We thank Drs. Alison Heffer and Yong Lu for setting up the microinjection apparatus and sharing their invaluable knowledge and experience with insect RNAi. This work was supported by the National Institutes of Health (R01GM113230 to L.P.).

The authors have nothing to disclose.

Enquanto um pequeno número de sistemas de modelos sofisticados (ratos, moscas, vermes) foram desenvolvidos durante o século 20, o século 21 tem visto uma onda de novos sistemas animais sendo desenvolvidos em laboratórios de todo o mundo. Estes novos sistemas permitem aos cientistas para abordar questões comparativas, evolutivos que não podem ser sondados utilizando apenas os sistemas de modelo &#39;padrão&#39;. Essa implantação de novos modelos requer o rápido desenvolvimento de métodos para a cultura de laboratório, identificação de genes, e as abordagens funcionais em novas espécies. Aqui, os procedimentos para criação de D. maculatus no laboratório e passo-a-passo protocolos para embrionária RNAi, RNAi parental, e análise fenotípica neste besouro foram apresentados. O objetivo é que essas descrições incentivar outras pessoas a usar D. maculatus em suas próprias experiências e fazer uso das abordagens aqui apresentadas para desenvolver novas espécies modelo adicionais. Enquanto D. maculatus lcolónias ab são incrivelmente fácil de manter, uma limitação da criação desta espécie é o odor desagradável da comida de gato molhado dado aos besouros como a sua fonte de alimento. Para evitar isto, os alimentos alternativos, tais como o pó de soro de leite / proteína de soja, queijo, alimentos para cães chão, e leite em pó, foram testadas com ou sem algodão molhado para alterar humidade. comida de cachorro-do-chão foi a alternativa mais eficaz e pode ser utilizado para a alimentação colônia regular. A sobrevivência foi excelente (&gt; 90%) de ovo a adulto em gaiolas criados em alimentos para cães apenas seco em 80% de umidade relativa, com ou sem algodão molhado acrescentou. No entanto, completando esta dieta com alimentos gato molhado ao coletar ovos para aumentar a fecundidade pode ser necessário ao recolher um grande número de ovos. Se o alimento de cão é usado, comida antiga deve ser removida regularmente, como comida de cachorro condicionado foi encontrado para inibir a postura de ovos 54. Dog croquetes alimentares (KR, os resultados preliminares), cortiça, madeira, papel e outros materiais também podem ser usadas como refúgios 71.Curiosamente, biodegradação de isopor usando larvas mealworm besouro tem sido relatada 72. Portanto, esta foi testada em larvas de D. maculatus. Jovem D. maculatus larvas sobreviveram até a idade adulta com apenas isopor ou materiais que contêm amianto e algodão molhado (dados não mostrados), mas se comer e digerir esses materiais ainda não foi determinado. Este relatório é o primeiro protocolo detalhado para a realização de estudos genéticos funcionais D. maculatus. O uso de ARNi aqui representa uma expansão desta técnica para um novo sistema modelo. Várias observações específicas são dignos de nota no que diz respeito às experiências knockdown RNAi em D. maculatus e outras espécies não-modelo. Em primeiro lugar, para garantir que a RNAi será eficaz em D. maculatus, da mesma estirpe de D. maculatus utilizado aqui deve ser empregue. Há evidências de Tribolium castaneum que diferentes cepas apresentaram variação em RNAi phenotypes 24,73, e fenótipos mutantes muitas vezes mostram a dependência do fundo genético das espécies modelo 74-76. Além disso, há evidências anedóticas para strain-dependência em outros protocolos, incluindo hibridação in situ. Em segundo lugar, o momento adequado de injecção é fundamental para