We thank Drs. Alison Heffer and Yong Lu for setting up the microinjection apparatus and sharing their invaluable knowledge and experience with insect RNAi. This work was supported by the National Institutes of Health (R01GM113230 to L.P.).

D. maculatus 1. Yetiştirme NOT: D. maculatus bir üreme kolonisi yetişkinler kullanan yazarların laboratuarında kurmak ve larva ticari satın alındı. Türler kimlik DNA barkodu 53 kullanılarak doğrulanmıştır. <ol><li> Laboratuvarda yeni bir kafes kurmak için, bir orta boy böcek kafes (30.5 x 19 x 20.3 cm 3) içine talaş ince bir tabaka yayıldı. Pupa devresi için larva gizlemek izin kafes içinde strafor bir ~ 10 x 6 x 3 cm 3 yığın yerleştirin. 50 böcekleri (yetişkin veya geç dönem larva ya) - 20 ekleyin. Böcekleri talaş içinde gizler. </li><li> Petri kabı veya bir tartı tekne ıslak kedi maması ekleyin. örgü bezle kafes örtün ve bir kuluçka kafesine yerleştirin. </li><li> Laboratuvarda bir üreme kolonisi korumak için, 25 ve 30 ° C arasında sıcaklığını ayarlamak. D. maculatus hızlı yüksek sıcaklıklarda büyür, ama bu da mantar ve parazitlerinin büyümesini destekler. Bir iyileşmek sağlamak içinhızla koloni genişletilmesi için düzenli stok bakım ve 30 ° C 28 ° C - senin koloni, 25 kullanın. Yaşam döngüsü çevresel faktörlerin 50 (Şekil 2) bağlı dört ay yaklaşık üç hafta sürer. </li></ol><img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig2.jpg" /> Şekil 2: D. maculatus Lab Colony. Tipik bir D. maculatus böcek kafes Fotoğraf gösterilir. Ahşap talaşı böcekleri gizlemek izin yayılır. Kedi maması küçük bir Petri çanağı veya tartım kabı ilave edilir. Strafor pupa son evre larvaları için bir sığınak olarak kafes yerleştirilir. Burada gösterilen kafes 30.5 x 19 x 20,3 cm 3 ve birkaç yüz larva, pupa ve yetişkin ev sahipliği yapmaktadır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="4"><li> otlakolgun kafeste yumurta ettik. , Koloni genişletmek yukarıdaki gibi, larva veya yetişkin (Bölüm 2 açıklandığı gibi toplanan) yumurta ile yeni kafeslerin kurmak. D. maculatus özellikle gıda kaynağına yakın, kafes boyunca yumurtalarını. </li><li> haftada iki kez hakkında ıslak kedi maması değiştirin. NOT: Islak kedi maması nahoş koku, alternatif gıda kaynakları da test edildi dolayı (Tartışma). </li></ol> 2. Embriyo Koleksiyon <ol><li> Bir koleksiyon kurmak için, en az 50 erkek ve koloniden 50 kadın ayırın. Genç yetişkinler en iyisidir. Talaş olmadan küçük boyutlu kafes (17.8 x 10.2 x 12.7 cm 3) yerleştirin yetişkinler. Bir tartı tekne kedi maması ekleyin. </li><li> toplama başlamadan önce, mevcut herhangi bir embriyolar için dikkatli kafes kontrol edin ve bunları kaldırın. kafesin içine bir gergin pamuk koyun ve 30 ° C inkübatör kafesi bırakın. Uygun zaman penceresi sonra, pamuk embriyo toplama için hazır olacak. </li><li> Katyarısında siyah inşaat kağıt (A4 boyutunda) bir parça bir kırışık oluşturabilir ve sonra açılmak. </li><li> kafes uzanan pamuk çıkarın. pamuk gelen yetişkin çıkarın ve kafes içine geri koyun. </li><li> çok yavaşça gergin pamuk sıkarken, yumurta, siyah kağıda düşürdüm ince pamuklu iplikler halinde ayrı yavaşça gözyaşı. NOT: D. maculatus embriyolar pamuk görmek kırılgan ve sert. Çok sıkı bir pamuk topu tutan eğer kolayca ezilebilir. </li></ol> 3. dsRNA Hazırlık <ol><li> DsRNA Sentezi için DNA şablonu hazırlama <ol><li> 4 başlat - her ikisi de 5 de T7 hızlandırıcı sekanslar ihtiva eden primerler kullanılarak 6 50 ul PCR reaksiyonları &#39;üreticinin protokolüne uygun olarak, DNA şablonu amplifiye edilmesi için sona erer. </li><li> imalatçının talimatları izlenerek bir ticari bir PCR saflaştırma kiti kullanılarak PCR ürünü saflaştırmak. DNA örneğinin ideal nihai konsantrasyonu ≥ olduğunu100 ng / ml. </li></ol></li><li> Enjeksiyon Tampon hazırlanması <ol><li> Enjeksiyon tamponu 100 ml hazırlama (0.1 mM NaH 2 PO 4, 5 mM KCI). 5 M NaOH ile 6.8&#39;e pH ayarlayın. </li><li> -20 ° C&#39;de saklayın alikotları. </li></ol></li><li> dsRNA sentezi <ol><li> ~ Reaksiyon başına 500 ng şablon kullanılarak, buz üzerinde 0.2 mi PCR tüpü içinde reaksiyonu başlatacak ve imalatçının talimatları izlenerek, T7 polimeraz, bir in vitro transkripsiyon reaksiyonu yürütmek. </li><li> gece boyunca 37 ° C&#39;de tüp inkübe edin. </li><li> üreticinin talimatlarına aşağıdaki DNaz DNA şablonu, sindirmek. </li><li> 94 ° C&#39;ye kadar tüp ısı ve 3 dakika boyunca 94 ° C&#39;de tutun. </li><li> Bu 1 saat sonra 45 ° C&#39;ye ulaşana kadar dsRNA tavlanması için yavaşça 1 ° C / dk, boruyu soğutulur. NOT: 3.3.5 ile 3.3.2 PCR yapılabilir adımlar. </li><li> dsRNA çökelti etanol, 280 ulReaksiyonun RNaz içermeyen su için 20 ul 300 ul bir son hacme kadar ayarlayın. 3 M NaOAc (pH 5.2) ve etanol içinde 650 | il 30 ul ekle. bir gecede -20 ° C derin dondurucuda tüp yerleştirin. </li><li> 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca 15.682 x g&#39;de santrifüj işleminden geçirilmesinden sonra,% 70 etanol ile dsRNA pelet yıkayın. Kuru pelet ve enjeksiyon tampon ul 20 içinde çözülür. </li><li> 260 bir spektrofotometre kullanılarak dsRNA&#39;nın konsantrasyonu ölçümü. 