We thank Drs. Alison Heffer and Yong Lu for setting up the microinjection apparatus and sharing their invaluable knowledge and experience with insect RNAi. This work was supported by the National Institutes of Health (R01GM113230 to L.P.).

The authors have nothing to disclose.

בעוד מספר קטן של מערכות מודל משוכללות (עכברים, זבובים, תולעים) פותח במהלך המאה ה -20, המאה ה -21 התאפיינה בגל של מערכות חיה חדשות שמפתח במעבדות ברחבי העולם. מערכות החדשות אלה מאפשרים מדענים לעסוק בשאלות השוואתיות, אבולוציוני כי לא יכול להיות נחקרת אך ורק באמצעות מערכות מודל &quot;הרגילות&quot;. פריסה זו של דגמים חדשים דורשת ההתפתחות המהירה של שיטות culturing מעבדה, זיהוי גנים, וגישות תפקודיות מינים חדשים. הנה, נהלים לגידול ד maculatus במעבדה צעד-אחר-צעד פרוטוקולים RNAi עובריים, הורים RNAi, וניתוח פנוטיפי ב חיפושית זה הוצגו. המטרה היא שתיאורים אלה לעודד אחרים להשתמש ד maculatus בניסויים שלהם לעשות שימוש הגישות שהוצגו כאן לפתח מיני דגם חדשים נוספים. בעוד ד maculatus lמושבות ab קלות מאוד לשמור, מגבלה אחת של גידול מין זה היא הריח לא הנעים של מזון החתולים הרטוב שגבה את החיפושיות כמקור מזונם. כדי למנוע זאת, מזונות חלופיים כגון אבקת חלבון מי גבינה / סויה, גבינה, מזון לכלבי קרקע, ואבקת חלב, נבדקו עם או בלי צמר גפן רטוב לשנות לחות. מזון כלבי קרקע היה האלטרנטיבה היעילה ביותר וניתן המשמש להזנת מושבה קבועה. ההישרדות הייתה מצוינת (&gt; 90%) מביצה לבוגר בכלובים שגדלו על רק מזון כלבים יבש ב 80% לחות יחסית, עם או בלי רטובה כותנה הוסיפה. עם זאת, השלים הדיאטה הזאת עם מזון חתולים רטוב בעת איסוף ביצים להגדיל פוריות עשוי להיות נחוץ בעת איסוף מספר גדול של ביצים. אם מזון לכלבים משמש, מזון ישן צריך להיות מוסר באופן קבוע, כמו מזון כלבים מותנה נמצא לעכב הטלה 54. Kibbles מזונות כלבים (KR, תוצאות ראשוניות), שעם, עץ, נייר, וחומרים אחרים יכולים לשמש גם פליטי 71.מעניין, לפירוק הקלקר באמצעות זחלי mealworm חיפושית דווח 72. לכן, זה נבדק עבור זחלי ד maculatus. ד יאנג maculatus הזחלים שרדו עד לבגרות עם קלקר בלבד או חומרים צמר גפן רטוב המכילים אסבסט (מידע לא מוצג) אבל אם הם אוכלים ולעכל חומרים אלו עדיין לא נקבע. דו&quot;ח זה הוא הפרוטוקול המפורט הראשון לביצוע מחקרים גנטיים תפקודיים ד maculatus. שימוש RNAi כאן מייצג הרחבה בטכניקה זו כדי מערכת דגם חדשה. תצפיות ספציפיות כמה ראויות לציין ביחס ניסויי מציאת RNAi ב ד maculatus ומינים שאינם מודל אחרים. ראשית, כדי להבטיח כי RNAi יהיה יעיל ד maculatus, באותו זן של ד maculatus משמש כאן צריך להיות מועסק. יש ראיות מן castaneum Tribolium כי זנים שונים מראים וריאציה RNAi phenotypes 24,73, ו פנוטיפים מוטנטים לעתים קרובות להראות תלות רקע גנטי במיני מודל 74-76. כמו כן, יש ראיות אנקדוטיות על-תלות מתח פרוטוקולים אחרים, כולל הכלאה באתרה. שנית, עיתוי ההזרקה המתאים הוא