RNAi bem-sucedidas em D. maculatus. Um pouco contraintuitivamente, o segmacoria é mais facilmente penetrada após a cutícula foi completamente sclerotized, pelo menos, dois dias após a eclosão. Portanto, fêmeas virgens 4 - 8 dias após a eclosão deve ser usado. fêmeas mais velhas experimentam fecundidade mais baixa do que as fêmeas recém-eclosed e, portanto, não são apropriadas para injecção. Em terceiro lugar, injetado dsRNA pode ser empurrado para fora pela pressão interna do abdômen feminino. Para minimizar a possibilidade de perder uma grande quantidade de dsRNA após a injeção, segure a agulha no abdômen por ~ 5 segundos após a injecção e depois removê-lo lentamente (6.2.8). Enquanto isso, evite pressionar o abdômen da fêmea durante ou logoapós a injecção. Para contornar resultados tendenciosos causados ​​por este problema, injetar pelo menos 8 fêmeas para cada dsRNA para obter prole suficiente (~ 200 embriões por dia) para a análise fenotípica. Em quarto lugar, alto rendimento de ovo é importante para fornecer dados imparciais para análise fenotípica após a injeção. Em média, cada fêmea D. maculatus produz cerca de 35-55 embriões diária. Produção de ovos depende do tamanho da população, a idade do sexo feminino, a humidade, a disponibilidade de alimentos, temperatura (dados não mostrados), e outros factores ambientais 54. Normalmente, as fêmeas colocam mais a 30 ° C do que a 25 ° C. Em quinto lugar, os embriões não eclodidos podem ser canibalizados por larvas eclodiram. Como larvas eclodidas são geralmente wild-tipo similar ou apenas ligeiramente afectada, enquanto que os embriões não eclodidos são geralmente mais gravemente afectado, este hábito de larvas de D. maculatus podem causar resultados tendenciosos em uma análise fenotípica quantitativa. Portanto, a remoção de larvas eclodidas o mais cedo possível é fortemente recomendado. Nosso laboratório tem se concentrado em D. maculatus segmentação, embora muitos aspectos deste-espécies, incluindo a fisiologia, ecologia e controle de pragas-são de grande interesse. Para estudar a embriogénese e segmentação, uma série de listras pigmentadas no lado dorsal de larvas de D. maculatus pode servir como um marcador natural para o desenvolvimento anormal. Além disso, cerdas característica enraizada nas listras pigmentadas de larvas podem ser utilizados como uma indicação de segmentos. Estas características morfológicas, juntamente com a constatação de que os embriões ligeira ou moderadamente afetados podem sobreviver a eclosão, são vantagens do modelo D. maculatus para estudar os mecanismos envolvidos na padronização do plano básico do corpo. Finalmente, a importância da realização de experiências-incluindo um controlo negativo altamente controlados, tais como dsRNA GFP e testando duas regiões-alvo não sobrepostos para cada gene é essencial para evitar erros de interpretação devido à effecst de injeção de per se e efeitos fora do alvo. Para D. maculatus, 4-6 ug (2 ul de 2 ou 3 mg / mL) ARNcd foram injectadas em cada fêmea e o ARNcd foi de 200-250 pb de comprimento. Valores e outros detalhes do protocolo pode precisar ser otimizado se segmentação genes funcionam mais tarde no desenvolvimento ou em diferentes processos fisiológicos / metabólicas. Descobertas anteriores mostraram que os efeitos de RNAi pode ser transmitido às gerações posteriores além da geração F1 em C. elegans 15. Uma minoria de larvas eclodidas D. maculatus com defeitos de segmentação devido a RNAi pode sobreviver até a idade adulta e pode se reproduzir. Experimentos preliminares não revelaram defeitos óbvios na geração F2. Estudos futuros poderão revelar efeitos transgeracionais de RNAi nesta espécie.

