この作品は、(RGT3/13 ・ RG42/15 g. c. に) 教育 (MOE) の層 1 のシンガポール省と萌え層 2 (MOE2013-T2-2-024 と g. c. に MOE2015-T2-1-028) によって支持されました。

ここで報告される作業に基づく特許出願 (パット/179/14/15/PCT) が提出されています。

RNA 二重バインディング PNA オリゴマー (例えば、10 mers) 中型の分子でありこうして示すことができる結合する電気泳動の移動性シフト Rna に同等またはわずかに大きいサイズの (例えば、50 mer またはより小さい)。RNA が PNA よりも著しく大きい場合、RNA に PNA の滴定が限られたゲルの移動性シフトのため機能しません。したがって、ページの非変化試金のため大規模な RNA が切り捨てられます。大規模な RNA の蛍光ラベルの PNA に滴定ゲル40の途中でロード サンプル非変化のアガロースゲル三重鎖形成の監視が可能です。
RNA の一定濃度の非変化ページによる滴定実験のため通常効率的な投稿が無料 RNA と三重のバンドのエチジウム ブロマイドで染色の 1 μ M のラベルの RNA 濃度を使用します。RNA 濃度 0.2 μ M としては RNA 構造31によって十分な場合もあります。ラベル付けされていない RNA 濃度 (0.2 μ M) は 0.2 μ M 程度より大きいこと正確に測定することができるKd値を決定します。他の染色の染料は、染色の効率を高めるために使えます。また、未発表データは、タイトなバインディング イベントを測定する非変化ページ実験で Cy3 色素標識 Rna が使えるをお勧めします。
による 2-アミノプリンは適度蛍光灯のみ、という事実のためにによる 2-アミノプリンの蛍光滴定してKd値 0.2 μ M31以上に近い結合の測定に限られています。蛍光信号53,54,の変化における結合結果する場合蛍光滴定液で比較的タイトなバインドを定量化するための比較的明るい染料 RNA または PNA で付いたことがあります。55。
PNAs の dsRNA バインディングによって RNA の構造を対象とする戦略は、Rna の限られた数のテストされています。シーケンスと塩基組成の異なる二本のバインディング プロパティが異なることが考えられます。1 つは常に TFPNAs の設計のための二重のプリン豊富なストランドを選択可能性があります。どのように連続 q · を理解することが重要C G トリプル、トリプレックスの安定性に影響を与える可能性があります。広範なシーケンスに依存した研究は明らかに TFPNAs の配列依存的結合特性を理解する必要です。
TFPNAs の結合親和性は、長くおよび/または TFPNAs の基盤およびバックボーン用56,57のさらなる変更によってさらに強化できます。ただし、連続二重地域がしばしば成り立たない、中断することがなく 10 以上の連続塩基の非ワトソン Crick 構造によって。TFPNAs を共役 dsRNA 地域に隣接する非ワトソン Crick 構造の認識のための小分子で 1 つ可能性があります。原則として、TFPNA 小分子の共役結合親和性と TFPNA や小さな分子だけに比べて特異性が強化されます。ただし、活用58,59,60,61,62,63,64 リンカーの化学および物理的特性最適化する必要があります。
TFPNAs は ssRNAs と二本、二本に選択的にバインドできますという事実を示唆非常に有用なプローブと RNA 構造力学との相互作用の調節を介して潜在的な治療のリガンドとして TFPNAs を開発することが可能です。タンパク質と代謝産物。低分子、ペプチド、ナノ粒子などの細胞貫通部分の活用やリポソーム56,などの超分子構造との錯形成を通して TFPNAs の細胞内取り込みを促進することがあります。 ,12,17,25,31,41,65,66。さらに蛍光物質や放射性同位元素などのバイオ イメージング タグ TFPNAs の高機能化は、検出、イメージング、および生きている有機体の機能性 RNA の構造のターゲットを促進するかもしれない。

