博士デビッド王、ハワード ヒューズ医学研究所、カリフォルニア大学バークレーは、質量分析および有用なコメントを感謝いたします。Xuelian 朱先生、上海、研究所生物科学、中国科学院、フルレングス CENP F 構造を提供するため、中国上海に感謝いたします。最後に、博士スーザンの命とり、博士ブライアン キャラハン博士クリストフ Grewer アット ビンガムトン ユニバーシティは、機器へのアクセスを感謝いたします。この研究は、ニューヨーク州立大学、ニューヨーク州立大学ビンガムトン校化学科研究財団によって賄われていた。

著者が明らかに何もありません。

私たちの in vitroのキナーゼ試金は、細胞周期のマスター コント ローラーであり多くの重要な細胞プロセスを調整するキナーゼ Cdk1 のための分子ターゲットを識別するために非常に強力な方法です。浄化された蛋白質が Cdk1 の基板は、でき特定のリン酸化部位の同定であるかどうか、方法が決まります。Cdk1 による燐酸化によってこれを容易に解明の細胞プロセスの規則のため。
質量分析法によるリン酸化のサイトの成功の識別のための最も重要な要因は、キナーゼ試金のリン酸化効率です。個々 のサイトのリン酸化効率化する必要があります、できるだけ高くできれば 100%。これは Cdk1/サイクリン B の量を増やすと 16 時間インキュベーション時間を増やすことによって達成することができます。Cdk1/サイクリン B の量を計算する必要なとき、蛋白質のリン酸化サイトを考慮すべき数モル濃度。これは複数のリン酸化サイトにターゲット蛋白質に存在する場合に特に重要です。商業 Cdk1/サイクリン B の活動が、バッチを変わることができるし、キナーゼは活動を急速に失うことができますは、注意も必要があります。体外のリン酸化が成功しない場合は、キナーゼの活性をテストすることをお勧めします。トラブルシューティングのポジティブ コントロールとしての in vitro CENP F (2,987 3,065 残基) のリン酸化を使用できます。ネガティブ コントロールとして Cdk1/サイクリン B 添加せず反応を実行し、分析する必要があります。別の便利な負の制御キナーゼ死者変異体 Cdk1 は触媒活性を示す、単純な点突然変異 (D146N)47,48,49のための使用であります。さらに、特定のリン酸化サイトを確認するには、標的タンパク質の phosphonegative バージョン作成できます、アラニンによるリン酸化サイトを交換する場所。識別されたリン酸化サイトが正しいと、対応する phosphonegative の突然変異体はリン酸化体外をすることはできません。
標的タンパク質の正常なリン酸化を検出するシンプルなツールは、ここで説明した、簡単な SDS-PAGE ゲル シフト試金。リン酸化タンパク質は通常、ペプタイドより追加されたサイズと負電荷のため SDS-PAGE の遅い移行します。大きい蛋白質ゲル シフトを視覚化する十分に精度を高めるための SDS-PAGE 解析の最適化が必要に注意してください。リン酸化タンパク質の特定の分離は、リン酸結合の便利なツールはタグ (フォスタグ) SDS ページです。フォスタグ アクリルアミドとゲルのリン酸化タンパク質は、バンドと比べると遅いタンパク質50,51を脱燐酸化と視覚化されます。
高品質の質量スペクトルを得るためには、体外キナーゼ試金のための蛋白質である純粋な均一な非常に重要です。私たちの浄化のプロトコルはいくつかの選択性の高いクロマトグラフィー手順を組み合わせることによって、蛋白質の分解とプロテアーゼ阻害剤と還元剤の添加で酸化を防止することによってこれを実現します。グルタチオン (すなわち、GST タグそのまま付き); によってタンパク質を溶出する浄化のプロトコルを変更できます。ただし、GST タグ追加別 25 kDa と大規模なタンパク質質量分析のためのターゲットに挑戦している考慮する必要があります。彼の6の代わりに、私たちの浄化のプロトコル-タグ融合タンパク質も使用できます。
このプロトコルは、他のキナーゼのために特定のリン酸化サイトを識別するために変更できます。唯一の要件は、精製したキナーゼが利用可能なアクティブ、および十分に安定したことです。アッセイ条件は最大の活動を達成するために各キナーゼのために調整する必要があります。最適化するパラメーターには、キナーゼ、反応バッファー (pH、塩濃度)、培養時間、反応温度および ATP 濃度の量が含まれます。体外キナーゼ試金は多くのキナーゼ Plk (ポロ様キナーゼ)52,53,54, を含むと MAPK/ERK (マイトジェン活性化タンパク質キナーゼのリン酸化サイトを識別するために正常に使用されています。キナーゼ/細胞外シグナル調節キナーゼ)55,56。