Em 1998, Fire and Mello relatado que o RNA de cadeia dupla (ARNcd) pode induzir a inibição da função do gene em Caenorhabditis elegans 1. Esta resposta desencadeada por ARNdc foi denominado ARN de interferência (RNAi), e tal silenciamento de genes mediada por ARNi foi relatado para ser conservado em animais, plantas, fungos e 2-7. Em alguns animais e plantas, as funções de ARNi sistemicamente, o que significa que o efeito pode espalhar a outras células / tecidos onde ARNcd não é introduzida directamente (revisto em 8-10). Os cientistas fizeram uso desta resposta RNAi celular endógeno através da concepção de dsRNAs para alvejar genes de interesse, batendo assim, reduzir a função do gene, sem manipular diretamente o genoma (revisto em 11-14). RNAi é uma poderosa ferramenta para estudos funcionais devido às seguintes vantagens. Em primeiro lugar, mesmo com informação da sequência do gene mínimo, um gene pode ser alvejado usando RNAi. Isto é especialmente importante para rudies de organismos não-modelo que faltam dados genômicos ou transcriptomic. Em segundo lugar, em organismos em que a resposta é robustamente ARNi sistémica, RNAi mediada por silenciamento de genes pode ser realizado em praticamente qualquer estágio de desenvolvimento. Este recurso é muito útil para estudar a função de genes pleiotrópicos. Em terceiro lugar, em alguns casos, os efeitos de ARNi para espalhar as gónadas e descendência, tais fenótipos que são observadas em prole 15,16. Este fenómeno, conhecido como parental RNAi (pRNAi), é especialmente vantajoso para os genes que afetam o desenvolvimento embrionário, tão numerosos descendentes produzidos por um único pai injetada podem ser examinados sem manipulação direta de ovos. Por estas razões, pRNAi é o método de escolha. No entanto, se pRNAi é ineficaz, por exemplo, para os genes necessários para a oogénese, então embrionário RNAi (eRNAi) deve ser usado. Em quarto lugar, o RNAi pode ser utilizado para gerar o equivalente a uma série de alelos em que a quantidade de ARNcd entregues pode ser variada ao longo de uma gama para produzir fraco para defeitos fortes. Tal gradação de fenótipos podem ser úteis para a compreensão da função do gene quando o gene está envolvido num processo complexo e / ou perda completa da função é letal. Em quinto lugar, a entrega de dsRNA é geralmente fácil e viável, especialmente em animais que mostram robustos respostas RNAi sistémicos. dsRNA pode ser introduzido por microinjeção 1,5, alimentação / ingestão 17,18, imersão, 19,20 e vírus / entrega de bactérias mediadas 21,22. Em sexto lugar, ao contrário de alguns genes métodos de segmentação / edição, não há necessidade para triagem de organismos portadores da mutação ou para realizar cruzamentos genéticos para gerar homozigotos ao usar RNAi. Portanto, em comparação com muitas outras técnicas para o estudo da função dos genes, RNAi é rápido, barato, e pode ser aplicado para telas de grande escala 23-25. A ampla utilidade de RNAi fornece meios para realizar estudos funcionais em uma ampla gama de organismos, ampliando a gama de espécies disponíveis para estudo beyond os sistemas de modelos tradicionais para as quais foram desenvolvidas ferramentas genéticas. Por exemplo, estudos usando sistemas não-modelo são obrigados a dar insights sobre a evolução de genes e redes de genes, comparando as funções de ortólogos de espécies que representem os diferentes modos de desenvolvimento ou exibindo características morfológicas distintas 26-29. Estes tipos de estudos irá proporcionar uma melhor compreensão da diversidade biológica, com impactos para a pesquisa aplicada e básica. Sendo o maior grupo de animais no planeta, insetos fornecem uma grande oportunidade para explorar os mecanismos diversidade subjacente. Além disso, os insetos são geralmente pequenos, têm ciclos de vida curtos, alta fecundidade, e são fáceis de criar em laboratório. Nas últimas duas décadas, RNAi tem sido aplicado com sucesso em insetos abrangendo encomendas, incluindo Diptera (moscas verdadeiras) 5, Lepidoptera (borboletas e mariposas) 30, Coleoptera (besouros) 16,31, Hymenoptera (Sawfmentiras, vespas, formigas e abelhas) 32, Hemiptera (percevejos), Isoptera (cupins) 34, Blattodea (baratas) 35, Orthoptera (grilos, gafanhotos, gafanhotos e gafanhotos) 36 e Phthiraptera (piolhos) 37. Aplicação bem sucedida de RNAi forneceu dados funcionais para estudos de padronização na embriogênese precoce (eixo ântero-posterior 32, eixo dorso-ventral 28, segmentação 26,38), a determinação do sexo 39,40, quitina / cutícula biossíntese 41, ecdisona sinalização 42, comportamento