קריטי עבור RNAi המוצלח ד maculatus. מעט counterintuitively, את segmacoria חודרים ביותר בקלות לאחר לציפורן יש sclerotized לחלוטין, לפחות יומיים לאחר eclosion. לכן, נקבות בתולה 4 - 8 ימים לאחר eclosion אמורות לשמש. מבוגרים נקבות לחוות פוריות נמוכה מאשר נקבות eclosed החדש ועל כן אינם מתאימים להזרקה. שלישית, מוזרק dsRNA עשוי לקבל דחף החוצה על ידי הלחץ הפנימי של הבטן הנשית. כדי למזער את האפשרות לאבד כמות גדולה של dsRNA לאחר ההזרקה, להחזיק את מחט לבטן עבור ~ 5 שניות לאחר ההזרקה ולאחר מכן הסר אותו לאט (6.2.8). בינתיים, להימנע לחיצה על הבטן של הנקבה במהלך או מידלאחר ההזרקה. כדי לעקוף תוצאות מוטות נגרמת מבעיה זו, להזריק לפחות 8 נקבות לכל dsRNA להשיג מספיק הצאצאים (~ 200 עוברים מדי יום) לניתוח פנוטיפי. רביעית, תשואת ביצה גבוהה חשובה לספק נתונים משוחדים לניתוח פנוטיפי לאחר הזרקה. בממוצע, כל נקבה ד maculatus מייצרת כ 35-55 עוברים מדי יום. תשואה ביצה תלוי בגודל האוכלוסייה, אישה, לחות, זמינות מזון, טמפרטורה (מידע לא מוצג), וגורמים סביבתיים אחרים 54. בדרך כלל, נקבות מטילות יותר על 30 מעלות צלזיוס מ -25 מעלות צלזיוס. חמישית, ניתן פריו עוברים שלא נולדה על ידי הזחלים בקעו. כמו זחלים בקעו הם בדרך כלל wild-type דמוי או רק מושפע במתינות, בעוד עובריים שלא נולד הם בדרך כלל יותר קשות מושפע שההרגל של זחלי ד maculatus יכול לגרום לתוצאות מוטות ניתוח פנוטיפי כמותית. לכן, הסרת הזחלים בקעו מוקדם ככל האפשר מומלץ מאוד. המעבדה שלנו התמקדה פילוח ד maculatus, אף שהיבטים רבים של מינים, כולל זו פיזיולוגיה, אקולוגיה, דברה-הם עניין רב. ללימוד עובר ופילוח, סדרה של פסי פיגמנט כהה בצד הגבי של זחלי ד maculatus יכולה לשמש כסמן טבעי התפתחות לא תקינה. כמו כן, setae מאפיין מושרש על פסים פיגמנט של הזחלים יכול לשמש כאינדיקציה מגזרים. תכונות מורפולוגיות אלה, יחד עם הממצא כי במתינות או די עוברים מושפע יכול לשרוד עד הבקיעה, הם היתרונות של המודל ד maculatus כדי לחקור את המנגנונים המעורבים patterning תוכנית הגוף הבסיסי. לבסוף, את החשיבות של ביצוע ניסויים-כולל מבוקרת מאוד כביקורת שלילית כגון dsRNA GFP ובדיקת שני אזורי היעד שאינו חופפים עבור כל גן-היא קריטית כדי למנוע פרשנות שגויה עקב effects של הזרקת כשלעצמה ואפקטים מחוץ היעד. עבור ד maculatus, 4 - 6 מיקרוגרם (2 μl של 2 או 3 מיקרוגרם / μl) dsRNA הוזרקו כל הנשי ואת dsRNA היה 200-250 נ&quot;ב ארוך. סכומים ופרטים נוספים של הפרוטוקול ייתכן שיהיו צורך אופטימיזציה אם מיקוד גנים מתפקדים בהמשך פיתוח או בתהליכי חילוף חומרים / פיסיולוגיים שונים. תגליות קודמות הראו כי השפעות RNAi ניתן מועברות לדורות הבאים מעבר דור F1 ב C. elegans 15. מיעוטם של הזחלים בקעו ד maculatus עם מומים פילוח בשל RNAi יכול לשרוד עד לבגרות והוא יכול להתרבות. ניסויים ראשוניים הצליחו לחשוף ליקויים ברורים בדור F2. מחקרים עתידיים עשויים לחשוף השפעות בין דוריות של RNAi של מין זה.