5 ug / ul - İdeal konsantrasyon 3&#39;tür. 30 dakika süre ile 90 V bir% 1 agaroz jeli üzerinde dsRNA 1:25 seyreltme 5 ul çalıştırarak kalitesini kontrol edin. beklenen boyutta tek bir bant kolaylıkla görülebilir. </li><li> -20 ° C veya altında dsRNA saklayın. NOT: Her RNAi demonte deney için, çalışılan süreci etkilemesi beklenmektedir olmaz bir denetim dsRNA içerir. GFP dsRNA çoğu deneyler için mükemmel bir kontroldür. Hazırlayın ve experime kontrol dsRNA yan yana enjektental dsRNA&#39;nın. </li></ol></li></ol> Mikropüskürtücü ve Mikromanipülatör 4. Montaj NOT: Şekil 3 bakınız. <ol><li> pnömatik pompa aracının basınç girişine azot veya diğer hava kaynağını bağlayın. pnömatik pompa mevcut değilse, ince boru bağlı bir 50 ml şırınga ile basınç uygulanır. </li><li> çıkarma basınç akışını kontrol etmek için pompanın uzaktan konnektörüne bir ayak anahtarı bağlayın. </li><li> tüp ile pompanın çıkarma basınç portuna bir cam kılcal tutucu takın. </li><li> Bir mikroskop yakın bir mikromanipülatör kılcal tutucu sabitleyin. </li></ol> 5. Embriyonik RNAi Not: Şekil 4, D. maculatus embriyonik RNAi bir akış şemasını göstermektedir. <ol><li> eRNAi hazırlanması <ol><li> Petri kabı kapağı (90 mm çapında) toplama bir embriyo hazırlayın. c siyah filtre bir parça kağıt yerleştirinKapağın iç bitti. siyah kağıt üzerinde standart bir mikroskop lamı koyun. </li><li> Enjeksiyon tamponu ile uygun bir konsantrasyona kadar dsRNA seyreltilir. İlk deneyler için 3 ug / ul - 2 kullanın. Her zaman enjeksiyondan önce buz üzerinde dsRNA tutun. </li><li> iyice karıştırın dsRNA ve pipet yavaşça birkaç kez 01:40 seyreltme gıda boyası ekleyin. </li></ol></li><li> Enjeksiyon için toplanıyor Embriyolar NOT: 25 ° C&#39;de, embriyoların 6 çekirdekleri - 8 saat Yumurta Döşeme sonra (AEL) 53 çevre yumurtaya doğru göç ederler. 10 saat AEL 53 - Bir hücresel blastoderm 8 içinde kurulmuştur. 3 saat AEL embriyolar kullanım 53 için önerilen - sağlamak için hücresel blastoderm aşamasında önce embriyolar 0, enjeksiyon için kullanılır. cam kapilerleri iyi durumda olup olmadığını Embriyo toplama, hazırlama ve enjeksiyon genellikle az 2 saat sürebilir. Bu nedenle, tüm süreç 5 saat AEL içinde tamamlanabilir. <ol><li> adımlarda açıklandığı gibi embriyolar toplayın 2.2-2.5. </li><li> Petri kabı kapağı toplama içine embriyo transferine siyah inşaat kağıt dokunun. </li><li> slayt kenarı boyunca çift taraflı bant yapıştırın. </li><li> Bir boya fırçası kullanarak, kenarında anterior ve posterior ucu ile slayt kenarına dik kasete embriyolar hizalayın. ortalama yarım ideal arka sonunda enjekte edilecektir böylece üzerinde, erken embriyo anterior ve posterior uçları kolayca ayırt olmadığını unutmayın. </li></ol></li><li> Kılcal cam içine dsRNA yükleniyor <ol><li> 20 ul Microloader pipet içine dsRNA 4 ul - 2 alın. </li><li> önceden çekilmiş cam boru içine ucu takın (iğne olarak da adlandırılır) ve yavaşça kapiller dsRNA solüsyonu pipetle. Mikropipet çektirmenin kullanarak ticari cam kılcal damarlardan iğneler hazırlayın. İdeal çekilmiş iğnenin bir örneği Şekil 5&#39;te gösterilmektedir. uzunluğu ve iğne konik af optimize edilmesi gerekebilirter enjeksiyon denemeleri. </li><li> kılcal cam tutucu içine cam kapiller sabitleyin. </li><li> mikromanipülatör içine kılcal tutucu monte edin. </li></ol></li><li> Embriyolar içine dsRNA enjekte <ol><li> Dikkatle diseksiyon mikroskobu sahneye embriyolar ile slayt aktarın. </li><li> alan ve odak mikroskop merkezine bir embriyo getirmek için slayt taşıyın. </li><li> mikroskop içine bakarken mikromanipülatör ile kılcal ucu yerleştirin. satırdaki ilk embriyonun sonuna yakın ucu getir. </li><li> azot ya da diğer hava beslemesini açın. </li><li> vakum selenoid giriş seçme anahtarını ayarlayın. </li><li> 15 psi - 10 çıkarma basınç regülatörü ayarlayın. aparat bağlı basıncını ayarlayın. </li><li> Gerekirse kılcal açın. ucu açık olduğunda, renkli dsRNA çözüm ucu dolduracaktır. </li><li> e delinme ileri kılcal ucu Taşımbryo. Basınç ayarı idealdir ise, hiçbir embriyonik sıvı kılcal akacaktır. </li><li> çözümün uygun bir miktar çıkarılana dek embriyo içine dsRNA çözüm çıkarmak için ayak anahtarı Adım. Çözümün uygun ve uygun olmayan miktarlarda enjekte edildikten sonra Şekil 5 embriyo morfolojisi örneklerini gösterir. </li><li> ~ 2 saniye embriyo içinde kılcal ucu tutun ve sonra çıkarın. </li><li> Bir sonraki embriyonun kılcal hareket ettirin ve tekrar 5.4.8 adımları - tüm embriyolar enjekte kadar 5.4.10. Tıkanmış veya sonları alırsa cam kapiller değiştirin. </li></ol></li><li> Enjeksiyon sonrası kurtarma ve Kuluçka <ol><li> Enjeksiyondan sonra, bir Petri kabındaki slayt yerleştirin. </li><li> Petri kabı ıslak pamuk ekleyin. pamuk slayt dokunmasına izin vermeyin. </li><li> Petri kabı Kapak ve filmi sızdırmazlık ile sarın. Enjekte dsRNA, konsantrasyon, tarih, saat, sayısı ve adı ile çanak Etiketembriyolar. </li><li> Embriyoların yumurtadan kadar 30 ° C inkübatör Petri kabı yerleştirin. </li></ol></li></ol> 6. Ebeveyn RNAi <ol><li> PRNAi için Pupalar Ayırma <ol><li> koloniden pupa toplayın. </li><li> Sıralama erkek ve mikroskop altında dişi pupa (Şekil 6). Resim birleşme enjeksiyondan önce cereyan etmesini sağlamak üzere 30 ° C kuluçka makinesi içinde, iki ayrı bir Petri tabaklarına tutun. </li><li> eclosed yetişkinler için her gün kontrol edin. 30 ° C &#39;de 7 gün - pupa devresi, genellikle 5 alır. </li><li> Aktarım eclosed erkek ve kadın iki ayrı Petri kapları (Şekil 6) ve enjeksiyon için hazır olana kadar her gün onları kedi maması yem. </li><li> Yeterince kadın ve uygun yaşta erkek var bir kez enjeksiyon geçin. post-eclosion Dişiler 4 ila 8 gün en iyisidir. Tipik bir analiz için 8-12 kadın kullanılmaktadır. Erkeklerin eşit sayıda 54 çiftleşme için gereklidir. </li></ol></li&gt; <li> Kadın Karın içine dsRNA enjekte <ol><li> buz (5.1.2 ve 5.1.3) üzerinde dsRNA hazırlayın. </li><li> 10 ul şırıngaya 32 gauge iğne takın. </li><li> CO 2 sahnede kadın Anesteziyoloji. </li><li> herhangi bir hava almadan enjektöre dsRNA çözüm yükleyin. </li><li> Bir yandan bir kadın ventral tarafı yukarı tutun ve diğer şırınga tutun. </li><li> Yavaşça iğne ucu ile sternites 2 ve 3 arasında segmacoria (membran) nüfuz eder. Şekil 7, enjeksiyon sırasında bir dişi göstermektedir. İğne kolaylıkla dokuya nüfuz etmezse, açı iğne yukarı ve yavaş yavaş aşağı doğru bastırın. vücuda iğne yaklaşık 2 mm yerleştirin. </li><li> yavaş yavaş dişi başına ~ 2 ul enjekte dalgıç iterken şırınga ölçeğini kontrol edin. </li><li> enjekte ettikten sonra, dişinin karın çıkarmadan önce en az 5 saniye boyunca hareketsiz iğne tutun. </li><li> (Petri kabı enjekte kadın aktarın90 mm çap) ve kedi maması ile beslenirler. </li><li> dsRNA adı, enjekte edilen miktarın, tarih ve dişilerin sayısı ile Petri kabı etiketleyin. </li></ol></li><li> Enjeksiyon sonrası kurtarma ve Çiftleşme <ol><li> 30 ° C inkübatör Petri kabı kuluçkaya yatmaktadır. </li><li> 24 saat sonra, transfer mini kafese kadın enjekte edilmiştir. </li><li> Kafesin uninjected genç erkeklerin eşit sayıda ekleyin ve kafesi etiketleyin. </li><li> kafesin içine kedi maması ile tartı tekne ekleyin. </li><li> birleşmesine olanak tanımak için 30 ° C kuluçka makinesi içinde kafes bırakın. 