social 43, e muito mais. ARNi métodos desenvolvidos para diferentes espécies de insectos pode ser um benefício adicional na medida em que eles são susceptíveis de serem úteis para o controlo de pragas (revisto em 44-46). efeitos de RNAi será tão bem como específicas de espécies específicas de gene, enquanto regiões não conservados são escolhidos para segmentação. Para as espécies de insetos benéficos como abelhas e bichos da seda, tendo como alvo genes vitais para a sobrevivência devírus ou parasitas para controlar a infecção pode proporcionar uma nova estratégia para proteger estas espécies 47,48. Dermestes maculatus (D. maculatus), nome comum hide besouro, é distribuído em todo o mundo, exceto na Antártida. Como um inseto holometabolous, o ciclo de vida D. maculatus inclui embrionário, larval, pupal e estágios adultos (Figura 1). Porque se alimenta de carne, D. maculatus é usado em museus para esqueletizar animais mortos e entomologistas forenses podem usá-lo para estimar o tempo de morte 49,50. D. maculatus alimenta de produtos de origem animal, incluindo carcaças, carne seca, queijo e as pupas / casulos de outros insetos e, assim, provoca danos às famílias, alimentos armazenados, e a seda, queijo e indústrias de carne 51,52. Aplicando RNAi neste besouro poderia fornecer uma maneira eficiente e ambientalmente amigável para minimizar o seu impacto económico. Nosso laboratório tem usado D. maculatus como um novo modelo inseto para estudar segmentação 53. Além de ser passível de criação do laboratório, D. maculatus é de interesse para a investigação fundamental, pois é um desenvolvedor intermediário de germes, tornando-se uma espécie úteis para estudar a transição entre o curto eo desenvolvimento a longo germe. <img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig1.jpg" /> Figura 1: Ciclo de Vida de D. maculatus. Fotografias de D. maculatus em diferentes fases da vida, como indicado. O ciclo de vida de ovo a adulto demora três semanas a 30 ° C, mas mais tempo em temperaturas mais baixas. (A, F) de embriões recentemente estabelecidas são de cor branca a amarelo claro e oval, aproximadamente 1,5 mm de comprimento. Embriogênese leva ~ 55 h a 30 ° C. (B, C e G) As larvas têm listras escuras pigmentados e são cobertas com cerdas. As larvas passam por vários estádios, dependendo do ambiente e seu comprimento pode estender-se a mais de 1 cm. (D, H) </strong&gt; pupas jovens são a luz amarela. Pupation leva ~ 5 - 7 dias a 30 ° C. (E, I) Logo após a eclosão, pigmentação escura aparece sobre o corpo adulto besouro. Os adultos podem viver até vários meses e uma fêmea pode colocar centenas de embriões sobre sua vida. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Anteriormente, mostramos que a RNAi é eficaz para derrubar a função do gene em D. maculatus 53. Aqui a nossa experiência criação de colônias de D. maculatus em laboratório é compartilhada junto com o passo-a-passo protocolos para ambos embrionário e parental RNAi set-up, injeção, cuidados pós-injeção, e análise fenotípica. O knockdown e métodos de análise de genes dsRNA mediadas introduzidas aqui não só fornecer informações detalhadas para abordar questões em D. maculatus, mas também têm potencial relevância for aplicação de RNAi em outros não-modelo besouro / espécies de insetos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dermestes maculatus live beetles</td>
			<td style="width:140px;">Our lab or Carolina Biological Supply</td>
			<td style="width:119px;">#144168</td>
			<td style="width:167px;">Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wet cat food</td>
			<td style="width:140px;">Fancy Feast</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry dog food</td>
			<td style="width:140px;">Purina Puppy Chow</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Can buy at most pet food and grocery stores</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Insect cage (size medium, 30.5x19x20.3 cm)</td>
			<td style="width:140px;">Exo Terra</td>
			<td>PT2260</td>
			<td>For colony maintenance. Can use larger cage if needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Insect cage (size mini, 17.8x10.2x12.7 cm)</td>
			<td style="width:140px;">Exo Terra</td>
			<td>PT2250</td>
			<td>For embryo collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:140px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89038-968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cotton ball</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">22-456-883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Megascript T7 transcription kit</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td>For 40 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pneumatic pump</td>