בשנת 1998, אש מלו דיווחו כי RNA פעמיים תקועים (dsRNA) יכול לגרום עיכוב של פונקציה גנים elegans Caenorhabditis 1. תגובה זו מופעלת על ידי dsRNA נקראה התערבות RNA (RNAi), ו להשתקת גנים RNAi בתיווך כזה נמסר ישומרו ב בעלי חיים, צמחים, ופטריות 2-7. בצמחים וכמה חיות, פונקציות RNAi מערכתית, כלומר ההשפעה יכולה להתפשט תאים / רקמות אחרות שבהן dsRNA לא הציג באופן ישיר (הנסקרת ב 8-10). מדענים עשו שימוש בתגובה RNAi הסלולר אנדוגני זאת על ידי תכנון dsRNAs למקד את הגנים של עניין, ובכך דריסה תפקוד הגן ללא מניפולציה של הגנום ישירות (הנסקרת ב 11-14). RNAi הוא כלי רב עצמה עבור מחקרים תפקודיים בשל היתרונות הבאים. ראשית, אפילו עם מידע רצף הגן מינימלי, גן יכול להיות ממוקד באמצעות RNAi. זה חשוב במיוחד עבור studies של אורגניזמים שאינם מודל חסר הנתונים הגנומי או transcriptomic. שנית, באורגניזמים שבו תגובת RNAi היא מערכתית וחסון, מציאת גן בתיווך RNAi ניתן לבצע כמעט בכל שלב התפתחותי. תכונה זו שימושית מאוד ללימוד הפונקציה של גני pleiotropic. שלישית, במקרים מסוימים, תופעות RNAi להתפשט אל בלוטות המין וצאצאים, כך פנוטיפים הם נצפו בצאצאים 15,16. תופעה זו, המכונית RNAi ההורי (pRNAi), יש יתרון במיוחד עבור גני ההשפיע התפתחות עוברית, כמו צאצאים רבים המיוצרים על ידי הורה מוזרק אחת יכולים להיבחן ללא מניפולציה ישירה של ביצים. מסיבות אלה, pRNAi היא השיטה של ​​בחירה. עם זאת, אם pRNAi אינו יעיל, למשל עבור הגנים הדרושים oogenesis, אז העוברי RNAi (eRNAi) חייב לשמש. הרביעית, RNAi יכול לשמש כדי ליצור את המקבילה של סדרת אללים ב שכמות dsRNA לגידולים יכולות להיות מגוונות על פני טווח לייצר חלש לפגמים חזקים. כזה הדרגתיות של פנוטיפים יכולה להיות מועילה להבנת תפקוד גן כאשר הגן מעורב תהליך מורכב ו / או אובדן מוחלט של פונקציה הוא קטלני. חמישי, מסירת dsRNA קלה בדרך כלל ריאלית, במיוחד בחיות מראות תגובות RNAi מערכתיות חזקות. dsRNA יכול להיות מוצג על ידי microinjection 1,5, האכלה / בליעה 17,18, השריה, 19,20 ו וירוס / מסירה בתיווך חיידקים 21,22. השישית, בניגוד לשיטות מיקוד / עריכה כמה גן, אין צורך למסך אורגניזמים נושא את המוטציה או לבצע צלבים גנטיים לייצר הומוזיגוטים בעת שימוש RNAi. לכן, לעומת טכניקות רבות אחרות לחקר תפקוד גן, RNAi הוא מהיר, זול, והוא יכול להיות מיושם על מסכים גדול בקנה מידה 23-25. השירות הרחב של RNAi מספק אמצעים לבצע מחקרים פונקציונליים במגוון רחב של אורגניזמים, הרחבת סל מינים לרשותנו בעבודה beyonד מערכות המודל המסורתי עבורו פותחו כלים גנטיים. לדוגמא, מחקרים באמצעות מערכות שאינם מודל נדרשים לתת תובנה על האבולוציה של גני רשתות גנים ידי השוואת הפונקציות של orthologs ממינים המייצגות מצבי פיתוח שונים או מפגין תכונות מורפולוגיות ברורות 26-29. אלו סוגים של מחקרים יספקו הבנה טובה יותר של מגוון ביולוגי, עם שפעות הוא למחקר יישומים ובסיסי. להיות קבוצת החיה הגדולה ביותר בכדור הארץ, חרקים מספקים הזדמנות מצוינת לחקור את המנגנונים מגוונים בסיסית. בנוסף, החרקים קטנים בדרך כלל, יש מחזור חיים קצר, פוריות גבוהה, והם קלים אחוריים במעבדה. בשני העשורים האחרונים, RNAi יושם בהצלחה חרקים פורש הזמנות, כולל Diptera (זבובים נכון) 5, פרפראים (פרפרים ועשים) 30, Coleoptera (חיפושיות) 16,31, דבוראים (sawfשקרים, צרעות, נמלים ודבורים) 32, פשפשאים (באגים נכון), Isoptera (טרמיטים) 34, Blattodea (ג&#39;וקים) 35, חגבאים (צרצרים, חגבים, ארבה, ו katydids) 36 ו Phthiraptera (כינים) 37. יישום מוצלח של RNAi ספק נתונים תפקודיים ללימודים של דפוסים ב העובר מוקדם (posterior-קדמי ציר 32, ציר-גחון הגבה 28, פילוח 26,38), קביעת