。 この種では、セグメントの形成にPRD - eRNAiとpRNAiは、各DMACのための役割を実証するのに有効でした。 PRD（ 図8B、8Dと8F - 2 - DMACを標的とするように設計されたdsRNAの3μgの/μlの</stronG&gt;）（ 図8A、8Cおよび8E）陰性対照として注入し、GFPのdsRNAと比較しました。 制御子孫は、セグメントごとに1着色されたストライプハッチ。隣接する色素性ストライプは、非着色ギャップ（ 図8A）によって分離しました。 PRD pRNAi後、影響を受けた子孫は、分節境界が（ 図8B）が不良であった示し、溶融近隣の着色されたストライプハッチ。表現型の重症度に応じて、1つまたはいくつかの融合体は、影響を受ける幼虫で検出されました。それにもかかわらず、融合体は、一貫して対ルールのような欠陥を示す、T2 / T3間の境界領域、A1 / A2、A3 / A4、A5 / A6、A7 / A8に現れました。 PRDノックダウン後のキューティクルの表現型は腹部のセグメントの損失だけでなく、短くボディ長（ 図8D）を示しました。エングレイルド（JA）抗体染色は早期の分子欠陥を調べるために行きましたPRDノックダウン後の胚。制御胚を示したが、すべてのセグメント（ 図8E）で同等の強度で表現備わりストライプ表現備わり減少は、DMAC-PRDのdsRNAから子孫に交互にストライプ状に検出された雌（ 図8Fにアスタリスク）を注入しました。減少エン発現のパターンは、影響を受ける孵化した幼虫で観察された欠陥のクチクラパターンと一致しています。 D. maculatusにおけるPRDノックダウン後の表現型のより詳細な結果を得るために、翔らを参照してください。 2015年53。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig3.jpg" /> 図3：噴射装置。 D. maculatus胚を注入するために使用される解剖顕微鏡およびマイクロマニピュレータの写真が示されています。窒素供給は、空気ポンプの圧力入力ポートに接続されています。ガラス毛細管ホルダーはejecに接続されています。ポンプのトンの圧力ポート。フットスイッチは、ポンプに接続されています。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig4.jpg" /> 図4：D. maculatus胚のRNAiのためのフローチャート。 （AD）注射用の胚を収集します。女性はコットンボールで胚（オレンジ）（灰色の円）を置きます。別々のコットンボールから胚およびそれらが黒い画用紙の一片の上にドロップしてみましょう。白いバーは、コットンボールで涙を示します。黒い紙を敷いた収集ペトリ皿の蓋に胚を移します。胚へのdsRNAを注入する（E、F）。ダブルスティックテープでスライド上の胚を合わせ、解剖顕微鏡下で個別に注入します。緑色食品色素を有する針を示します。 （GJ）注入後の回復とincubエーション。湿度を提供するために、ペトリ皿に湿ったコットンボールを置きます。ペトリ皿を覆い、フィルム（水色）をシールでそれをラップします。インキュベーター中でペトリ皿を置き、表現型分析のために孵化した幼虫を削除します。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig5.jpg" /> 図5：悪い胚インジェクションの例の対良いです。 （A）非注入胚。 （B）が少なすぎるのdsRNAを注入した胚。 （C）dsRNAの適切な量を注入胚。 （D）のdsRNA過剰注入による溢れるブロークン胚。食品着色料は、可視化のためのdsRNAに追加されました。注射用の針として使用されるプル毛細管の（E）例。テーパー先端の長さfは注意してくださいまたは機能針の2つの例を示します。 ADのスケールバーは200μmで表します。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig6.jpg" /> 図6：成人男女と蛹。 （A）オス蛹の腹ビュー。 （A &#39;）A.（A &quot;）のオス蛹の生殖器のイラストの後部の倍率。（B）メス蛹の腹ビュー。（B&#39;）B.雌蛹の後部の倍率が2性器乳頭を持っている（白女性の蛹の生殖器の矢印）。（B &quot;）イラスト。 （C）成人男性の腹ビュー。 （C &#39;）Cの後方部分の拡大図は、成人男性はトライデントのようなされていることを性器と注意します4 回目の腹板上に円形のローブ状の構造（白と黒矢印、それぞれ）。 （D）雌成虫の腹ビュー。 （D &#39;）すべてのパネルについてはD.の後方部分の拡大図は、スケールバーは1ミリメートルを示しています。詳細については、翔らを参照してください。 2015年53。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig7.jpg" /> 図7：射出時の女性。女性は麻酔し、腹側を上に配置されます。 dsRNAを注入する第二と第三sternites間segmacoriaを貫通する針が示されています。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図8：DMAC-PRD pRNAi後の代表的表現型。 （A）コントロール注入。 3胸部セグメントと10腹節で孵化し、野生型のようなGFP pRNAiの子孫の側面図。各セグメントは、剛毛と色素性ストライプを持っています。 （B）の斜線PRD pRNAiの子孫の側面図。ラベルされた隣り合う着色されたストライプ間の隙間が狭くなったり、完全に欠落しています。 （C）未孵化コントロール野生型のような胚のキューティクル表現型。 （D）より少ない腹部のセグメントを持つ未孵化PRD pRNAiの子孫のキューティクル表現型。 （E、F）から胚帯を切開した：（E）コントロール、GFP pRNAiが均等にすべてのセグメントにエンを表明している、（F）PRD pRNAi、エン式は、代替セグメント（アスタリスク）に還元されます。すべてのウィンドウのためのLS、スケールバーは500μmで示しています。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