Rna の重要なバイオ マーカーおよび調節における Rna の役割の発見と多様な生物学的プロセス1,2,3の触媒の最近の進歩のための治療上のターゲットとして浮上しています。伝統的に、アンチセンス鎖はワトソン Crick 二重形成3,4,5,6,7,8、を ssRNAs にバインドに使用されています。9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. 最近、三重鎖形成性ペプチド核酸 (TFPNAs) は、接合 (図 1)3,28,29Hoogsteen 水素経由で二本にバインドする設計されています。dsRNA 地域は Mrna および Mrna、事前または pri miRNAs3、多く他非コーディング RNAs1,26,27など伝統的なアンチセンス標的 Rna の大部分であります。TFPNAs を使用して三重らせんを形成を通して二本を対象とその構造の特異性のため有利になること、調節不全疾患では、例えば Rna の正常な機能を復元するのに使えない可能性大です。
最近公開された3,28,29,30,31,32,33、Roznersらと私たちの仕事 34,35,36,37,38,39,40,41, 改善の努力を報告強化された関係を持つ二本に向けて変更された TFPNAs の選択的結合。チオ-pseudoisocytosine (L) モノマー30グアニジン変更 5-メチル シトシン (Q) モノマー31など合理的に設計の PNA モノマー (図 2) の合成法を開発しました。さまざまな生化学と生物物理学的評価方法により L と Q 残基を組み込んだ比較的短い PNAs (6-10 残基) が二本でそれぞれ、ワトソン Crick G C と C G の塩基対の認識率が改善を示すことを確認しました。また、L と Q 残基を含む PNAs 未変更 PNAs に比べると、宿主と dsDNA dsRNA の方より選択的バインドを表示しています。Q ベースのグアニジン機能42 HeLa 細胞31を入力する PNAs ができます。
当研究室で合成マニュアルの Boc 化学 PNAs (Boc またはt- Boc の略 tert butyloxycarbony (図 2参照) 固相ペプチド合成方法4。アミンの保護基として Boc と PNA モノマーの合成は、Boc のグループは PNA 単量体結合中に有益であるかもしれないグループを保護する fluorenylmethyloxycarbonyl (fmoc 保護) アミンと比較して立体かさばらず便利なしっかりサポート。Boc のグループは酸に不安定、簡単に削除できます固体支持の 20-50% トリフルオロ酢酸 (TFA) ジクロロ メタン (DCM) で PNA 合成時に。自動ペプチド合成は PNA オリゴマーの合成に用いることができます。ただし、PNA 単量体の 3-5 倍の過剰は、自動ペプチド合成に必要です。手動合成には、大幅に少ない PNA モノマー (2 ~ 3 倍過剰)、各結合カイザー テスト43で容易に監視が必要です。また、多くの自動化されたシンセサイザー Boc 除去ステップ中に腐食性 TFA の使用のため Boc 戦略合成との互換性はありません。
逆相高速液体クロマトグラフィー (クロマトグラフィー) MALDI-TOF の分子量特性評価に続いて、PNA オリゴマーを浄化することが (図 3 と4)30,31. 三重鎖形成を監視するという無料の RNA 二重を構築し、PNA は頻繁におしゃれをバインドされているためにを表示別の移行率 (図 5)30,31ページの非変化を用いて.ラベルは必要ありません RNA 二重と PNA· の両方の効率化後染色が得られるならRNA2三重バンド。比較的少量の試料は、非変性ページ実験に必要です。ただし、読み込み (インキュベーション) バッファーおよび実行バッファー (pH 8.3) できない場合があります同じ 8.3 の比較的高い pH は大きく、トリプレックスを揺るがす可能性がありますので、速度論的に安定したおしゃれに限定されている測定の結果します。
による 2-アミノプリン アデニン (6-アミノプリン); の異性体でありによる 2-アミノプリンの蛍光強度 (約 370 に発光ピークを持つ nm) はローカル構造的な環境変化に敏感とバインド サイト (PNA 近く設立による 2-アミノプリンの残基三重鎖形成の監視に適しています図 6)31. 多く他の染料は目に見える範囲で蛍光性の放出を示すとは異なり 2-アミノプリン標識 RNA が写真漂白なし室内灯に公開できます。実行バッファー pH 8.3 がしばしば必要となるページの実験とは異なりによる 2-アミノプリンの蛍光滴定指定した pH で 1 つのソリューションに結合の測定が可能、測定と比較的弱いの検出可能性があることと速度論的に不安定な平衡のバインディングします。
UV 吸光度検出熱溶融実験許可二重 (図 7)31とトライの熱安定性の測定プレックス30,32,44,45。長さとシーケンスの組成によっておしゃれの融解は、明確な転移を示さないかもしれない。熱力学的パラメーターは、加熱と冷却曲線が重なっている場合に得られるかもしれない。等温滴定熱量測定 (ITC)32; 正確な熱力学的パラメーターを取得します。ただし、比較的大量のサンプルが ITC の一般的に必要です。