הזוויג 39,40, כיטין / לציפורן ביוסינתזה 41, ecdysone איתות 42, התנהגות חברתית 43, ועוד. שיטות RNAi שפותחו עבור מיני חרקים שונים עשויות להועיל נוסף כי הם צפויים להיות שימושיים עבור דברה (הנסקרת ב 44-46). תופעות RNAi תהיינה גן ספציפי כמו גם מינים ספציפיים, כל עוד אזורים שאינם שמורה נבחרים למיקוד. עבור מינים של חרקים מועילים כמו דבורי דבש תולעי משי, מיקוד גנים חיוניים להישרדותו שלוירוסים או טפילים לשלוט הזיהום עלול לספק אסטרטגיה חדשנית להגן על מינים אלה 47,48. Dermestes maculatus (ד maculatus), חיפושית להסתיר השם הנפוץ, מופץ ברחבי העולם למעט אנטארקטיקה. כמו חרק holometabolous, מחזור חי ד maculatus כולל עוברי, זחל, גלמים, ושלבי מבוגר (איור 1). כי זה נזון בשר, ד maculatus משמש במוזיאונים כדי skeletonize חיות מתות חוקרי חרקים משפטיים יכולים להשתמש בו כדי להעריך את זמן המוות 49,50. ד maculatus נזון מוצרים מן החי כוללים פגרים, בשר מיובש, גבינה, ואת הגלמים / פקעות של חרקים אחרים ובכך גורם לפגיעה במשקי בית, מזון מאוחסן, ואת המשי, גבינה, ותעשיות בשר 51,52. החלת RNAi ב חיפושית זו יכולה לספק דרך יעילה וידידותית לסביבה כדי למזער את ההשפעה הכלכלית שלה. המעבדה שלנו השתמשה ד maculatus כמו מ &#39;חדשחרק אודל ללמוד פילוח 53. בנוסף להיותו מקובל גידול במעבדה, ד maculatus הוא עניין למחקר בסיסי כמו זה הינה יזמית ביניים-נבט, מה שהופך אותו זן כדאי ללמוד את המעבר בין קצר ופיתוח-נבט ארוך. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig1.jpg" /> איור 1: מחזור החיים של ד maculatus. תצלומים של ד maculatus בשלבים שונים בחיים, כפי שצוין. מחזור החיים מביצה לבוגר לוקח שלושה שבועות על 30 מעלות צלזיוס אבל כבר בטמפרטורות נמוכות. (A, F) טרי עוברים הניח הם מלבן לצהוב סגלגל בהיר, כ 1.5 מ&quot;מ אורך. העובר לוקח ~ 55 שעות ב 30 מעלות צלזיוס. (B, C ו- G) זחלים יש פסי פיגמנט כהים מכוסים setae. הזחלים לעבור instars מספר בהתאם לסביבה ואורכם יכול להימשך עד מעל 1 ס&quot;מ. (D, H) </strאונג&gt; גלמים צעירים הם צהובים בהירים. ההתגלמות לוקחת ~ 5 - 7 ימים ב 30 מעלות צלזיוס. (E, I) זמן קצר לאחר eclosion, פיגמנטציה כהה מופיעה מעל גוף החיפושית המבוגרת. מבוגרים יכולים לחיות עד מספר חודשים ונקבה אפשר לגולל מאות עוברים במהלך חייה. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> בעבר, הראינו כי RNAi יעיל דריסת תפקוד גן ב ד maculatus 53. הנה הניסיון שלנו לגדל מושבות ד maculatus במעבדה משותף יחד עם צעד-אחר-צעד פרוטוקולים הן עובריים והורית RNAi הגדרת, זריקה, טיפול לאחר ההזרקה, וניתוח פנוטיפי. מציאת גן dsRNA בתיווך ושיטות ניתוח הציגו כאן לא רק לספק מידע מפורט לטיפול שאלות ב ד maculatus, אבל יש גם משמעות פוטנציאל FOr החלת RNAi ב חיפושית שאינם מודל אחר / מיני חרקים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dermestes maculatus live beetles</td>
			<td style="width:140px;">Our lab or Carolina Biological Supply</td>
			<td style="width:119px;">#144168</td>
			<td style="width:167px;">Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wet cat food</td>
			<td style="width:140px;">Fancy Feast</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry dog food</td>
			<td style="width:140px;">Purina Puppy Chow</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Can buy at most pet food and grocery stores</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Insect cage (size medium, 30.5x19x20.3 cm)</td>
			<td style="width:140px;">Exo Terra</td>
			<td>PT2260</td>