このメソッドの強さは、浄化された蛋白質の特定のリン酸化サイトを識別するためを Cdk1体外のターゲットであるリン酸化サイトできないことがあります必ずしもリン酸化で体内が注意してください。ヴィヴのo、追加規制メカニズムがある Cdk1 による認識のためのリン酸化サイトをできなく可能性があります場所。たとえば、現在生体内で、可能性がありますまたはリン酸化部位を隠す構造変化を介してアクセスできるように追加の対話パートナーがあります。さらに、基板はリン酸化されるために G2 段階で核における Cdk1/サイクリン B と colocalize する必要があります。さらに、ポスト翻訳の修正や他の規制プロセスは、ターゲット蛋白質の生体内でリン酸化サイトをアクセス不能にレンダリングできる構造を影響可能性があります。これらの制限は、セルまたは識別されたリン酸化サイトに生理機能があることを確認してください動物モデルの適切な実験を設計することによって克服することができます。ここでは、単純な結合の試金を使用して、機能の検証のため、CENP F karyopherin α 機能検証との相互作用はリン酸化を減少させるのでセルのコンテキストまたは動物モデルでも実行して必要があります。したがって、我々 はまた HeLa 細胞10に、cNLS を含む CENP F 断片の蛍光融合蛋白質を transfected しました。CENP f、cNLS 内の Phosphomimetic 変異減少核局在化、これらのリン酸化サイト10の生理機能を確認します。
細胞または動物モデルにおけるリン酸化サイトの機能検証には、いくつかのツールがあります。負電荷によってリン酸化の効果を模倣、Phosphomimetic の突然変異は、この目的のために活躍しています。これらについては、リン酸化部位 (セリンまたはスレオニン) はアスパラギン酸やグルタミン酸に置換されます。利点は、ターゲット蛋白質の点突然変異だけが必要です。それは注意必要があります、一方、phosphomimetic の突然変異は機能検証のため多くの場合正常に使用された、特にでに動作する料金変更が構造的な変更ではなく、規制の優勢なコントリビューターの場合。Phosphomimetic 突然変異は他の多くの場合 (例えば、 11) のリン酸化の効果を模倣する失敗します。ただし、他のアプローチは phosphonegative の突然変異の使用を含むリン酸化サイトの機能検証のため: これらの突然変異は、アラニンのリン酸化サイトを置き換えることによってリン酸化を防ぐ。携帯電話のコンテキストで機能検証のための別の有用なアプローチは、キナーゼ死者変異体 Cdk1 は、導入が簡単な点突然変異 (D146N)47,48,49による不活化の式です。特に、いくつかの小分子 Cdk1 阻害剤 Flavopiridol など RO-3306、機能研究細胞または動物モデル7,8,11で使用できる市販されています。これらの阻害剤はよ特徴付けられた、(のレビューを参照してください9) がん治療の臨床試験がいくつか。
プロテオーム研究で識別された蛋白質リン酸化のサイトの数が多い、間キナーゼの特異性は、不明ですが、ほとんどの場合と体外キナーゼ試金は Cdk1 の基板を識別するために使用できるいくつかの方法の一つです。他のアプローチはまた使用されました。Cdk1 ターゲットは、エンジニア リングの Cdk1 酵素を使用してによって識別されました。大きい基板結合ポケットがあり、基板6と ATP のより大型のバージョンを受け入れます。このかさばる基板は、野生型キナーゼにバインドできません。セルに radiolabeled かさばる ATP 添加抽出 Cdk1 の直接基板の特定の分類に導きます修飾 Cdk1 酵素を含む 200 Cdk1 ターゲットが出芽酵母のこのメソッドで識別されますしかし、それ適用できません哺乳類細胞に重大な制限であります。別の研究で Cdk1 基板が Cdk1、Flavopiridol、および RO 3306 の 2 つの小分子阻害剤を用いた定量的プロテオミクス解析を実行することによって人間の培養細胞で識別されます。1215 551 タンパク質にリン酸は Cdk1 阻害剤添加7大幅減少しました。このメソッドは Cdk1 標的の全体プロテオームを画面できますが、ターゲットを検証しなければ、その結果、例えば、体外キナーゼによって試金。
今後、体外キナーゼ試金は、現在開発中 Cdk1 基板用高スループット画面とは組み合わせる可能性が高い。プロテオーム Cdk1 基板の数が多いため多くの人間 Cdk1 基板の識別されるままし、体外キナーゼ試金識別、マップ、およびこれらのサイトを確認する重要なツールとなるでしょう。
体外キナーゼ試金は、キナーゼ Cdk1 のターゲットを識別し、特定のリン酸化サイトを識別するために強力なツールです。これらのリン酸化部位の同定により Cdk1 による細胞プロセスの規則のための機構の研究。

キナーゼは、ATP からのリン酸基を基板に転送し、多くの細胞プロセスを調整する酵素です。このリン酸化は可逆的で、高速、2 つの負電荷を追加しますと自由エネルギーを格納、セルで使用される最も一般的な修飾の一つです。Cdk1 はまたとして知られている細胞分裂周期蛋白質 2 相同物 (cdc2) マスター コント ローラーではすべて真核生物1,2,3,4、5、細胞周期では、廃止、プロテオーム6、7の推定 8 ~ 13%。
一方、最近のプロテオミクス研究は、タンパク質においてはほとんどの場合、多くのリン酸化サイトを識別したキナーゼのこれらの変更のための責任は不明です。ヒトの細胞、特に、知られている Cdk1 ターゲット数は低7です。Cdk1 が細胞周期を制御する方法を確立する解明が可能、Cdk1 固有のリン酸化部位の同定が重要です。細胞周期制御は忠実な染色体分配と細胞分裂のために重要、無数の細胞プロセスのこの重要な生理機能をサポートするために行う必要があります。これは転写や細胞構造と核膜、染色体凝縮と紡錘アセンブリの分解など、組織における劇的な再編と同様に有糸分裂、発症する前に翻訳を停止含まれています。規制緩和とこれらのプロセスでのエラーは、がん、先天異常、または有糸分裂細胞死を引き起こします。RO 3306 など Cdk1 の特異的阻害剤が開発8、機能研究の強力なツールを提供してこれらの阻害物質は、現在がん治療の臨床試験 (レビューの9を参照してください)。