<table style="border-collapse:collapse;width:491pt" width="654">
	<colgroup>
		<col style="width:176pt" width="235" />
		<col style="width:116pt" width="155" />
		<col span="3" style="width:66pt" width="88" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl25" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets&#160;</td>
			<td class="xl26" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl74" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">87956</td>
			<td style="width:66pt" width="88"></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA&#376;HCl)</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl68" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">532444</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A11801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B25251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acetic anhyride</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">320102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Kaiser Test Kit&#160;</td>
			<td class="xl30">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">60017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl29" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td class="xl30">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L06374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Unmodified PNA monomers</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">ASM Research Chemicals GmbH</td>
			<td class="xl70" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">B8389 / 47624</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Thioanisole</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A14846</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">1,2-Ethanedithiol</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">L12865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Trifluoromethanesulfonic acid</td>
			<td class="xl36" style="width:116pt" width="155">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl72" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A10173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">LiChrosper&#174; 100 RP-18 endcapped (5 &#181;m) LiChroCART&#174; 250-4</td>
			<td class="xl41">Merck Millipore</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">150838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">RNA Oligos&#160;</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">Customized&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">&#945;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">39468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td class="xl41">Alfa Aesar</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">J15694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">HEPES&#160;</td>
			<td class="xl41">Lonza</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">17-737E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Acrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">A8887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">N.N&#39;-methylenebisacrylamide</td>
			<td class="xl41">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">146072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td class="xl41">Bio-rad</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl35" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3</td>
			<td class="xl41">1st Base</td>
			<td class="xl57" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">BUF-3010-10X1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Glycerol&#160;</td>
			<td class="xl45">Promega&#160;</td>
			<td class="xl55" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">H5433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl44" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">Ethidium bromide (10 mg/mL)</td>
			<td class="xl45">Bio-rad&#160;</td>
			<td class="xl64" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">161-0433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60" style="height:45.0pt">
			<td class="xl48" height="60" style="width:176pt;height:45.0pt" width="235">High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td>
			<td class="xl49">Hellma Analytics&#160;</td>
			<td class="xl61" height="60" style="width:132pt;height:45.0pt" width="176">105.250-QS</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids

Rna の重要なバイオ マーカーおよび治療上のターゲットとして浮上しています。従って、化学プローブや RNA 配列および構造の認識のため治療上の配位子の開発に大きな可能性があります。化学修飾ペプチド核酸 (PNA) オリゴマーが最近開発されているシーケンス固有の方法で RNA 二重鎖を認識することができます。PNAs は中立的なペプチドのようなバックボーンを持つ化学的に安定しています。PNAs は、その手動 Boc 化学固相ペプチド合成法によるは簡単に比較的合成することができます。PNAs、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化-時間飛行 (MALDI-TOF) の分子量特性によって続いて逆相 HPLC により精製しました。非変化のポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) 法を容易に三重鎖形成のイメージングを慎重に設計無料 RNA 二重を構築し、PNA は頻繁におしゃれをバインドされているのでショー別の移行率。エチジウム ブロマイド ポスト染色と非変性のページはしばしば結合親和性と PNA オリゴマーの特異性を特徴付けるための簡単で有益な技術です。通常、複数の RNA のヘアピン構造または単一塩基変異は、PNA のバインディング プロパティ、親和性と特異性のバインドなどの特性評価に使用できます。による 2-アミノプリン アデニン (6-アミノプリン); の異性体でありによる 2-アミノプリンの蛍光強度はローカル構造的な環境変化に敏感な三重鎖形成による 2-アミノプリンの残基の PNA 結合部位付近の監視に適しています。による 2-アミノプリンの蛍光滴定は、一本鎖 Rna (ssRNAs) をバインディング ターゲットの二本鎖 Rna (二本) へ変更された PNAs 性を確認する使用できます。UV 吸光度検出熱溶融実験許可 PNA RNA 二重鎖と PNA· の熱安定性の測定RNA2おしゃれ。ここで合成について述べる、PNA オリゴマーを組み込むの精製残基を変更変更 PNAs によって RNA 二重鎖の認識の生化学的および生物物理学的法を記述します。