ここでは、研究室で（D. maculatus）Dermestes maculatus、中間胚芽カブトムシを飼育するためのプロトコルを提示します。我々はまた、この種における遺伝子機能を研究するために胚の表現型を解析するための胚および親のRNAiのためのプロトコルとメソッドを共有しています。

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

10.5K ビュー.  University of Maryland. ここでは、研究室で（D. maculatus）Dermestes maculatus、中間胚芽カブトムシを飼育するためのプロトコルを提示します。我々はまた、この種における遺伝子機能を研究するために胚の表現型を解析するための胚および親のRNAiのためのプロトコルとメソッドを共有しています。 

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Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

遺伝学

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation of gene functions. Their therapeutic potential in the heart can also be determined. There are limited approaches for in vivo molecular intervention in the mouse heart. Recombinant adeno-associated virus (rAAV)-based genome engineering has been utilized as an essential tool for in vivo cardiac gene manipulation. The specific advantages of this technology include high efficiency, high specificity, low genomic integration rate, minimal immunogenicity, and minimal pathogenicity. Here, a detailed procedure to construct, package, and purify the rAAV9 vectors is described. Subcutaneous injection of rAAV9 into neonatal pups results in robust expression or efficient knockdown of the gene(s) of interest in the mouse heart, but not in the liver and other tissues. Using the cardiac-specific TnnT2 promoter, high expression of GFP gene in the heart was obtained. Additionally, target mRNA was inhibited in the heart when a rAAV9-U6-shRNA was utilized. Working knowledge of rAAV9 technology may be useful for cardiovascular investigations.