ここでは、Cdk1 固有のリン酸化部位の同定を可能にする生体外でキナーゼ分析について述べる。このアッセイ市販人間 Cdk1/サイクリン B を使用して体外に精製されたターゲットのタンパク質をリン酸化します。基質のリン酸化その質量を増加され、2 つの負電荷;したがって、成功したリン酸化を SDS-PAGE の蛋白質ゲルのバンドの上方シフトを確認しました。Cdk1 固有のリン酸化サイトその後試験管内でリン酸化蛋白質の質量分析によって識別されます。実験計画を支援するためには、また計算のツールおよび蛋白質シーケンスから Cdk1 固有のリン酸化部位の予測を参照を確認します。さらに、高純度、均一なタンパク質製剤キナーゼのアッセイに最適をもたらすの浄化のプロトコルについても述べる。最後に、特定のリン酸化のサイトの機能の研究によって検証が必要、単純な結合の試金はその目的のためここに記載されています。組み合わせることで、これは Cdk1 のリン酸化サイトを生成して Cdk1 が細胞周期7,10,11を制御する方法に解明をしたりできるように非常に強力なアプローチです。このメソッドは、浄化された蛋白質に依存しているので、モデル有機体および利回り信頼性の高い結果に適用できます。得られるリン酸化サイト、体外の機能検証を推奨するただし、細胞局在や相互作用パートナー翻訳後修飾など、場所に追加的な規制メカニズムを持っていることアクセス可能または Cdk1 による認識のリン酸化サイトをレンダリング可能性があります。
Cdk1 は成っている (Ser/スレオニン-プロ-X-Lys/アルゼンチン)、X は任意の残基、セリンまたはトレオニンのリン酸化のサイトは、コンセンサスのリン酸化部位を認識しています。+1 の位置にプロリンの存在は認識のために特に重要です。また、塩基性残基、+2 や +3 位置に適して、+3 で Lys または Arg を含むほとんどの Cdk1 のリン酸化サイトを6,12の位置します。
Cdk1 活性化が堅く調整され、有糸分裂1,2,3,4、5の発症に 。サイクリン依存性キナーゼの活動は一般に振動する細胞周期13全体レベルで個別のサイクリン (サイクリン A、B、C、D、および E の人間) との関連付けに依存します。Cdk1 式細胞周期で一定であるし、サイクリン A ととして B5,13,14,15をサイクリン調節サブユニットとの関連付けに依存してその活動の規制同様のポスト翻訳の修正。Cdk1/サイクリン B の複合体の形成は、キナーゼ活性化5,14,15,16,17,18に必要です。G2 段階でサイクリン B は細胞質で翻訳され Cdk15,14,15,16,17,18; に結合核にインポートただし、Cdk1/サイクリン B は Myt1 人間 Cdk1 抑制キナーゼによって残基 Thr14 と Tyr15 のリン酸化 (膜準チロシン、スレオニン-固有抑制 cdc2 キナーゼ) と Wee1、それぞれ19、によって不活化保持されます。 20,21。遅い G2 段階で細胞分裂サイクル 25 ホスファターゼ (cdc25) による Thr14 と Tyr15 の脱燐酸化が Cdk1/サイクリン B の複合体のキナーゼ活動をアクティブにし、有糸分裂12,14,の開始をトリガー18,20,22,23. Thr161 リン酸化 Cdk1/サイクリン B の活性化にも必要ですし、Cdk 活性化キナーゼ (CAK)18Cdk7 によって媒介されます。後期ではサイクリン B の分解は、有糸分裂24,25からの出口を許可する Cdk1 を不活性化します。Cdk1/サイクリン B の活性化は、複雑なプロセスである従って。ここで提示されたプロトコルが市販 Cdk1/サイクリン B で実行されます。昆虫細胞で、この複合体の組み換え式の中にそれは活性生体内で内因性キナーゼ14,20清められた状態でアクティブなままになります。結果、組換え人間 Cdk1/サイクリン B キナーゼ試金体外に適しています。
ここでは、ひと動原体タンパク質 F (CENP F)10の Cdk1 固有のリン酸化部位の同定のためのプロトコルについて述べる。CENP F (G1、S 期) 中間期のほとんどの間、核に存在すると Cdk1 依存方法10, G2 の相26,27,28に細胞質にエクスポートは、動原体タンパク質である11. 核局在化二部 cNLS26によって授与されます。cNLSs は、karyopherin β と RanGDP、cNLS 貨物の核29へのインポートを容易にする核輸送因子 karyopherin α によって認識されます。G2 段階で核の輸出は、不明な輸出経路10を介して促進されます。CENP F は、細胞質に存在する、それが核封筒に募集、順番モーター蛋白質ダイニンの複雑な30,31を募集します。この経路は、有糸分裂開始のタイミングが正しいと脳で根本的なプロセスのために重要であるダイニン依存方法で紡錘アセンブリの最初の段階の間に中心体にそれぞれの核を配置することが重要開発30,31,32。G2 段階で開始、CENP F も完成、動原体に忠実な染色体分離27,28,33,34,35 に重要な役割をしています。.これらの経路の重要な規制ステップは Cdk110,11に依存している G2 段階で CENP F の核輸出です。CENP F の cNLS で Cdk1 固有のリン酸化部位の同定のためのプロトコルをご紹介します。これらのサイトの Phosphomimetic 突然変異は Cdk1/サイクリン B は、直接、cNLS10のリン酸化による CENP F の局在を調節することを示唆している CENP-F の核輸入に遅くなります。