			<td style="width:140px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">PV830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Capillary holder</td>
			<td style="width:140px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:140px;">NARISHIGE</td>
			<td style="width:119px;">MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Black filter paper (90 mm)</td>
			<td style="width:140px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">28342-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Food coloring (green)</td>
			<td>McCormick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Borosilicate glass capillary</td>
			<td style="width:140px;">Hilgenberg</td>
			<td style="width:119px;">1406119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Needle puller (micropipette puller)</td>
			<td style="width:140px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope glass slide</td>
			<td>WorldWide Life Sciences Division</td>
			<td style="width:119px;">41351157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sealing film (Parafilm M)</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Model 801 Syringe (10 &#181;l )</td>
			<td style="width:140px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7642-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle (32-gauge)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7762-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fixation Solution (Pampel&#39;s)</td>
			<td>BioQuip Products, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1184C</td>
			<td>Toxic, needs to be handled in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forcep (DUMONT #5)</td>
			<td style="width:140px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cover slip (24X50 mm, No. 1.5)</td>
			<td style="width:140px;">Globe Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1415-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting microscopy for embryo injection</td>
			<td style="width:140px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization</td>
			<td style="width:140px;">Zeiss</td>
			<td colspan="2">SteREO Discover. V12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DIC microscopy</td>
			<td style="width:140px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">AXIO Imager. M1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rearing and double-stranded rna-mediated gene knockdown in the hide beetle, dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Laboratório dos autores tem utilizado tecnologia de RNAi para estudar a evolução funcional dos genes que regulam a segmentação em insetos 53,55. Enquanto todos os insetos são segmentadas, os genes que regulam este processo parecem ter divergido durante radiações insetos 26,38,56-63. Telas genéticos em Drosophila identificou um conjunto de nove genes de segmentação par de regras que são responsáveis por promover a formação de segmentos corporais 64-70. Aqui, o ortólogo de um destes genes, emparelhado (PRD), é usada para documentar o utilitário de ARNi para estudar a função de genes em D. maculatus. eRNAi e pRNAi foram cada eficaz em demonstrar papéis para dmac - prd na formação segmento nesta espécie. 2-3 ug / ul de ARNcd concebido para orientar DMAC - prd (Figuras 8B, 8D e 8F </strong&gt;) foi comparada com ARNcd de GFP, injectadas como controlo negativo (Figuras 8A, 8C e 8E). Controle prole chocado com uma faixa pigmentada por segmento. As listras pigmentadas vizinhos foram separadas por um intervalo de não-pigmentadas (Figura 8A). Após pRNAi prd, prole afetada chocado com listras pigmentadas vizinhos fundidos, indicando limites segmentares estavam com defeito (Figura 8B). Dependendo da gravidade fenotípica, uma ou várias fusões foram detectados em larvas afectada. No entanto, as fusões de forma consistente apareceu nas regiões limítrofes entre T2 / T3, A1 / A2, A3 / A4, A5 / A6, A7 / A8, indicando defeitos pair-rule-like. Fenótipos cutícula após knockdown prd mostrou perda de segmentos abdominais, bem como o comprimento do corpo encurtado (Figura 8D). Engrailed (En) de coloração de anticorpo foi realizada para analisar defeitos moleculares em precoceembriões após knockdown prd. Enquanto embriões de controle mostrou listrado En expressão com igual intensidade em todos os segmentos (Figura 8E), reduzida expressão En foi detectado em listras alternadas em prole de DMAC-prd dsRNA injetado fêmeas (asteriscos na Figura 8F). O padrão de expressão En reduzida é consistente com o padrão de cutícula com defeito observado em larvas eclodidas afetada. Para resultados mais detalhados dos fenótipos após knockdown prd em D. maculatus, consulte Xiang et al. 2015 53. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig3.jpg" /> Figura 3: Injecção Aparelho. Fotografia do microscópio de dissecação e micromanipulador usada para injetar embriões D. maculatus é mostrado. fornecimento de azoto é ligado à porta de entrada de pressão de uma bomba pneumática. titular capilar de vidro, é ligada ao ejecporta de pressão t da bomba. interruptor de pé é conectado à bomba. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig3large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig4.jpg" /> Figura 4: um fluxograma para D. maculatus Embryonic RNAi. (AD) Recolha embriões para injecção. As fêmeas colocam embriões (laranja) em bolas de algodão (círculo cinza). embriões separados de bolas de algodão e deixá-los cair sobre um pedaço de papel de construção preto. As barras brancas indicam lágrimas em bola de algodão. Transferência de embriões para uma tampa placa de Petri coleta, forradas com papel preto. (E, F) Injecção de dsRNA em embriões. Alinhar embriões em lâminas em fita dupla pau e injetá-las individualmente sob um microscópio de dissecação. Agulha com corante alimentar verde é mostrado. (GJ) Pós-injeção de recuperação e incubção. Coloque uma bola de algodão molhado na placa de Petri para fornecer umidade. Cubra o prato Petri e envolvê-la com vedação filme (azul claro). Colocar a placa de Petri num incubador e remover larvas eclodidas para análise fenotípica. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig4large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig5.jpg" /> Figura 5: Good vs Bad embrionárias Exemplos de injeção. Embrião (A) não injectado. (B) de embriões injectados com muito pouco dsRNA. (C) de embriões injectados com a quantidade adequada de ARNcd. (D) embrião quebrado com transbordante dsRNA causado pelo excesso de injeção. Corante alimentar foi adicionado ao ARNcd para visualização. (E) Exemplos de tubos capilares puxados utilizados na forma de agulhas de injecção. Observe o cone e o comprimento da ponta fou dois exemplos de agulhas funcionais. Barras de escala para AD representam 200 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig5large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig6.jpg" /> Figura 6: Macho e fêmea adultos e pupas. (A) vista ventral de uma pupa masculino. &quot;Ampliação da parte posterior do A. (A&quot;) Ilustração da genitália pupa masculino. (B) vista ventral de uma pupa do sexo feminino. (B (A) &#39;) Ampliação da parte posterior B. Feminino pupas ter dois papilas genitais (branca setas). (B &quot;) Ilustração da genitália pupa feminino. (C) vista ventral de um macho adulto. (C &#39;) de visualização ampliada da parte posterior da C. Note-se que os adultos do sexo masculino têm genitália e uma como tridente-estrutura circular lobo-like no dia 4 esternito (setas brancas e negras, respectivamente). (D) vista ventral de um adulto do sexo feminino. (D &#39;) de visualização ampliada da parte posterior D. Para todos os painéis, barras de escala indicam 1 mm. Para mais detalhes, consulte Xiang et al. 2015 53. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig6large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig7.jpg" /> Figura 7: A fêmea durante a injeção. As fêmeas são anestesiados e colocados ventral para cima. Uma agulha penetrar as segmacoria entre a 2ª e 3ª sternites para injetar dsRNA é mostrado. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig7large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Figura 8: Phenotypes Representante, após pRNAi dmac-prd. Injecção (A) de controlo. Vista lateral de um tipo selvagem, como GFP pRNAi prole chocado com três segmentos torácicos e dez segmentos abdominais. Cada segmento tem cerdas e listras pigmentadas. (B) Visão lateral de uma prole pRNAi prd chocado. O fosso entre listras pigmentadas vizinhos rotulados é reduzida ou completamente ausente. Fenótipo (C) cutícula de um selvagem controle unhatched embrião tipo-like. Fenótipo (D) cutícula de uma prole prd unhatched pRNAi com menos segmentos abdominais. (E, F) dissecado germband de: (E) de controle, GFP pRNAi manifestou uniformemente En em todos os segmentos, (F) expressão pRNAi, En prd é reduzida em segmentos alternados (asteriscos). Por tudo painells, barras de escala indicam 500 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig8large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus at JoVE.com