逆相高速液体クロマトグラフィーでは、PNA オリゴマーの浄化をことができます。我々 は、高速液体クロマトグラフィー精製 (図 3) の 2 つのラウンドで純粋な PNA オリゴマーを取得できます。MALDI-TOF 分析 (図 4) によって、PNAs の id を確認できます。
非変性のページは結合親和性と PNA オリゴマーの特異性を特徴付けるため簡単で有益な手法です。私たち通常使用複数の RNA のヘアピン構造や二重単一塩基変異を持つバインディング プロパティ (図 5) を特徴付けるため。非変化ページのデータを図 5に示すように明確に示唆している、Q と L-修飾 PNA C G ペア (図 5B底板) で dsRNA 領域を認識できる (図 5B、トップ C G ペアがないものではないが、パネル)。この特定と強化された認識は、T·、A U、L·G-C、および q ·C G PNA·RNA2基本トリプル (図 1A C D) の形成。1 つまたは複数の遺伝子変異を有する様々 な PNAs も変更された PNA の改良された結合特性を発揮する使えます。インキュベーション バッファーに 2 mM Mg2 +を追加するバインドは影響しませんを示した大幅31。
Q と L 変更の PNA にバインド ターゲット dsRNA 地域 (図 6A, 6 C, 6 D) がいない宿主 (図 6B、6 e、6 f) による 2-アミノプリン蛍光滴定法により実証しました。PNA P3 は 0.8 ± 0.1 μ M のKのd値を持つ 2-アミノプリン ラベル dsRNA にバインドします。370 で蛍光強度 2-アミノプリン ラベル宿主の nm、宿主の PNA P3 結合の欠如を示す、P3 濃度が異なると比較的一定している残る。
PNAs の融解転移 (図 7)、宿主へのバインドがないことを示すない熱 Q 残留 (P2、P3) ショーを含みます。これ立体衝突 Q G ペアのようなワトソン Crick に存在ためです。未変更の PNA P1 と比較して、PNAs P4 と P5 を含む変更 L 残基がない Q 残留、ショーは立体衝突 L G ペアのようなワトソン Crick の存在により対応する RNA PNA デュープレックスの溶解温度を減少しました。UV 吸光度検出熱溶融データも Q と L 残基を含む PNA は宿主にかなりバインドできません表示による 2-アミノプリンの蛍光滴定データと一致している (図 6B、6 e、6 階)。Q ベース ワトソン Crick 様 L G ペア (図 1E と比較してワトソン Crick 様 Q G ペア (図 1F) の形成でより重要な立体衝突があり、L ベースよりもより不安定 Q ベースを組み込むことは).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
図 1: 安定した基本トリプルと不安定な塩基対の構造の化学構造。(A ~ D)主要な溝 PNA·T· の RNA2基本組(A) A U, C+·G-C (B) L·G C (C)、および q ·C G (D)。(E, F)L G (E) と (F) - G の Q の PNA RNA 塩基対のような不安定なワトソン Crick。R の文字は、RNA の糖リン酸塩のバックボーンを表します。水素結合は、黒の破線で示されます。図は参照31から再現します。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
図 2: PNA 単量体の化学構造。4 PNA モノマー (T、C、L、および Q) が表示されます。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
図 3: PNA オリゴマーと RP hplc 精製の化学構造。(A) PNA シーケンス P3 の化学構造。(B、C)原油の PNA P3 のクロマトグラフィー データ (B) PNA P3 を再精製 (C)。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
図 4:精製 PNA P3 の MALDI-TOF スペクトル。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
図 5:RNA のヘアピンと PNA シーケンスおよび非変化のページによるバインディングの評価。(A) RNA のヘアピン (rHP1 と rHP2)、PNA P3 と、PNA·PNA P3 と rHP2 間に RNA2三重が形成されました。(B) 非変性ページ (12%) は、rHP1 と PNA P3 への rHP2 結合の結果します。インキュベーション バッファーは 200 mM の NaCl、0.5 ミリメートルの EDTA、20 mM HEPES、pH 7.5 です。読み込まれた RNA のヘアピン (rHP1 と rHP2) は、20 μ L で 1 μ M にあります。左から右への車線で PNA 濃度が 0、0.2、0.4、1、1.6、2、4、10、16、20、28、50 μ M. PNA P3 にバインドされません rHP1 と rHP2 (上部パネル) がバインド (底板)。(C) Kd定量 rHP2 P3 バインディングのため。三重鎖形成 (Y) の割合は、PNA の濃度に対してプロットしました。図は参照31から適応です。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
図 6: PNA P3 バインディングの蛍光滴定法の研究2-アミノプリン標識 Rna。による 2-アミノプリンの残渣は、RNA シーケンスに '2' として指定されます。インキュベーション バッファーは 200 mM の NaCl、0.5 ミリメートルの EDTA、20 mM HEPES、pH 7.5 です。(A)、PNA·P3 と 2-アミノプリン ラベル dsRNA (dsRNA2 2AP) 間に RNA2三重が形成されました。P3 と 2-アミノプリン ラベル宿主 (ssRNA2 2AP) 間に (B) A 仮想 PNA RNA 二重が形成されました。(C、 E)蛍光発光スペクトル 2-アミノプリン標識 RNA 二重 (1 μ M) と宿主 (1 μ M) のそれぞれと様々 な pH 7.5 で P3 濃度。ピークで約 475 nm は PNA の L ベースの弱い蛍光発光によるもの。(D, F)Kによる 2-アミノプリンの蛍光強度のプロットに基づくd定量 (370 で nm) の RNA 二重と宿主、PNA P3 濃度対それぞれ。図は参照31から適応です。<a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
図 7: 熱溶融性二本鎖 RNA PNA の結果。インキュベーション バッファーは 200 mM の NaCl、0.5 ミリメートルの EDTA、20 mM NaH2PO4、pH 7.5 です。すべてのサンプルには、単一座礁させた RNA (ssRNA1) ・ 130 μ。 (A) 単一座礁させた rna (ssRNA1) PNA、PNAs (P1、P2、P3、P4、P5) PNA P3 と平行方向に ssRNA1 間に形成された仮説的な PNA RNA 二重の 5 μ M が含まれています。Q G と L G ペアのようなワトソン Crick の立体の衝突は示されます。異なる PNAs の曲線に (B) 溶融 ssRNA1 へのバインディングします。溶ける温度が融点が遷移曲線の表示されます。図は参照31から適応です。

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Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

一本鎖 Rna の二重鎖 Rna の特定のシーケンスで選択的な認識化学修飾ペプチド核酸

今回は合成のためのプロトコル、ペプチド核酸 (PNA) オリゴマーを組み込むの精製変更残基。PNAs の変更によって RNA 二重鎖の認識の特性の生化学的および生物物理学的方法を説明します。