			<td>For colony maintenance. Can use larger cage if needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Insect cage (size mini, 17.8x10.2x12.7 cm)</td>
			<td style="width:140px;">Exo Terra</td>
			<td>PT2250</td>
			<td>For embryo collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:140px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89038-968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cotton ball</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">22-456-883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Megascript T7 transcription kit</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td>For 40 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pneumatic pump</td>
			<td style="width:140px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">PV830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Capillary holder</td>
			<td style="width:140px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:140px;">NARISHIGE</td>
			<td style="width:119px;">MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Black filter paper (90 mm)</td>
			<td style="width:140px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">28342-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Food coloring (green)</td>
			<td>McCormick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Borosilicate glass capillary</td>
			<td style="width:140px;">Hilgenberg</td>
			<td style="width:119px;">1406119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Needle puller (micropipette puller)</td>
			<td style="width:140px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope glass slide</td>
			<td>WorldWide Life Sciences Division</td>
			<td style="width:119px;">41351157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sealing film (Parafilm M)</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Model 801 Syringe (10 &#181;l )</td>
			<td style="width:140px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7642-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle (32-gauge)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7762-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fixation Solution (Pampel&#39;s)</td>
			<td>BioQuip Products, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1184C</td>
			<td>Toxic, needs to be handled in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forcep (DUMONT #5)</td>
			<td style="width:140px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cover slip (24X50 mm, No. 1.5)</td>
			<td style="width:140px;">Globe Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1415-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting microscopy for embryo injection</td>
			<td style="width:140px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization</td>
			<td style="width:140px;">Zeiss</td>
			<td colspan="2">SteREO Discover. V12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DIC microscopy</td>
			<td style="width:140px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">AXIO Imager. M1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rearing and double-stranded rna-mediated gene knockdown in the hide beetle, dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