全体的にみて、キナーゼ Cdk1。 精製された標的タンパク質リン酸化は体外市販 Cdk1/サイクリン B 複合体とリン酸化のサイトでこの体外のキナーゼ試金の特定の基板の識別を可能します。その後、質量分析によって識別されます。Cdk1 固有のリン酸化部位の同定は、Cdk1 が細胞周期を制御する方法を明らかにする機構の研究をサポートしています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2800 ml baffled Fernbach flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>44232XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>A-301-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Fisher Scientfiic</td>
			<td>BP413-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benzamidine hydrochloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>B6506-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bottletop filter</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>14-450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B (alternate source)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PV3292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P6020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CENP-F (residues 2987 &#8211; 3065) pGEX6P1 plasmid</td>
			<td>Available upon request.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10033-778</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chlorampenicol</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>C-105-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D/L methionine</td>
			<td>Agros Organics / Fisher</td>
			<td>125650010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>desalting pipet tips: Zip tips</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>ZTC18S008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>7321010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dithiothreitol</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>DTT50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>71403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrospray ionization Fourier transform ion</td>
			<td>Bruker Amazon</td>
			<td>Apex III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cyclotron resonance mass spectrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrospray ionization ion trap mass spectrometer</td>
			<td>Bruker Amazon</td>