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Aqui, apresentamos os protocolos de criação de um besouro intermediário de germes, Dermestes maculatus (D. maculatus) no laboratório. Também compartilhamos protocolos de RNAi embrionário e parental e métodos para análise de fenótipos embrionárias para estudar a função de genes nesta espécie.

Criação e Double-stranded mediada por RNA silenciamento de genes na Esconder Beetle,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

rearing-double-stranded-rna-mediated-gene-knockdown-hide-beetle

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

10.5K visualizações.  University of Maryland.  Aqui, apresentamos os protocolos de criação de um besouro intermediário de germes, Dermestes maculatus (D. maculatus) no laboratório. Também compartilhamos protocolos de RNAi embrionário e parental e métodos para análise de fenótipos embrionárias para estudar a função de genes nesta espécie. 

Vídeo: Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

Medição paralela da expressão do gene relógio circadiano e hormonal secreção em culturas de células primárias humanas

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Genética

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation of gene functions. Their therapeutic potential in the heart can also be determined. There are limited approaches for in vivo molecular intervention in the mouse heart. Recombinant adeno-associated virus (rAAV)-based genome engineering has been utilized as an essential tool for in vivo cardiac gene manipulation. The specific advantages of this technology include high efficiency, high specificity, low genomic integration rate, minimal immunogenicity, and minimal pathogenicity. Here, a detailed procedure to construct, package, and purify the rAAV9 vectors is described. Subcutaneous injection of rAAV9 into neonatal pups results in robust expression or efficient knockdown of the gene(s) of interest in the mouse heart, but not in the liver and other tissues. Using the cardiac-specific TnnT2 promoter, high expression of GFP gene in the heart was obtained. Additionally, target mRNA was inhibited in the heart when a rAAV9-U6-shRNA was utilized. Working knowledge of rAAV9 technology may be useful for cardiovascular investigations.

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

Preparação de rAAV9 para superexpressão ou Knockdown Genes em mouse Corações

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

Estudo da Expressão de Genes Reguladores do Ciclo Celular por dois Protocolos Complementares de Sincronização Celular

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands for the recognition of RNA sequence and structure. Chemically modified Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers have been recently developed that can recognize RNA duplexes in a sequence-specific manner. PNAs are chemically stable with a neutral peptide-like backbone. PNAs can be synthesized relatively easily by the manual Boc-chemistry solid-phase peptide synthesis method. PNAs are purified by reverse-phase HPLC, followed by molecular weight characterization by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF). Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) technique facilitates the imaging of the triplex formation, because carefully designed free RNA duplex constructs and PNA bound triplexes often show different migration rates. Non-denaturing PAGE with ethidium bromide post staining is often an easy and informative technique for characterizing the binding affinities and specificities of PNA oligomers. Typically, multiple RNA hairpins or duplexes with single base pair mutations can be used to characterize PNA binding properties, such as binding affinities and specificities. 2-Aminopurine is an isomer of adenine (6-aminopurine); the 2-aminopurine fluorescence intensity is sensitive to local structural environment changes, and is suitable for the monitoring of triplex formation with the 2-aminopurine residue incorporated near the PNA binding site. 2-Aminopurine fluorescence titration can also be used to confirm the binding selectivity of modified PNAs towards targeted double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorbance-detected thermal melting experiments allow the measurement of the thermal stability of PNA-RNA duplexes and PNA&#183;RNA2 triplexes. Here, we describe the synthesis and purification of PNA oligomers incorporating modified residues, and describe biochemical and biophysical methods for characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs.