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

sequence-specific-selective-recognition-double-stranded-rnas-over

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

9.4K ビュー.  Nanyang Technological University. 今回は合成のためのプロトコル、ペプチド核酸 (PNA) オリゴマーを組み込むの精製変更残基。PNAs の変更によって RNA 二重鎖の認識の特性の生化学的および生物物理学的方法を説明します。

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Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

世界的な農業害虫昆虫における胚のマイクロインジェクションを介して、核酸の送達、<em&gt;チチュウカイミバエ</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

遺伝学

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

細菌接合に関与する転写タンパク質の配列特異的分析のための接合交配アッセイ

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Here, we present protocols for rearing an intermediate-germ beetle, Dermestes maculatus (D. maculatus) in the lab. We also share protocols for embryonic and parental RNAi and methods for analyzing embryonic phenotypes to study gene function in this species.

隠すビートルにノックダウン飼育し、二本鎖RNA媒介遺伝子、<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different molecules and molecular assemblies in a heterogeneous sample. In the particular context of DNA interacting protein systems, different protein complex forms and their corresponding binding positions on target sites containing DNA fragments can thus be distinguished. Here, an application of AFM to the study of DNA lesion recognition in the prokaryotic and eukaryotic nucleotide excision DNA repair (NER) systems is presented. The procedures of DNA and protein sample preparations are described and experimental as well as analytical details of the experiments are provided. The data allow important conclusions on the strategies by which target site verification may be achieved by the NER proteins. Interestingly, they indicate different approaches of lesion recognition and identification for the eukaryotic NER system, depending on the type of lesion. Furthermore, distinct structural properties of the two different helicases involved in prokaryotic and eukaryotic NER result in and explain the different strategies observed for these two systems. Importantly, these experimental and analytical approaches can be applied not only to the study of DNA repair but also very similarly to other DNA interacting protein systems such as those involved in replication or transcription processes.

Here, the study of different DNA lesion recognition approaches via single molecule AFM imaging is demonstrated with the nucleotide excision repair system as an example. The procedures of DNA and protein sample preparations and experimental as well as analytical details for the AFM experiments are described.

ヌクレオチド切除修復におけるDNA損傷認識の原子間力顕微鏡検査

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for protein synthesis by translating codons in mRNA into amino acid sequences. tRNAs were long considered as house-keeping molecules that lacked regulatory functions. However, a growing body of evidence indicates that cellular tRNA levels fluctuate in correspondence to varying conditions such as cell type, environment, and stress. The fluctuation of tRNA expression directly influences gene translation, favoring or repressing the expression of particular proteins. Ultimately comprehending the dynamic of protein synthesis requires the development of methods able to deliver high-quality tRNA profiles. The method that we present here is named SPOt, which stands for Streamlined Platform for Observing tRNA. SPOt consists of three steps starting with metabolic labeling of cell cultures with radioactive orthophosphate, followed by guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction of radioactive total RNAs and finally hybridization on in-house printed macroarrays. tRNA levels are estimated by quantifying the radioactivity intensities at each probe spot. In the protocol presented here we profile tRNAs in Mycobacterium smegmatis mc2155, a nonpathogenic bacterium often used as a model organism to study tuberculosis.

We describe an original transfer RNA analysis platform named SPOt (Streamlined Platform for Observing tRNA). SPOt simultaneously measures cellular levels of all tRNAs in biological samples, in only three steps, and in less than 24 hours.

代謝ラベリングと Macroarrays を使用して転移 Rna のプロファイリング

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Cell Based Assays of SINEUP Non-coding RNAs That Can Specifically Enhance mRNA Translation