24 saat sonra, dişiler yumurtalarını bırakmak için başlamalı ve embriyolar günlük veya gerekli zaman aralıklarında alınabilir. </li></ol></li></ol> 7. Fenotipik Analizi sonra RNAi NOT: yumurta 50 yumurtadan 30 ° C&#39;de, o ~ 55 saat sürer. <ol><li> eRNAi Canlılık Analizi <ol><li> toplam nu için yumurtadan larva sayısını karşılaştırarak ambar oranını hesaplamakenjekte edilen embriyoların mber. embriyolar zarar veya enjeksiyon prosedürü tarafından öldürülen edilebilir bir negatif kontrol enjeksiyonu dahil emin olun. % 60 - Tipik ambar oranları% 30 arasında değişmektedir. çıkmamış yumurta yeme yumurtadan larva sakının. </li></ol></li><li> pRNAi Canlılık Analizi NOT: kadın canlılığı RNAi tarafından hedeflenen gen tarafından etkilenirse, dişiler belirli dsRNA enjekte değil negatif kontrol dsRNA ölmeye başlayacak. yumurta üretimi veya yumurtlama etkilenirse, dişiler kısmi veya tam kısırlığa sergileyecek. negatif kontrollere kıyasla kadın yaşamını Puan ya da deney ve kontrol kadın (7.2.3) tarafından atılmıştır yumurta sayısını karşılaştırın. <ol><li> Adım 2.2 Aşağıdaki embriyo toplama ayarlayın. </li><li> 2,5-24 saat sonra, adım 2.4 Aşağıdaki embriyolar toplar. </li><li> embriyo sayısını saymak. </li><li> 90 mm petri embriyoların transferi. embriyoların hedeflenen gen, toplama tarihi ve numarası ile Petri kabı etiketleyin. </li&gt; <li> onlar yumurtadan kadar 30 ° C inkübatör embriyolar kuluçkaya yatmaktadır. çıkmamış embriyolar üzerinde yumurtadan larva besleme yana, forseps (Tartışma) kullanılarak çıkmamış embriyolardan Petri kabı sık sık ve ayrı yumurtadan larva kontrol edin. </li><li> yumurtadan embriyoların sayısını ve ambar oranını hesaplamak. </li></ol></li><li> Yumurtadan larva içinde Kütikül Kusur incelenmesi <ol><li> 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde Yumurtadan Çıkmış Larvalarına toplayın. </li><li> Bir duman başlığı içinde, sabitleme çözeltisi 1 ml. </li><li> Çözelti larva doku nüfuz için en az bir gece süreyle 4 ° C&#39;de mikrosantrifüj tüpü terk. </li><li> görselleştirmek için, mümkün olduğu kadar tüpten kadar fiksatif çıkarın. </li><li> PBST ile durulayın larva en az üç kez. </li><li> PBST sonu olmayan bir P-1000 pipet kullanarak bir çok kuyu cam plaka Transfer larva bunu genişletmek için kesti. </li><li> bir mikroskop altında, kusurları incelemek için forseps kullanarak larva germek. bent sabitleştirici vücutları sözleşme olarak kusurları incelemek için larva germek için kritik öneme sahiptir. </li></ol></li><li> Çıkmamış Larva içinde Kütikül Kusur incelenmesi Not: Bu prosedür özellikle kuluçka için hayatta olmayan embriyolar için, erken embriyonik fenotip incelenmesi için yararlıdır. <ol><li> pRNAi için Petri kabı (7.2.4) içine PBST ekleyin ve son kesti ile P-1000 pipet kullanarak 1.5 ml mikrosantrifüj tüp çıkmamış embriyolar transfer. eRNAi için mikroskop lamı kapalı Petri kabındaki (5.5.4), fırça çıkmamış embriyoların içine PBST ekleyin ve bir mikrosantrifüj tüp aktarabilirsiniz. </li><li> Sabitleme Çözümü ile embriyolar Fix ve adımları 7.3.2 Aşağıdaki görselleştirme PBST ile durulayın - 7.3.6. </li><li> forseps kullanarak, PBST bir mikroskop altında yumurta kabuğu dışarı embriyolar incelemek. </li><li> Lütfen bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü (• Her bir tüp içinde embriyo 200 ul) embriyoların transferi. </li><li> kadar sol kaldırmümkün Katkı. </li><li> % 90 Laktik asit /% 10 EtOH 1 ml ilave edilir. En az gece boyunca 60 ° C&#39;lik bir kuluçka makinesi içinde santrifüj tüpü boş. Not: Embriyolar birkaç gün boyunca 60 ° C &#39;de bırakılabilir. </li><li> embriyolar monte etmek için, uç kesti ile P-1000 pipet kullanarak bir mikroskop lamı üzerine onları pipetle. </li><li> El ile ideal bir yönelime forseps ile embriyoların yerleştirin. </li><li> Bir kapak kayma ile embriyolar Kapak ve DIC kullanarak mikroskop altında görselleştirmek. </li></ol></li><li> Hücresel ve Moleküler Hataları incelenmesi Not: Bu yordam manikür kusurları eşlik etmez manikür fenotipleri veya letalitesinin yatan nedenleri araştırmak için yararlıdır. <ol><li> pRNAi için uygun gelişim aşamasında pamuk topları ayrı embriyolar ve embriyo toplama sepet içine aktarabilirsiniz. Toplama sepeti, aynı veya Drosophila embriyo koleksiyonları için kullanılana benzer olabilir. <ol><li> Yapmakkaldırıldı şişenin dibinde ile 25 ml&#39;lik plastik sintilasyon flakon yumurta sepeti ve kapağın (kabaca 1 cm çapında) dışında bir daire kesilmiş. süper ince bir daire kapağının iç çapı yaklaşık 2.5 cm örgü yerleştirin ve ardından parıldama ampulünün vida ve baş aşağı kullanın. </li><li> Embriyolar yıkanır sonra ağ kolayca çıkarılabilir de, örgü yapışma bir embriyo kurtarma su ile mikrosantrifüj tüpü içinde örgü bırakın. </li></ol></li><li> eRNAi için, uygun bir aşamada, bir Petri kabı PBST ekleyin. mikroskop lamı kapalı embriyolar fırçalayın ve bir embriyo toplama sepeti aktarabilirsiniz. NOT: Fiksasyon, in situ hibridizasyon, antikor boyama ve nükleer boyanma protokolleri Xiang vd bulunabilir. 2015 53. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Gelişmiş model sistemler (fareler, sinekler, solucanlar) az sayıda 20. yüzyılda geliştirilen iken, 21. yüzyılın yeni hayvan sistemlerinin bir dalga tüm dünyada laboratuvarlarında geliştirilen gördü. Bu yeni sistemler bilim yalnızca &#39;standart&#39; modeli sistemleri kullanılarak tanınacak olamaz karşılaştırmalı evrimsel soruları için izin verir. yeni modellerin Bu dağıtım laboratuvar kültürleme, gen tanımlama ve yeni türlerde fonksiyonel yaklaşımları yöntemleri hızla geliştirilmesini gerektirmektedir. Burada, laboratuar ve embriyonik RNAi, ebeveyn RNAi ve bu böceği fenotipik analizi için adım adım protokoller D. maculatus yetiştirilmesi için prosedürler sunuldu. Amaç bu açıklamaları kendi deneylerinde D. maculatus kullanmak ve ek yeni model türler geliştirmek için burada sunulan yaklaşımların faydalanmak için başkalarını teşvik olmasıdır. D. maculatus l ikenab kolonileri korumak için son derece kolay olan bu tür yetiştirme bir sınırlama gıda kaynağı olarak böcekleri verilen ıslak kedi maması hoş olmayan koku olduğunu. Bunu önlemek için, bu tür peynir altı suyu / soya protein tozu, peynir, zemin köpek maması ve süt tozu gibi alternatif gıdalar, nem değiştirmek için veya ıslak pamuk olmadan test edildi. Zemin köpek maması en etkili bir alternatif oldu ve düzenli koloni besleme için kullanılabilir. Survival ile veya ıslak pamuk eklendi olmadan,% 80 bağıl nem sadece kuru köpek maması yetiştirilen kafeslerde yumurtadan yetişkine kadar (&gt;% 90) mükemmel oldu. Yumurta çok sayıda toplama Ancak, doğurganlığı artırmak için yumurta toplama ıslakken kedi maması ile bu diyet ilave gerekebilir. Köpek maması kullanılırsa durumunu köpek maması 54 yumurtlama inhibe ettiği bulunmuştur gibi görünüyor, ama, düzenli olarak temizlenmesi gerekmektedir. 71 Sığınma olarak Köpek maması tanecikleri (KR, ön sonuçlar), mantar, ahşap, kağıt ve diğer malzemeler de kullanılabilir.İlginçtir, Strafor mealworm böceği larvaları kullanılarak biyodegradasyon 72 rapor edilmiştir. Bu nedenle, bu D maculatus larvaları için test edildi. Genç D. maculatus larvaları sadece strafor veya asbest içeren madde ve ıslak pamuk ile yetişkinliğe kadar hayatta (veriler gösterilmemiştir) ama yedikleri ve bu malzemeleri sindirmek olup olmadığı belirlenmelidir kalır. Bu rapor D. maculatus fonksiyonel genetik çalışmalar yürütüyoruz ilk ayrıntılı bir protokoldür. RNAi kullanımı burada yeni bir model sistemine bu tekniğin bir genişleme gösterir. Çeşitli özel gözlemler D. maculatus ve diğer non-modeli türlerinde RNAi demonte deneyleri ile ilgili dikkate değerdir. İlk olarak, RNAi D. maculatus, istihdam edilmelidir Burada kullanılan D. maculatus aynı suşu etkili olacağını garanti etmek. Kanıt farklı suşlar RNAi p değişim göstermektedir ki Tribolium castaneum gelen varhenotypes 24,73, ve mutant fenotipleri genelde model türlerinin 74-76 genetik arka plan bağımlılığı göstermektedir. Ayrıca, in situ hibridizasyon dahil olmak üzere diğer protokoller zorlanma-bağımlılık için anekdot kanıtlar mevcuttur. İkinci olarak, enjeksiyon, uygun zamanlama D maculatus başarılı RNAi için önemlidir. manikür tamamen en az iki gün eclosion sonra, sklerize sonra biraz Sezgilere, segmacoria en kolay nüfuz eder. Bu nedenle, 4 bakire dişi - 8 gün eclosion sonra kullanılmalıdır. Yaşlı kadın, yeni eclosed kadınlara göre daha düşük doğurganlığını deneyim ve böylece enjeksiyon için uygun değildir. Üçüncü olarak, dsRNA kadın karın iç basıncı ile dışarı itti alabilirsiniz enjekte. enjeksiyondan sonra dsRNA büyük miktarda kaybetme olasılığı en aza indirmek için, (6.2.8), enjeksiyondan sonra ~ 5 saniye için karın iğne tutun ve daha sonra yavaş yavaş çıkarın. Bu arada, sırasında veya hemen dişinin karın basmamakenjeksiyondan sonra. Her dsRNA (günlük ~ 200 embriyolar) yeterli yavrular elde etmek için fenotipik analiz için en az 8 kadın enjekte bu sorundan kaynaklanan yanlı sonuçlar aşmak için. Dördüncü olarak, yüksek yumurta verimi enjeksiyonundan sonra fenotipik analizi için tarafsız verilerini sağlamak için önemlidir. Ortalama olarak, her D. maculatus kadın günde yaklaşık 35-55 embriyolar üretir. Yumurta verimi popülasyon boyutu, bir kadın, yaş, nem, gıda temini, sıcaklık (veriler gösterilmemiştir) ve diğer çevresel faktörlere 54 bağlıdır. Genellikle, dişiler 25 ° C den 30 ° C &#39;de daha ayrıntılı yatmaktadır. Beşinci olarak, çıkmamış embriyolar yumurtadan larva ile cannibalized edilebilir. Çıkmamış embriyolar genellikle daha ağır etkilenen ise yumurtadan larva olarak, genellikle yabani tip benzeri veya sadece hafif etkilenen, D. maculatus larvaları bu alışkanlık bir nicel fenotipik analizi önyargılı sonuçlara neden olabilir. Bu nedenle, mümkün olduğunca erken yumurtadan larva çıkarılması şiddetle tavsiye edilir. Pek çok açıdan bu türün dahil fizyoloji, ekoloji ve haşere büyük ilgi kontrolünü-olmasına rağmen bizim laboratuvar, D. maculatus segmentasyon odaklanmıştır. Embriyogenezis ve segmentasyon çalışmaları için, D. maculatus larvaların sırt tarafında koyu pigmentli çizgili bir dizi anormal gelişimi için doğal bir belirteç olarak hizmet verebilir. Ayrıca, larvaların pigmentli şeritlerindeki köklü özelliği kıl bölümlerinin bir gösterge olarak kullanılabilir. Bu morfolojik özellikleri, birlikte hafif ya da orta derecede etkilenen embriyolar kuluçka için hayatta bulgu ile, temel vücut planı desenlendirme katılan mekanizmaları incelemek için D. maculatus modelinin avantajları vardır. Son olarak, son derece kontrollü deneyler dahil bir negatif kontrol gibi GFP dsRNA olarak yürütülmesi ve her biri için iki örtüşmeyen hedef bölgelerini test önemi nedeniyle effec için yanlış yorumlanmasından kaçınmak için kritik gen-isbaşına enjeksiyon ts ve hedef dışı etkileri. D. maculatus 4 - ug 6 dsRNA (2 ya da 3 mg / ml 2 ul), her bir kadın içine enjekte edilmekte ve dsRNA bp uzunlukta 200-250 idi. Tutarlar ve protokol diğer ayrıntıları geliştirme veya farklı fizyolojik / metabolik süreçlerde daha sonra işleyen genleri hedef ise optimize edilmesi gerekebilir. Önceki keşifler C. F1 nesil 15 elegans ötesinde RNAi etkileri sonraki nesillere aktarılabilir gösterdi. RNAi nedeniyle segmentasyon defektleri ile yumurtadan D. maculatus larvaları bir azınlık yetişkinliğe kadar hayatta ve üretebilir. Ön deneyler F2 neslinde bariz kusurları ortaya çıkarmak için başarısız oldu. Gelecekteki çalışmalar bu türlerde RNAi nesiller etkilerini ortaya çıkarabilir.