המעבדה של המחברים השתמשה בטכנולוגית RNAi בחקר האבולוציה התפקודית של גני ויסות פילוח בחרקים 53,55. בעוד כל החרקים מפולחים, הגנים המסדירים את התהליך הזה נראה שיש לך התפצלו במהלך וקרינה חרקים 26,38,56-63. מסך גנטי תסיסנית זיהה קבוצה של תשעה גני פילוח זוג-כלל אחראים לקידום ההיווצרות של מגזרי גוף 64-70. כאן, ortholog של אחד הגנים האלה, לזווג (PRD), משמש לתעד את התועלת של RNAi לחקר תפקוד הגנים ד maculatus. eRNAi ו pRNAi היו כל יעיל הוכחת תפקידים Dmac - PRD במבנה המגזר מין זה. 3 - 2 מיקרוגרם / μl של dsRNA שנועד למקד Dmac - PRD (8B הדמוי, 8D ו 8F </strong&gt;) הושווה GFP dsRNA, מוזרק כביקורת שלילית (איורים 8 א, 8 ג ו 8E). בקרת הצאצאים בקעו עם פס פיגמנט אחד לכל קטע. פסי פיגמנט סמוכים היו מופרדים פער בלתי פיגמנט (איור 8 א). לאחר PRD pRNAi, צאצא מושפע בקע עם פסי פיגמנט שכנות התמזגו, גבולות מגזריים מציינים היו פגומים (האיור 8B). בהתאם לחומרת פנוטיפי, בשילובים אחד או כמה אותרו זחלים פגועים. אף על פי כן, בשילובים הופיעו באופן עקבי על אזורי הגבול בין T2 / T3, A1 / A2, A3 / A4, A5 / A6, A7 / A8, המציין זוג-שלטון דמוי פגמים. פנוטיפים לציפורן לאחר מציאת PRD הראו פסד של קטעי בטן כמו גם אורך גוף מקוצר (8D איור). Engrailed (צמוד) מכתים נוגדן בוצע על מנת לבחון פגמים מולקולריים בתחילהעובר לאחר מציאת PRD. בעוד עוברי ביקורת הראו פסים צמודים ביטוי בעצמה שווה בכל מגזר (האיור 8E), ביטוי הצמוד מופחת זוהו פסים חלופיים אצל צאצאיהם מן Dmac-PRD dsRNA מוזרק נקבות (כוכביות באיור 8F). דפוס ביטוי צמוד מופחת עולה בקנה אחד עם הדפוס לציפורן הפגום שנצפה זחלי בקעיו פגועים. לקבלת תוצאות מפורטות יותר של פנוטיפים לאחר מציאת PRD ב ד maculatus ראה שיאנג et al. 2015 53. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig3.jpg" /> איור 3: מכשירי הזרקה. תצלום של המיקרוסקופ לנתיחת micromanipulator המשמש להזרקה עוברית ד maculatus מוצג. אספקת חנקן מחוברת לשקע כניסת לחץ של משאבת פנאומטי. בעל נימי זכוכית מחובר ejecיציאת לחץ t של המשאבה. מתג רגל מחובר המשאבה. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig4.jpg" /> איור 4: תרשים זרימה עבור ד maculatus העוברי RNAi. (AD) איסוף עובר להזרקה. הנקבות מטילות עוברי (כתום) בכדורי צמר גפן (עיגול אפור). עובר נפרד מן כדורי צמר גפן והניחן על גבי פיסת נייר הבנייה שחורה. ברים לבנים מצביעים דמעות כדור צמר גפן. העברה עוברת אל מכסה צלחת פטרי איסוף, מרופד בנייר שחור. (E, F) הזרקת dsRNA לעוברים. יישר עוברים בשקופיות על קלטת מקל כפול ולהזריק אותם בנפרד תחת מיקרוסקופ לנתח. מחט עם צבע מאכל ירוק מוצגת. (GJ) לאחר הזרקת התאוששות incubation. מניחים כדור צמר גפן רטוב בצלחת פטרי לספק לחות. מכסים את צלחת פטרי ועוטפים אותו עם איטום הסרט (תכלת). מניחים את צלחת פטרי באינקובטור ולהסיר הזחלים בקעו לניתוח פנוטיפי. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig5.jpg" /> איור 5: טוב מול דוגמאות הזרקת Bad עובריים. (א) העובר uninjected. (ב) העובר מוזרק עם מעט מדי dsRNA. (ג) העובר מוזרק עם כמות מתאימה של dsRNA. (ד) העובר שבור עם תגלוש dsRNA נגרמת על ידי יתר הזרקה. צבע מאכל התווסף dsRNA לשם ויזואליזציה. (E) דוגמאות של צינורות נימי משך משמשים מחטים להזרקה. הערה אורך להתחדד טיפ fאו שתי דוגמאות של מחטים פונקציונליות. ברי סולם עבור לספירה מייצגת 200 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig6.jpg" /> איור 6: זכר מבוגרים נקבה וגלמים. (א) להציג גחון של גולם זכר. (א &#39;) הגדלה של האחורי חלק א (א&#39;) איור של אברי מין גולם זכר. (ב) לאור הגחון של גולם נקבה. (ב &#39;) הגדלה של החלק האחורי של גלמים ב נקבה יש שתי גבשושיות באברי המין (לבן חיצים). (ב &#39;) איור של אברי מין גולם נקבה. (ג) צפה גחון של גבר בוגר. (ג &#39;) יתגדל לאור בחלק האחורי של ג שם לב מבוגרי זכר יש Trident דמוי איברי מין וכן<html> מבנה עגול דמוי האונה על sternite ה 4 (חיצים לבנים ושחורים, בהתאמה). (ד) צפה גחון של מבוגר נקבה. (ד &#39;) יתגדל לאור בחלק האחורי של ד עבור כל לוחות, מוטות סולם עולה 1 מ&quot;מ. לפרטים ראה שיאנג et al. 2015 53. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig7.jpg" /> איור 7: נקבה במהלך ההזרקה. נקבות מורדמות והניחו בצד עד גחון. מחט לחדור segmacoria בין 2 ו -3 sternites להזריק dsRNA מוצגת. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> EP-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="הספרה 8" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig8.jpg" /> איור 8: פנוטיפים נציג לאחר pRNAi Dmac-PRD. (א) הזרקת בקרה. נוף צדדי של צאצאי pRNAi GFP הסוג פראיים בקעו עם שלושה פרקי חזה ועשרה קטעי בטן. לכל פרק setae ופסי פיגמנט. (ב) עם נוף צדדי של צאצאי pRNAi בקעו PRD. הפער בין פסי שכנות פיגמנט שכותרתו הוא צמצם או חסר לחלוטין. (C) פנוטיפ לציפורן של עובר סוג פראי שליטה שלא נולדה. (ד) פנוטיפ לציפורן של אחד מצאצאיו pRNAi שלא נולדו PRD עם קטעי בטן פחות. (E, F) גזור germband מ: (E) בקרה, GFP pRNAi הביעה צמודה באופן שווה בכל מגזר, (F) PRD pRNAi, ביטוי הצמוד מצטמצם במגזרים חלופיים (כוכביות). לכל חלוניתls, ברי סולם עולים 500 מיקרומטר. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig8large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus at JoVE.com