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. Here, we present a method to selectively up-regulate protein expression of desired genes in cultured cells by means of synthetic antisense non-coding RNAs known as SINEUPs. This positive control of gene expression is at the post-transcriptional level and exerted by an inverted short interspersed nuclear element (SINE) repeat at the 3&#697; end of SINEUPs that comprises its effector domain (ED). SINEUPs can specifically bind to any protein-coding mRNA of choice through its binding domain (BD), a region designed to complement the sequence within the 5&#697; untranslated region (5&#697; UTR) and around the start codon of the mRNA. Target-specific SINEUPs designed in this manner are transfected to cultured cells, and protein and RNA are extracted for downstream analyses, generally 24-48 h post-transfection. SINEUP-induced protein up-regulation is detected by Western-blot analysis and RNA expression is measured using real-time quantitative reverse transcription PCR. We have observed that BD design is critical for achieving optimum SINEUP activity and that testing different BD sizes and positions with respect to the start codon of the target mRNA is recommended. Therefore, we describe here a semi-automated high-throughput imaging method based on fluorescence detection that can be implemented to target mRNA fused with green fluorescent protein (GFP). SINEUPs specifically enhance translation within normal physiological range of the cell, without altering the target transcript level. This method has been successfully employed against a range of endogenous and exogenous targets, in a wide variety of human, mouse, and insect cell lines along with in vivo systems. Moreover, SINEUPs have been reported to increase antibody production and work as an RNA therapeutic against haploinsufficient genes. The versatile and modular nature of SINEUPs makes them a suitable tool for gene-specific translational control.

SINEUPs are synthetic antisense non-coding RNAs, which contain a binding domain (BD) and an effector domain (ED) and up-regulate translation of target mRNA. Here, we describe detection methods for SINEUPs in cultured cell lines, analysis of their translation-promoting activity by Western-blot and a semi-automated high throughput imaging system.

セルベースのアッセイ SINEUP 非コード Rna mRNA の翻訳を特に高めることができるの

Targeted-protein enhancement is of importance not only for the study of biological processes but also for therapeutic and biotechnological applications. ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and host cell proteins on viral DNA synthesis. Here we address the lack of a cell-based, high-coverage, and high-resolution assay that is capable of defining retroviral reverse transcription intermediates within the physiological context of virus infection. The described method captures the 3'-termini of nascent complementary DNA (cDNA) molecules within HIV-1 infected cells at single nucleotide resolution. The protocol involves harvesting of whole cell DNA, targeted enrichment of viral DNA via hybrid capture, adaptor ligation, size fractionation by gel purification, PCR amplification, deep sequencing, and data analysis. A key step is the efficient and unbiased ligation of adaptor molecules to open 3'-DNA termini. Application of the described method determines the abundance of reverse transcripts of each particular length in a given sample. It also provides information about the (internal) sequence variation in reverse transcripts and thereby any potential mutations. In general, the assay is suitable for any questions relating to DNA 3'-extension, provided that the template sequence is known.

Here we present a deep sequencing approach that provides an unbiased determination of nascent 3&#39;-termini as well as mutational profiles of single-stranded DNA molecules. The main application is the characterization of nascent retroviral complementary DNAs (cDNAs), the intermediates generated during the process of retroviral reverse transcription.

決定の 3' 末端と HIV-1 の間に初期の一本鎖のウイルス DNA 分子のシーケンスを逆に感染細胞における転写

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Overexpressing Long Noncoding RNAs Using Gene-activating CRISPR

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since 2007. These studies have confirmed that lncRNAs are altered in almost all diseases. However, studying the functional roles for lncRNAs in the context of disease remains difficult due to the lack of protein products, tissue-specific expression, low expression levels, complexities in splice forms, and lack of conservation among species. Given the species-specific expression, lncRNA studies are often restricted to human research contexts when studying disease processes. Since lncRNAs function at the molecular level, one way to dissect lncRNA biology is to either remove the lncRNA or overexpress the lncRNA and measure cellular effects. In this article, a written and visualized protocol to overexpress lncRNAs in vitro is presented. As a representative experiment, an lncRNA associated with inflammatory bowel disease, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), is shown to be overexpressed in a Jurkat T-cell model. To accomplish this, the activating clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) technique is used to enable overexpression at the endogenous genomic loci. The activating CRISPR technique targets a set of transcription factors to the transcriptional start site of a gene, enabling a robust overexpression of multiple lncRNA splice forms. This procedure will be broken down into three steps, namely (i) guide RNA (gRNA) design and vector construction, (ii) virus generation and transduction, and (iii) colony screening for overexpression. For this representative experiment, a greater than 20-fold enhancement in IFNG-AS1 in Jurkat T cells was observed.