1998, yangın ve Mello çift zincirli RNA (dsRNA) Caenorhabditis elegans 1 gen işlevinin engellenmesi uyarabilir bildirmiştir. DsRNA ile tetiklenen Bu yanıt bir RNA interferans (RNAi) olarak adlandırılmıştır, ve RNAi aracılı gen susturma hayvan, bitki ve mantar 2-7 korunmuş olduğu bildirilmiştir. Bitkiler ve bazı hayvanlarda, RNAi fonksiyonları sistemik, yani etkisi (8-10 gözden) dsRNA doğrudan tanıtıldı değil diğer hücre / dokulara yayılabilir. Bilim adamları, böylece doğrudan (11-14 gözden) genomu manipüle etmeden gen fonksiyonu aşağı vurma, ilgi genleri hedef dsRNAs tasarlayarak bu endojen hücresel RNAi tepkisinin kullanımı yaptık. RNAi aşağıdaki avantajları nedeniyle fonksiyonel çalışmalar için güçlü bir araçtır. İlk olarak, daha az gen sekansı bilgileri ile bir gen RNAi kullanılarak hedeflenebilir. Bu st için özellikle önemlidirgenomik veya transkriptomik verileri eksik olmayan model organizmaların udies. İkinci olarak, RNAi yanıtı sağlam sistemik organizmalarda, RNAi aracılı gen yok etme hemen hemen herhangi bir gelişme aşamasında gerçekleştirilebilir. Bu özellik, pleitropik genlerin işlevini çalışmak için çok yararlıdır. Üçüncü olarak, bazı durumlarda, RNAi etkileri fenotipleri yavrular 15,16 görülmektedir, öyle ki gonadlar ve soyu, yayıldı. Tek bir enjekte ebeveyn tarafından üretilen çok sayıda yavru yumurta doğrudan manipülasyonu olmadan muayene edilebilir ebeveyn RNAi (pRNAi) olarak bilinen bu fenomen, embriyonik gelişmeyi etkileyen genler için özellikle avantajlıdır. Bu nedenlerden dolayı, pRNAi tercih edilen bir yöntemdir. pRNAi etkisiz, ancak oogenez için gerekli olan genlerin, örneğin, daha sonra embriyonik RNAi (eRNAi) kullanılmalıdır. Dördüncü olarak, RNAi mutlaka kusurlar zayıf üretilmesi için dsRNA miktarı aralığında değişebilir teslim edilen bir alelik dizi eşdeğer oluşturmak için kullanılabilir. fenotipleri Böyle bir derece geni ölümcül bir kompleks süreci ve / veya fonksiyon tam kaybı söz konusu olduğunda gen fonksiyonu anlamak için yararlı olabilir. Beşinci olarak, dsRNA teslim özellikle sağlam sistemik RNAi yanıtları gösteren hayvanlarda genellikle kolay ve mümkündür. dsRNA mikroenjeksiyon 1,5, beslenme / yutma 17,18, ıslatma, 19,20 ve virüs / bakteri aracılı teslim 21,22 sokulabilir. Altıncı, bazı gen hedefleme / düzenleme yöntemlerin aksine, mutasyonu taşıyan organizmalar için ekrana veya RNAi kullanırken homozigotlarını üretmek için genetik haçlar yürütmek için gerek yoktur. Bu nedenle, gen fonksiyonu incelemek için pek çok teknikler ile karşılaştırıldığında, RNAi ucuz, hızlı ve büyük ölçekli ekranlar 23-25 için uygulanabilir. RNAi geniş bir kullanım Beyon çalışma için uygun türlerin yelpazesini genişleterek, organizmaların geniş bir fonksiyonel çalışmalar yapmak için bir araç sağlarGenetik araçlar geliştirilmiştir olan geleneksel model sistemler d. Örneğin, sigara modeli sistemleri kullanılarak çalışmalar farklı gelişim modları temsil veya farklı morfolojik özellikler 26-29 sergileyen türlerden ortologlarda işlevlerini karşılaştırarak genler ve gen ağlarının evrimi anlayışlar vermek zorundadırlar. Bu tür çalışmalar uygulamalı ve temel hem de araştırma için etkileri olan, biyolojik çeşitliliğin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır. Gezegendeki en büyük hayvan grubunda olmak, böcekler mekanizmaları altta yatan çeşitliliğini keşfetmek için büyük bir fırsat sağlamaktadır. Ayrıca, böcekler, genellikle küçük, kısa yaşam döngüleri, yüksek doğurganlığını var ve laboratuarda arka kolaydır. Son yirmi yılda, RNAi başarıyla Diptera (gerçek sinekler) 5, Lepidoptera (Kelebekler) 30 olmak üzere, emirleri kapsayan böceklerde tatbik edilmiştir, Coleoptera (böcekleri) 16,31, Hymenoptera (sawfyalan, Arı, karınca ve arılar) 32, Hemiptera (gerçek böcek), Isoptera (termitler) 34, Blattodea (hamamböceği) 35, Orthoptera (cırcır, çekirge, çekirgeler ve çekirgeler) 36 ve Phthıraptera (bitler) 37. RNAi başarılı bir uygulama, ekdison 42 sinyalizasyon, erken embriyogenez desenleme çalışmaları için fonksiyonel verileri (ön-arka eksen 32, dorsal-ventral eksen 28, segmentasyon 26,38), cinsiyet tayini 39,40, kitin / manikür biyosentezini 41 sağladı sosyal davranış 43, ve daha fazlası. Farklı böcek türleri için geliştirilmiş RNAi yöntemler de (44-46 gözden) haşere kontrolü için yararlı olması muhtemeldir ki ek bir fayda olabilir. RNAi etkileri olmayan korunmuş bölgeler hedefleme için seçilen sürece, gene özel ve türe özgü olacaktır. yaşaması için hayati genleri hedef bal arıları ve ipek böceği gibi yararlı böcek türlerinin, içinenfeksiyon kontrol etmek için virüs veya parazitler bu türlerin 47,48 korumak için yeni bir strateji sağlayabilir. Dermestes maculatus (D. maculatus), ortak adı gizlemek böceği, Antarktika hariç tüm dünyada dağıtılır. Bir holometabolous böcek gibi, D. maculatus yaşam döngüsü embriyonik larva, pupa ve erginleri (Şekil 1) içerir. O eti beslenir, çünkü D. maculatus ölü hayvanları iskeletini için müzelerde kullanılan ve adli entomologlar ölüm 49,50 zamanını tahmin etmek için kullanabilirsiniz. D. maculatus gövdeleriçin, kurutulmuş et, peynir ve pupa / diğer böceklerin koza de dahil olmak üzere hayvansal ürünlerde beslenir ve böylece hane zarar, depolanmış gıda ve ipek, peynir ve et endüstrileri 51,52 neden olur. Bu böceği de RNAi uygulayarak ekonomik etkisini en aza indirmek için etkin ve çevre dostu bir şekilde sağlayabilir. Bizim laboratuvar, yeni bir m olarak D. maculatus kullandıodel böcek segmentasyonu 53 incelemek için. O kısa ve uzun mikrop gelişimi arasındaki geçişi incelemek için kullanışlı bir tür yapma, bir ara-germ geliştiricisi olarak laboratuvar yetiştirme mükellef olmasının yanı sıra, D. maculatus temel araştırmalar için ilgi çekicidir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig1.jpg" /> Şekil 1: D. maculatus Yaşam Döngüsü. Belirtildiği gibi farklı yaşam evrelerinde D. maculatus Fotoğraf,. yetişkine yumurtadan ömrü daha düşük sıcaklıklarda, üç ila 30 ° C &#39;de hafta ama daha uzun sürer. (A, K) Yeni bırakılmış embriyolar yaklaşık olarak boyuna 1.5 mm, açık sarı ve oval beyazdır. Embriyo ~ 30 ° C &#39;de 55 saat sürer. (B, C ve G) Larva koyu pigmentli çizgili ve kıl ile kaplıdır. Larva 1 üzerinde cm&#39;ye kadar uzatabilirsiniz çevre ve uzunluklarına bağlı olarak birkaç instars geçmesi. (D, H) </strong&gt; Genç pupa sarı ışık bulunmaktadır. 30 ° C &#39;de 7 gün - pupa devresi ~ 5 alır. Kısa bir süre eclosion sonra (E, ben), koyu pigmentasyon yetişkin böceği vücut üzerinde görünür. Yetişkin birkaç ay kadar yaşayabilir ve bir kadın yaşamı boyunca embriyo yüzlerce düzenleyebilirsiniz. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Daha önce, RNAi D. maculatus 53 gen fonksiyonunu aşağı vurma etkili olduğunu göstermiştir. İşte laboratuvarda D. maculatus kolonileri yetiştirme deneyim embriyonik ve ebeveyn hem RNAi set-up, enjeksiyon, enjeksiyon sonrası bakım ve fenotipik analizi için adım-adım protokolleri ile birlikte paylaşılır. Burada tanıtılan dsRNA aracılı gen demonte ve analiz yöntemleri D. maculatus soruları ele almak için ayrıntılı bilgi sağlar, fakat aynı zamanda fo potansiyel öneme sahip değilr olmayan diğer modeli böceği / böcek türlerinde RNAi uygulamak.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="642">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dermestes maculatus live beetles</td>