We report the protocols for the synthesis and purification of Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers incorporating modified residues. The biochemical and biophysical methods for the characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs are described.

Reconhecimento de sequência específica e seletivo de RNAs Double-stranded sobre Single-stranded RNA por modificados quimicamente ácidos nucleicos de peptídeo

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

Produção eficiente e identificação de CRISPR/Cas9 gerado pelo Gene nocautes no sistema modelo Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a promising vector for gene therapy application. Here, baculovirus is produced by transient transfection of the baculovirus plasmid DNA (bacmid) in an adherent culture of Sf9 cells. Baculovirus is subsequently expanded in Sf9 cells in a serum-free suspension culture until the desired volume is obtained. It is then purified from the culture supernatant using heparin affinity chromatography. Virus supernatant is loaded onto the heparin column which binds baculovirus particles in the supernatant due to the affinity of heparin for baculovirus envelop glycoprotein. The column is washed with a buffer to remove contaminants and baculovirus is eluted from the column with a high-salt buffer. The eluate is diluted to an isotonic salt concentration and baculovirus particles are further concentrated using ultracentrifugation. Using this method, baculovirus can be concentrated up to 500-fold with a 25% recovery of infectious particles. Although the protocol described here demonstrates the production and purification of the baculovirus from cultures up to 1 L, the method can be scaled-up in a closed-system suspension culture to produce a clinical-grade vector for gene therapy application.

In this protocol, baculovirus is produced by transient transfection of baculovirus plasmid into Sf9 cells and amplified in a serum-free suspension culture. The supernatant is purified by heparin affinity chromatography and further concentrated by ultracentrifugation. This protocol is useful for the production and purification of baculovirus for gene therapy application.

Produção e purificação de Baculovirus para aplicação de terapia gênica

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in atherogenesis progression, ischemia, and myocardial infarction. Here we present a methodology of patient genotyping to investigate the post-transcriptional role of the C924T polymorphism (rs4523) situated at the 3&#39; region of the TBXA2 receptor gene. This method relies on DNA extraction from whole blood, polymerase chain reaction (PCR) amplification of the TBXA2 gene portion containing the C924T mutation, and identification of wild type and/or mutant genotypes using a restriction digest analysis, specifically a restriction fragment length polymorphism (RFLP) on agarose gel. In addition, the results were confirmed by sequencing the TBXA2R gene. This method features several potential advantages, such as high efficiency and the rapid identification of the C924T polymorphism by PCR and restriction enzyme analysis. This approach allows a predictive study for plaque formation and atherosclerosis progression by analyzing patient genotypes for the TBXA2R C924T polymorphism. Application of this method has the potential to identify subjects who are more susceptible to atherothrombotic processes, in particular subjects in a high-risk, aspirin-treated group.

In the present study, we describe a methodology to analyze the C924T genotype. The protocol consists of three phases: DNA extraction, amplification by polymerase chain reaction (PCR), and analysis of the restriction fragment length polymorphism (RFLP) on agarose gel.

Um método para estudar o polimorfismo C924T do Gene do Receptor tromboxano A2

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Caracterizando a histona modificação pós-traducional alterações nos modelos de Neurodegenerative Proteinopathy de levedura

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...