Traditional cDNA-based overexpression techniques have a limited applicability for the overexpression of long noncoding RNAs due to their multiple splice forms with potential functionality. This review reports a protocol using CRISPR technology to overexpress multiple splice variants of a long noncoding RNA.

CRISPR の遺伝子活性化を使用して長い Rna を過剰発現

Long noncoding RNA (lncRNA) biology is a new and exciting field of research, with the number of publications from this field growing exponentially since ...

In Vitro Biochemical Assays using Biotin Labels to Study Protein-Nucleic Acid Interactions

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental methods to study protein-nucleic acid interactions require the use of fluorescent tags, radioactive isotopes, or other labels to detect and analyze specific target molecules. Biotin, a non-radioactive nucleic acid label, is commonly used in electrophoretic mobility shift assays (EMSA) but has not been regularly employed to monitor protein activity during nucleic acid processes. This protocol illustrates the utility of biotin labeling during in vitro enzymatic reactions, demonstrating that this label works well with a range of different biochemical assays. Specifically, in alignment with previous findings using radioisotope 32P-labeled substrates, it is confirmed via biotin-labeled EMSA that MEIOB (a protein specifically involved in the meiotic recombination) is a DNA-binding protein, that MOV10 (an RNA helicase) resolves biotin-labeled RNA duplex structures, and that MEIOB cleaves biotin-labeled single-stranded DNA. This study demonstrates that biotin is capable of substituting 32P in various nucleic acid-related biochemical assays in vitro.&#160;

Presented here are protocols for in vitro biochemical assays using biotin labels that may be widely&#160;applicable for studying protein-nucleic acid interactions.

ビオチン標識を用いてタンパク質核酸相互作用を研究するインビトロ生化学アッセイ

Protein-nucleic acid interactions play important roles in biological processes such as transcription, recombination, and RNA metabolism. Experimental ...

High-Density DNA and RNA microarrays - Photolithographic Synthesis, Hybridization and Preparation of Large Nucleic Acid Libraries

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite coupling reactions with the precision and density of UV light reflected from micrometer-sized mirrors. Photolithography yields microarrays that can accommodate from hundreds of thousands up to several million different DNA sequences, 100-nt or longer, in only a few hours. With this very large sequence space, microarrays are ideal platforms for exploring the mechanisms of nucleic acid&#183;ligand interactions, which are particularly relevant in the case of RNA. We recently reported on the preparation of a new set of RNA phosphoramidites compatible with in situ photolithography and which were subsequently used to grow RNA oligonucleotides, homopolymers as well as mixed-base sequences. Here, we illustrate in detail the process of RNA microarray fabrication, from the experimental design, to instrumental setup, array synthesis, deprotection and final hybridization assay using a template 25mer sequence containing all four bases as an example. In parallel, we go beyond hybridization-based experiments and exploit microarray photolithography as an inexpensive gateway to complex nucleic acid libraries. To do so, high-density DNA microarrays are fabricated on a base-sensitive monomer that allows the DNA to be conveniently cleaved and retrieved after synthesis and deprotection. The fabrication protocol is optimized so as to limit the number of synthetic errors and to that effect, a layer of &#946;-carotene solution is introduced to absorb UV photons that may otherwise reflect back onto the synthesis substrates. We describe in a step-by-step manner the complete process of library preparation, from design to cleavage and quantification.

In this article, we present and discuss new developments in the synthesis and applications of nucleic acid microarrays fabricated in situ. Specifically, we show how the protocols for DNA synthesis can be extended to RNA and how microarrays can be used to create retrievable nucleic acid libraries.

高密度DNAおよびRNAマイクロアレイ - 光リソグラフィー合成、ハイブリダイゼーション、大型核酸ライブラリーの調製

Photolithography is a powerful technique for the synthesis of DNA oligonucleotides on glass slides, as it combines the efficiency of phosphoramidite ...