			<td style="width:140px;">Our lab or Carolina Biological Supply</td>
			<td style="width:119px;">#144168</td>
			<td style="width:167px;">Our lab strain was verified by COI barcoding; strain variation from Carolina cannot be ruled out</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Wet cat food</td>
			<td style="width:140px;">Fancy Feast</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Chunks of meat with gravy. Can buy at most pet food and grocery stores</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dry dog food</td>
			<td style="width:140px;">Purina Puppy Chow</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Can buy at most pet food and grocery stores</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Insect cage (size medium, 30.5x19x20.3 cm)</td>
			<td style="width:140px;">Exo Terra</td>
			<td>PT2260</td>
			<td>For colony maintenance. Can use larger cage if needed</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Insect cage (size mini, 17.8x10.2x12.7 cm)</td>
			<td style="width:140px;">Exo Terra</td>
			<td>PT2250</td>
			<td>For embryo collection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dish</td>
			<td style="width:140px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">89038-968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cotton ball</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">22-456-883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Megascript T7 transcription kit</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td>For 40 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pneumatic pump</td>
			<td style="width:140px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;">PV830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Capillary holder</td>
			<td style="width:140px;">WPI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:140px;">NARISHIGE</td>
			<td style="width:119px;">MN-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Black filter paper (90 mm)</td>
			<td style="width:140px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">28342-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Food coloring (green)</td>
			<td>McCormick</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Borosilicate glass capillary</td>
			<td style="width:140px;">Hilgenberg</td>
			<td style="width:119px;">1406119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Needle puller (micropipette puller)</td>
			<td style="width:140px;">Sutter Instrument Co.</td>
			<td style="width:119px;">P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microscope glass slide</td>
			<td>WorldWide Life Sciences Division</td>
			<td style="width:119px;">41351157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sealing film (Parafilm M)</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-374-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Model 801 Syringe (10 &#181;l )</td>
			<td style="width:140px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7642-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Needle (32-gauge)&#160;</td>
			<td style="width:140px;">Hamilton</td>
			<td style="width:119px;">7762-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fixation Solution (Pampel&#39;s)</td>
			<td>BioQuip Products, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1184C</td>
			<td>Toxic, needs to be handled in fume hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Forcep (DUMONT #5)</td>
			<td style="width:140px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cover slip (24X50 mm, No. 1.5)</td>
			<td style="width:140px;">Globe Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1415-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Eppendorf Femtotips Microloader pipette tip</td>
			<td style="width:140px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">E5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting microscopy for embryo injection</td>
			<td style="width:140px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dissecting microscopy for larval phenotypic visualization</td>
			<td style="width:140px;">Zeiss</td>
			<td colspan="2">SteREO Discover. V12</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DIC microscopy</td>
			<td style="width:140px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">AXIO Imager. M1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rearing and double-stranded rna-mediated gene knockdown in the hide beetle, dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative without tools to study gene function. The development and sharing of detailed protocols for the establishment of new model systems in laboratories, and for tools to carry out functional studies, is thus crucial for leveraging the power of genomics. Coleoptera (beetles) are the largest clade of insects and occupy virtually all types of habitats on the planet. In addition to providing ideal models for fundamental research, studies of beetles can have impacts on pest control as they are often pests of households, agriculture, and food industries. Detailed protocols for rearing and maintenance of D. maculatus laboratory colonies and for carrying out dsRNA-mediated interference in D. maculatus are presented. Both embryonic and parental RNAi procedures-including apparatus set up, preparation, injection, and post-injection recovery-are described. Methods are also presented for analyzing embryonic phenotypes, including viability, patterning defects in hatched larvae, and cuticle preparations for unhatched larvae. These assays, together with in situ hybridization and immunostaining for molecular markers, make D. maculatus an accessible model system for basic and applied research. They further provide useful information for establishing procedures in other emerging insect model systems.