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגידול חיפושית ביניים-נבט, Dermestes maculatus (ד maculatus) במעבדה. בנוסף, אנחנו משתפים פרוטוקולי RNAi ושיטות עובריים וההורי לניתוח פנוטיפים עובריים ללמוד לתפקד גני מין זה.

התרומם על רגליו אחורי פעמים תקועות מציאת גן בתיווך רנ&quot;א סתר החיפושית,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

rearing-double-stranded-rna-mediated-gene-knockdown-hide-beetle

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

10.5K Views.  University of Maryland.  כאן, אנו מציגים פרוטוקולים לגידול חיפושית ביניים-נבט, Dermestes maculatus (ד maculatus) במעבדה. בנוסף, אנחנו משתפים פרוטוקולי RNAi ושיטות עובריים וההורי לניתוח פנוטיפים עובריים ללמוד לתפקד גני מין זה. 

Video: Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation of gene functions. Their therapeutic potential in the heart can also be determined. There are limited approaches for in vivo molecular intervention in the mouse heart. Recombinant adeno-associated virus (rAAV)-based genome engineering has been utilized as an essential tool for in vivo cardiac gene manipulation. The specific advantages of this technology include high efficiency, high specificity, low genomic integration rate, minimal immunogenicity, and minimal pathogenicity. Here, a detailed procedure to construct, package, and purify the rAAV9 vectors is described. Subcutaneous injection of rAAV9 into neonatal pups results in robust expression or efficient knockdown of the gene(s) of interest in the mouse heart, but not in the liver and other tissues. Using the cardiac-specific TnnT2 promoter, high expression of GFP gene in the heart was obtained. Additionally, target mRNA was inhibited in the heart when a rAAV9-U6-shRNA was utilized. Working knowledge of rAAV9 technology may be useful for cardiovascular investigations.