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

マウスハーツでの遺伝子を過剰発現またはノックダウンするrAAV9の調製

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

2つの相補的細胞同期プロトコルによる細胞周期制御遺伝子発現の研究

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands for the recognition of RNA sequence and structure. Chemically modified Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers have been recently developed that can recognize RNA duplexes in a sequence-specific manner. PNAs are chemically stable with a neutral peptide-like backbone. PNAs can be synthesized relatively easily by the manual Boc-chemistry solid-phase peptide synthesis method. PNAs are purified by reverse-phase HPLC, followed by molecular weight characterization by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF). Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) technique facilitates the imaging of the triplex formation, because carefully designed free RNA duplex constructs and PNA bound triplexes often show different migration rates. Non-denaturing PAGE with ethidium bromide post staining is often an easy and informative technique for characterizing the binding affinities and specificities of PNA oligomers. Typically, multiple RNA hairpins or duplexes with single base pair mutations can be used to characterize PNA binding properties, such as binding affinities and specificities. 2-Aminopurine is an isomer of adenine (6-aminopurine); the 2-aminopurine fluorescence intensity is sensitive to local structural environment changes, and is suitable for the monitoring of triplex formation with the 2-aminopurine residue incorporated near the PNA binding site. 2-Aminopurine fluorescence titration can also be used to confirm the binding selectivity of modified PNAs towards targeted double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorbance-detected thermal melting experiments allow the measurement of the thermal stability of PNA-RNA duplexes and PNA&#183;RNA2 triplexes. Here, we describe the synthesis and purification of PNA oligomers incorporating modified residues, and describe biochemical and biophysical methods for characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs.

We report the protocols for the synthesis and purification of Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers incorporating modified residues. The biochemical and biophysical methods for the characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs are described.

一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

効率的な生産とモデル システムの動脈分布に CRISPR 識別/Cas9 生成遺伝子のノックアウト

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a promising vector for gene therapy application. Here, baculovirus is produced by transient transfection of the baculovirus plasmid DNA (bacmid) in an adherent culture of Sf9 cells. Baculovirus is subsequently expanded in Sf9 cells in a serum-free suspension culture until the desired volume is obtained. It is then purified from the culture supernatant using heparin affinity chromatography. Virus supernatant is loaded onto the heparin column which binds baculovirus particles in the supernatant due to the affinity of heparin for baculovirus envelop glycoprotein. The column is washed with a buffer to remove contaminants and baculovirus is eluted from the column with a high-salt buffer. The eluate is diluted to an isotonic salt concentration and baculovirus particles are further concentrated using ultracentrifugation. Using this method, baculovirus can be concentrated up to 500-fold with a 25% recovery of infectious particles. Although the protocol described here demonstrates the production and purification of the baculovirus from cultures up to 1 L, the method can be scaled-up in a closed-system suspension culture to produce a clinical-grade vector for gene therapy application.

In this protocol, baculovirus is produced by transient transfection of baculovirus plasmid into Sf9 cells and amplified in a serum-free suspension culture. The supernatant is purified by heparin affinity chromatography and further concentrated by ultracentrifugation. This protocol is useful for the production and purification of baculovirus for gene therapy application.

生産およびバキュロ ウイルスの遺伝子治療応用のための浄化

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in atherogenesis progression, ischemia, and myocardial infarction. Here we present a methodology of patient genotyping to investigate the post-transcriptional role of the C924T polymorphism (rs4523) situated at the 3&#39; region of the TBXA2 receptor gene. This method relies on DNA extraction from whole blood, polymerase chain reaction (PCR) amplification of the TBXA2 gene portion containing the C924T mutation, and identification of wild type and/or mutant genotypes using a restriction digest analysis, specifically a restriction fragment length polymorphism (RFLP) on agarose gel. In addition, the results were confirmed by sequencing the TBXA2R gene. This method features several potential advantages, such as high efficiency and the rapid identification of the C924T polymorphism by PCR and restriction enzyme analysis. This approach allows a predictive study for plaque formation and atherosclerosis progression by analyzing patient genotypes for the TBXA2R C924T polymorphism. Application of this method has the potential to identify subjects who are more susceptible to atherothrombotic processes, in particular subjects in a high-risk, aspirin-treated group.

In the present study, we describe a methodology to analyze the C924T genotype. The protocol consists of three phases: DNA extraction, amplification by polymerase chain reaction (PCR), and analysis of the restriction fragment length polymorphism (RFLP) on agarose gel.

トロンボキサン A2 受容体遺伝子の C924T 多型を勉強する方法

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

探索ルート マイクロバイ: 土、根、およびルート Endosphere から細菌群集のデータを抽出

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

酵母神経変性認知症予備モデルにおけるヒストン翻訳後修飾変化の特性

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...