Yazarların laboratuar böcekler 53,55 yılında segmentasyon düzenleyen genlerin fonksiyonel evrimini incelemek için RNAi teknolojisini kullandı. Tüm böcekler Parçalara edilirken, bu süreci düzenleyen genlerin böcek radyasyonlar 26,38,56-63 sırasında ayrılmaktadır görünmektedir. Drosophila genetik ekranlar vücut segmentlerinin 64-70 oluşumunu teşvik sorumludur dokuz çift-kural segmentasyon genlerinin bir dizi belirledi. Burada, bu genlerin birinin ortologu, eşleştirilmiş (PRD), D. maculatus gen fonksiyonu incelemek için RNAi yararını belge için kullanılır. Bu türün segment oluşumunda PRD - eRNAi ve pRNAi her DMAC için roller gösteren etkili olmuştur. 2 - PRD (Şekil 8B, 8D ve 8F - dsRNA&#39;nın 3 ug / ml DMAC hedeflemek için tasarlanmış </strong&gt;)) negatif kontrol (Şekil 8A, 8C ve 8E olarak enjekte GFP dsRNA ile karşılaştırılmıştır. Kontrol yavru segmentinde başına bir pigmente şerit ile yumurtadan. Komşu pigmentli çizgili pigmentsiz bir boşluk (Şekil 8A) ile ayrılmıştır. Prd pRNAi sonra, etkilenen yavrular belirten segmental sınırları (Şekil 8B) kusurlu olduğu, erimiş komşu pigmentli çizgili yumurtadan. fenotipik şiddeti, bir veya birden fazla füzyon bağlı olarak, etkilenen larva tespit edilmiştir. Bununla birlikte, füzyonları sürekli çift-kural-benzeri kusurları belirten T2 arasındaki sınır bölgelerinde / T3, A1 / A2, A3 / A4, A5 / A6, A7 / A8 çıktı. Prd demonte sonra manikür fenotipleri karın segmentleri kaybını yanı sıra kısaltılmış vücut uzunluğu (Şekil 8D) gösterdi. Engrailed (En) antikor boyama erken moleküler kusurları incelemek amacıyla yapılmıştırprd demonte sonra embriyolar. Kontrol embriyolar her kesimden (Şekil 8E) eşit yoğunlukta ifade En çizgili gösterdi ederken, azaltılmış En ifade kadın (Şekil 8F de yıldız) DMAC-prd dsRNA&#39;dan yavruların alternatif çizgili enjekte tespit edildi. indirgenmiş En ifade deseni etkilenen yumurtadan larva gözlenen hatalı üst deri deseni ile tutarlıdır. D. maculatus içinde prd demonte sonra fenotipleri daha detaylı sonuçlar için, Xiang ve ark bakın. 2015 53. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/54976/54976fig3.jpg" /> Şekil 3: Enjeksiyon cihaz. D. maculatus embriyoların enjekte etmek için kullanılan diseksiyon mikroskobu ve mikromanipülatör Fotoğraf gösterilir. Azot kaynağı pnömatik pompa basınç giriş portuna bağlanır. Cam kılcal tutucu ejec bağlıPompanın t basınç noktası. Ayak pedalı pompasına bağlanır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/54976/54976fig4.jpg" /> Şekil 4: D. maculatus Embriyonik RNAi için Akış Şeması. Enjeksiyon için embriyolar Toplama (AD). Dişiler pamuk topları embriyolar (turuncu) (gri daire) yatıyordu. pamuk topları ayrı embriyolar ve onları siyah inşaat kağıt parçası üzerine bırakalım. Beyaz barlar pamuk gözyaşları göstermektedir. siyah kağıt ile kaplı bir toplama Petri kabı kapağı embriyo transferi. Embriyolar içine dsRNA enjekte (E, F). çift ​​sopa kasete slaytlar üzerinde embriyolar hizalayın ve bir mikroskop altında tek tek onları enjekte. yeşil gıda boyası ile iğne gösterilmiştir. (GJ) Post-enjeksiyon kurtarma ve inkubasyontirme. nem sağlamak için Petri kabındaki ıslak pamuk yerleştirin. Petri kabı Kapak ve filmi (açık mavi) sızdırmazlık ile sarın. bir kuluçka Petri kabı yerleştirin ve fenotipik analiz için yumurtadan larva kaldırın. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/54976/54976fig5.jpg" /> Şekil 5: Bad Embriyonik Enjeksiyon Örnekler Good vs. (A) uninjected embriyo. (B) Embriyo çok az dsRNA enjekte edilmiştir. (C) Embriyo dsRNA&#39;nın uygun miktarda enjekte edilir. (D) dsRNA aşırı enjeksiyonundan kaynaklanan taşan Broken embriyo. Gıda boyama görselleştirme dsRNA ilave edildi. (E) enjeksiyon için iğneler olarak kullanılan çekilmiş kılcal tüpler örnekler. Konik ve ucu uzunluğu f Notveya fonksiyonel iğne iki örnek. AD Ölçek çubukları 200 mikron temsil etmektedir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/54976/54976fig6.jpg" /> Şekil 6: Kadın ve Erkek Yetişkinler ve Pupa. (A) erkek pupa alttan görünüşü. (A &#39;) A. (A &quot;) erkek pupa genital İllüstrasyon arka kısmının Büyütme. (B) dişi pupa alttan görünüşü. (B&#39;) B. Kadın pupa arka kısmının Büyütme iki genital papilla var (beyaz oklar). (B &quot;) kadın pupa genital İllüstrasyon. (C) erkek yetişkin alttan görünüşü. (C &#39;) C posterior bölümünün Büyütülmüş görünüm erkek yetişkin Trident gibi olması genital ve Not4. sternite dairesel lob benzeri yapı (siyah ve beyaz ok sırasıyla). (D) bir dişi yetişkin alttan görünüşü. (D &#39;) tüm panelleri için D arka kısmının Büyütülmüş görünüm, ölçek çubukları 1 mm gösterir. Ayrıntılar için, Xiang et al. 2015 53. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7," src="/files/ftp_upload/54976/54976fig7.jpg" /> Şekil 7: Enjeksiyon sırasında bir kadın. Dişiler anestezi ve ventral yüzü yukarı yerleştirilir. 2. ve dsRNA&#39;larını enjekte etmek 3 sternites arasındaki segmacoria nüfuz iğne gösterilmektedir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 8: DMAC-prd pRNAi sonra Temsilcisi Fenotipleri. (A) Kontrol enjeksiyonu. Üç göğüs segmentleri ve on karın segmentleri ile bir yumurtadan yabani tip benzeri GFP pRNAi yavru Yanal görünümü. Her bölüm kıllı ve pigmentli şeritler vardır. (B) taramalı prd pRNAi yavruların Yanal görünümü. etiketli komşu pigmente çizgileri arasındaki boşluk daralmış veya tamamen eksik olduğunu. Bir çıkmamış kontrol vahşi tip benzeri embriyo (C) Tırnak fenotipi. Daha az karın segmentleri ile çıkmamış prd pRNAi yavru (D) Tırnak Eti fenotip. (E, F) den germband Dissected: (E) Kontrol, GFP pRNAi eşit her segmentte Tu dile getirdi, (F) prd pRNAi, En ifadesi alternatif kesimleri (yıldız) azalır. Tüm bölmede içinls, ölçek çubukları 500 mikron göstermektedir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54976/54976fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus at JoVE.com