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

גני הכנת rAAV9 כדי overexpress או מציאת עכבר לבבות

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

לימוד מחזור גנים ביטוי מוסדר על ידי שני פרוטוקולי סינכרון התא

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands for the recognition of RNA sequence and structure. Chemically modified Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers have been recently developed that can recognize RNA duplexes in a sequence-specific manner. PNAs are chemically stable with a neutral peptide-like backbone. PNAs can be synthesized relatively easily by the manual Boc-chemistry solid-phase peptide synthesis method. PNAs are purified by reverse-phase HPLC, followed by molecular weight characterization by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF). Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) technique facilitates the imaging of the triplex formation, because carefully designed free RNA duplex constructs and PNA bound triplexes often show different migration rates. Non-denaturing PAGE with ethidium bromide post staining is often an easy and informative technique for characterizing the binding affinities and specificities of PNA oligomers. Typically, multiple RNA hairpins or duplexes with single base pair mutations can be used to characterize PNA binding properties, such as binding affinities and specificities. 2-Aminopurine is an isomer of adenine (6-aminopurine); the 2-aminopurine fluorescence intensity is sensitive to local structural environment changes, and is suitable for the monitoring of triplex formation with the 2-aminopurine residue incorporated near the PNA binding site. 2-Aminopurine fluorescence titration can also be used to confirm the binding selectivity of modified PNAs towards targeted double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorbance-detected thermal melting experiments allow the measurement of the thermal stability of PNA-RNA duplexes and PNA&#183;RNA2 triplexes. Here, we describe the synthesis and purification of PNA oligomers incorporating modified residues, and describe biochemical and biophysical methods for characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs.

We report the protocols for the synthesis and purification of Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers incorporating modified residues. The biochemical and biophysical methods for the characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs are described.

זיהוי רצף ספציפי, סלקטיבי של גדילי כפול RNAs מעל חד גדילי RNAs על ידי שינוי כימי חומצות גרעין פפטיד

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

ייצור יעיל והסתרות שנוצרו על-ידי זיהוי של CRISPR/Cas9 ג'ין, מערכת מודל רזבורה rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a promising vector for gene therapy application. Here, baculovirus is produced by transient transfection of the baculovirus plasmid DNA (bacmid) in an adherent culture of Sf9 cells. Baculovirus is subsequently expanded in Sf9 cells in a serum-free suspension culture until the desired volume is obtained. It is then purified from the culture supernatant using heparin affinity chromatography. Virus supernatant is loaded onto the heparin column which binds baculovirus particles in the supernatant due to the affinity of heparin for baculovirus envelop glycoprotein. The column is washed with a buffer to remove contaminants and baculovirus is eluted from the column with a high-salt buffer. The eluate is diluted to an isotonic salt concentration and baculovirus particles are further concentrated using ultracentrifugation. Using this method, baculovirus can be concentrated up to 500-fold with a 25% recovery of infectious particles. Although the protocol described here demonstrates the production and purification of the baculovirus from cultures up to 1 L, the method can be scaled-up in a closed-system suspension culture to produce a clinical-grade vector for gene therapy application.

In this protocol, baculovirus is produced by transient transfection of baculovirus plasmid into Sf9 cells and amplified in a serum-free suspension culture. The supernatant is purified by heparin affinity chromatography and further concentrated by ultracentrifugation. This protocol is useful for the production and purification of baculovirus for gene therapy application.

ייצור, טיהור של Baculovirus עבור יישום ריפוי גנטי

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in atherogenesis progression, ischemia, and myocardial infarction. Here we present a methodology of patient genotyping to investigate the post-transcriptional role of the C924T polymorphism (rs4523) situated at the 3&#39; region of the TBXA2 receptor gene. This method relies on DNA extraction from whole blood, polymerase chain reaction (PCR) amplification of the TBXA2 gene portion containing the C924T mutation, and identification of wild type and/or mutant genotypes using a restriction digest analysis, specifically a restriction fragment length polymorphism (RFLP) on agarose gel. In addition, the results were confirmed by sequencing the TBXA2R gene. This method features several potential advantages, such as high efficiency and the rapid identification of the C924T polymorphism by PCR and restriction enzyme analysis. This approach allows a predictive study for plaque formation and atherosclerosis progression by analyzing patient genotypes for the TBXA2R C924T polymorphism. Application of this method has the potential to identify subjects who are more susceptible to atherothrombotic processes, in particular subjects in a high-risk, aspirin-treated group.

In the present study, we describe a methodology to analyze the C924T genotype. The protocol consists of three phases: DNA extraction, amplification by polymerase chain reaction (PCR), and analysis of the restriction fragment length polymorphism (RFLP) on agarose gel.

שיטה ללמוד את פולימורפיזם C924T של הגן לקולטן של Thromboxane A2

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

אפיון שינויים Post-translational שינוי היסטון במודלים ניווניות Proteinopathy שמרים

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...