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Burada, laboratuarda bir ara-germ böceği, Dermestes maculatus (D. maculatus) yetiştirme için protokolleri sunuyoruz. Biz de bu türün gen fonksiyonunu incelemek için embriyonik fenotipleri analiz etmek için embriyonik ve ebeveyn RNAi için protokolleri ve yöntemleri paylaşır.

Yetiştirme ve Gizle böcek RNA aracılı gen demonte çift sarmallı,<em&gt; Dermestes maculatus</em

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

rearing-double-stranded-rna-mediated-gene-knockdown-hide-beetle

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

10.5K Görüntüleme.  University of Maryland.  Burada, laboratuarda bir ara-germ böceği, Dermestes maculatus (D. maculatus) yetiştirme için protokolleri sunuyoruz. Biz de bu türün gen fonksiyonunu incelemek için embriyonik fenotipleri analiz etmek için embriyonik ve ebeveyn RNAi için protokolleri ve yöntemleri paylaşır. 

Video: Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Genetik

Preparation of rAAV9 to Overexpress or Knockdown Genes in Mouse Hearts

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation of gene functions. Their therapeutic potential in the heart can also be determined. There are limited approaches for in vivo molecular intervention in the mouse heart. Recombinant adeno-associated virus (rAAV)-based genome engineering has been utilized as an essential tool for in vivo cardiac gene manipulation. The specific advantages of this technology include high efficiency, high specificity, low genomic integration rate, minimal immunogenicity, and minimal pathogenicity. Here, a detailed procedure to construct, package, and purify the rAAV9 vectors is described. Subcutaneous injection of rAAV9 into neonatal pups results in robust expression or efficient knockdown of the gene(s) of interest in the mouse heart, but not in the liver and other tissues. Using the cardiac-specific TnnT2 promoter, high expression of GFP gene in the heart was obtained. Additionally, target mRNA was inhibited in the heart when a rAAV9-U6-shRNA was utilized. Working knowledge of rAAV9 technology may be useful for cardiovascular investigations.

In this manuscript, a method to prepare recombinant adeno-associated virus 9 (rAAV9) vectors to manipulate gene expression in the mouse heart is described.

Fare Kalpler eksprese rAAV9 hazırlanması veya demonte Genler

Controlling the expression or activity of specific genes through the myocardial delivery of genetic materials in murine models permits the investigation ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

Hücre Çevrimiyle Düzenlenen Gen İfadesini İki Tamamlayıcı Hücre Senkronizasyon Protokolü İle Çalışmak

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands for the recognition of RNA sequence and structure. Chemically modified Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers have been recently developed that can recognize RNA duplexes in a sequence-specific manner. PNAs are chemically stable with a neutral peptide-like backbone. PNAs can be synthesized relatively easily by the manual Boc-chemistry solid-phase peptide synthesis method. PNAs are purified by reverse-phase HPLC, followed by molecular weight characterization by matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF). Non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) technique facilitates the imaging of the triplex formation, because carefully designed free RNA duplex constructs and PNA bound triplexes often show different migration rates. Non-denaturing PAGE with ethidium bromide post staining is often an easy and informative technique for characterizing the binding affinities and specificities of PNA oligomers. Typically, multiple RNA hairpins or duplexes with single base pair mutations can be used to characterize PNA binding properties, such as binding affinities and specificities. 2-Aminopurine is an isomer of adenine (6-aminopurine); the 2-aminopurine fluorescence intensity is sensitive to local structural environment changes, and is suitable for the monitoring of triplex formation with the 2-aminopurine residue incorporated near the PNA binding site. 2-Aminopurine fluorescence titration can also be used to confirm the binding selectivity of modified PNAs towards targeted double-stranded RNAs (dsRNAs) over single-stranded RNAs (ssRNAs). UV-absorbance-detected thermal melting experiments allow the measurement of the thermal stability of PNA-RNA duplexes and PNA&#183;RNA2 triplexes. Here, we describe the synthesis and purification of PNA oligomers incorporating modified residues, and describe biochemical and biophysical methods for characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs.

We report the protocols for the synthesis and purification of Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomers incorporating modified residues. The biochemical and biophysical methods for the characterization of the recognition of RNA duplexes by the modified PNAs are described.

Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Production and Purification of Baculovirus for Gene Therapy Application

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a promising vector for gene therapy application. Here, baculovirus is produced by transient transfection of the baculovirus plasmid DNA (bacmid) in an adherent culture of Sf9 cells. Baculovirus is subsequently expanded in Sf9 cells in a serum-free suspension culture until the desired volume is obtained. It is then purified from the culture supernatant using heparin affinity chromatography. Virus supernatant is loaded onto the heparin column which binds baculovirus particles in the supernatant due to the affinity of heparin for baculovirus envelop glycoprotein. The column is washed with a buffer to remove contaminants and baculovirus is eluted from the column with a high-salt buffer. The eluate is diluted to an isotonic salt concentration and baculovirus particles are further concentrated using ultracentrifugation. Using this method, baculovirus can be concentrated up to 500-fold with a 25% recovery of infectious particles. Although the protocol described here demonstrates the production and purification of the baculovirus from cultures up to 1 L, the method can be scaled-up in a closed-system suspension culture to produce a clinical-grade vector for gene therapy application.

In this protocol, baculovirus is produced by transient transfection of baculovirus plasmid into Sf9 cells and amplified in a serum-free suspension culture. The supernatant is purified by heparin affinity chromatography and further concentrated by ultracentrifugation. This protocol is useful for the production and purification of baculovirus for gene therapy application.

Üretim ve Baculovirus arınma gen tedavisi uygulaması için

Baculovirus has traditionally been used for the production of recombinant protein and vaccine. However, more recently, baculovirus is emerging as a ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in atherogenesis progression, ischemia, and myocardial infarction. Here we present a methodology of patient genotyping to investigate the post-transcriptional role of the C924T polymorphism (rs4523) situated at the 3&#39; region of the TBXA2 receptor gene. This method relies on DNA extraction from whole blood, polymerase chain reaction (PCR) amplification of the TBXA2 gene portion containing the C924T mutation, and identification of wild type and/or mutant genotypes using a restriction digest analysis, specifically a restriction fragment length polymorphism (RFLP) on agarose gel. In addition, the results were confirmed by sequencing the TBXA2R gene. This method features several potential advantages, such as high efficiency and the rapid identification of the C924T polymorphism by PCR and restriction enzyme analysis. This approach allows a predictive study for plaque formation and atherosclerosis progression by analyzing patient genotypes for the TBXA2R C924T polymorphism. Application of this method has the potential to identify subjects who are more susceptible to atherothrombotic processes, in particular subjects in a high-risk, aspirin-treated group.

In the present study, we describe a methodology to analyze the C924T genotype. The protocol consists of three phases: DNA extraction, amplification by polymerase chain reaction (PCR), and analysis of the restriction fragment length polymorphism (RFLP) on agarose gel.

Thromboxane A2 reseptör gen C924T polimorfizmi çalışmak için bir yöntem

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

Kök Microbiome keşfetmek: toprak, rizosferde ve kök Endosphere bakteriyel topluluk verileri ayıklama

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives each year. Effective treatment options able to halt disease progression are lacking. Despite the extensive sequencing efforts in large patient populations, the majority of ALS and PD cases remain unexplained by genetic mutations alone. Epigenetics mechanisms, such as the post-translational modification of histone proteins, may be involved in neurodegenerative disease etiology and progression and lead to new targets for pharmaceutical intervention. Mammalian in vivo and in vitro models of ALS and PD are costly and often require prolonged and laborious experimental protocols. Here, we outline a practical, fast, and cost-effective approach to determining genome-wide alterations in histone modification levels using Saccharomyces cerevisiae as a model system. This protocol allows for comprehensive investigations into epigenetic changes connected to neurodegenerative proteinopathies that corroborate previous findings in different model systems while significantly expanding our knowledge of the neurodegenerative disease epigenome.

This protocol outlines experimental procedures to characterize genome-wide changes in the levels of histone post-translational modifications (PTM) occurring in connection with the overexpression of proteins associated with ALS and Parkinson&#39;s disease in Saccharomyces cerevisiae models. After SDS-PAGE separation, individual histone PTM levels are detected with modification-specific antibodies via Western blotting.

Histon translasyonel modifikasyon değişiklikler Maya nörodejeneratif Proteinopathy modellerinde karakterize

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...