			<td>custom</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>97040-276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FPLC system: &#196;kta Pure FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29032697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutathione agarose</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>16101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glutathione, reduced</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G4251-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>incubation shaker: multitron shaker</td>
			<td>Infors</td>
			<td>I10102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>I2481C50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kanamycin</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>karyopherin &#945; pet-28a pres plasmid</td>
			<td>Available upon request.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani medium</td>
			<td>Fisher Scientfiic</td>
			<td>BP1426-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microcentrifuge 5418R, refrigerated</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5401000013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtubes (0.5 ml)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtubes (1.5 ml)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P6611-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEX-6P-1 plasmid</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>GE28-9546-48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylmethylsulfonyl fluoride</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>P470-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PS protease: PreScission protease</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>27084301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phos-tag acrylamide</td>
			<td>Wako Pure Chem. Ind.</td>
			<td>304-93521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reduced gluthathione</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G4251-50g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes)</td>
			<td>Fisher Scientfiic</td>
			<td>055291D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>210518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Site-Directed Mutagenesis Kit</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sonifier: Branson S-250D sonifier</td>
			<td>Branson</td>
			<td>15 338 125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff)</td>
			<td>Spectrum Labs</td>
			<td>08 670B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>swing out rotor TX-1000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>10033-778</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of cyclin-dependent kinase 1 specific phosphorylation sites by an in vitro kinase assay

サイクリン依存性キナーゼ 1 (Cdk1) は、すべての真核生物の細胞周期のマスター コント ローラー; プロテオームの推定 8 ~ 13% を廃止ただし、ひと細胞で特に Cdk1 の特定のターゲットの数はまだ低いです。Cdk1 固有のリン酸化部位の同定は、機械論的洞察 Cdk1 が細胞周期を制御する方法を提供するように重要です。細胞周期制御は忠実な染色体分配に重要なこの複雑なプロセスの欠陥染色体異常やがんに 。
ここでは、Cdk1 のリン酸化サイトを識別するために使用される生体外でキナーゼ分析について述べる。このアッセイで浄化された蛋白質リン酸化培養では, SDS-PAGE による市販人間 Cdk1/サイクリン b. 成功によってリン酸化を確認し、質量分析法によるリン酸化のサイトの識別後。プローブ間の相互作用特定のリン酸化のサイトの機能の検証のキナーゼ試金および結合の試金の適切な高純度、均一なタンパク質製剤をもたらす浄化のプロトコルについても述べる古典的な核局在化信号 (cNLS) とその核輸送受容体 karyopherin α。実験計画を支援するためには、タンパク質から Cdk1 固有のリン酸化部位の予測のためのアプローチを確認します。一緒にこれらのプロトコルは Cdk1 のリン酸化サイトを生成でき、Cdk1 が細胞周期を制御する方法を解明する非常に強力なアプローチを提示します。このメソッドは浄化された蛋白質、細胞機能の研究と組み合わせる場合は特に任意モデル有機体そして利回り信頼性の高い結果に適用できます。

最近 cNLS10に含まれている CENP F フラグメントの Cdk1 のリン酸化サイトを識別するために、体外のキナーゼ試金 (図 1) を使いました。この信号は、中間期のほとんどの間に CENP F の核局在化を与えます。G2 段階で CENP F が Cdk1 依存的に細胞質、核からエクスポートされます。Cdk1 が CENP F の局在を制御する方法の力学的洞察を得るためには、Igp サーバー36,37を使用して CENP-F Cdk1 のリン酸化サイトを予測するためのシーケンスを分析しました。残留 3,042, 3045、CENP F の cNLS、内予測された 3 Cdk1 固有のリン酸化サイトと 3,048 (表 1)。別 Cdk1 固有のリン酸化サイトも、残渣 3,007 (表 1)10の予測されました。したがって、我々 は Cdk1 がその cNLS のリン酸化による直接 CENP F ローカリゼーションを調節することを仮定しました。
CENP F の cNLS は Cdk1 用基板、浄化された人間 CENP F フラグメント (2,987 3,065 残基) と体外キナーゼ分析を行い、人間 Cdk1/サイクリン b.体外CENP F をリン酸化するかどうかをテストするのには 16% に分析した SDS のページキナーゼ Cdk1 に欠けていたネガティブ コントロールと共に (図 2 a)10。体外CENP F リン酸化、ために、陰性対照と比較してゲルのバンドの明確な上方シフトが観察されます。これはリン酸化タンパク質の典型的な 2 つの負電荷と付加質量各隣酸塩グループを追加します。Cdk1/サイクリン B10CENP F でリン酸化されることが示唆されました。
CENP F リン酸化のサイトの数を決定し、これらのサイトのリン酸化効率を数値化、そのまま体外にリン酸化 CENP F フラグメント (84-mer) は質量分析法 (ESI ITMS)10によって分析されました。観測された ESI イオン トラップ質量スペクトル (図 2 b) では、4 つのサイト (表 1)10時そのままの CENP F フラグメントでリン酸化されることを示唆しています。
CENP F のシーケンスでアミノ酸のリン酸化のサイトの場所は、によって評価されたリシンとアルギニン、蛋白質の鎖を裂く ESI FTICR さんトリプシン、トリプシンのダイジェストを調べるといくつかで起因した CENP F フラグメントのトリプシン ダイジェストペプチド、3,031-3, 052 残渣に含まれている 1 つを含みます。この CENP F ペプチドの質量スペクトル cNLS (表 1)10内にある T3042、T3045、および S3048、残基にリン酸化と一致しました。別トリプシン ペプチド (2,995 3,016 残基) の質量スペクトル S3007 でリン酸化と一致した (表 1)10。すべての 4 つの Cdk1 固有のリン酸化サイトも、シーケンスから予測されました。Cdk1 固有の基板には、残留 T3042、T3045、および S3007 観察、プロリン残基をリン酸化6、横が含まれています。として、フェニルアラニンは、セリンの隣にある S3048 が多少変わった Cdk1 固有リン酸化部位であるが注意するべき。最後に、CENP F はキナーゼ Cdk1 による 3,048 3,045、3,042 3,007 で具体的にはリン酸化することが示唆します。これらの残基の 3 つは Cdk1 が CENP F アクティブ10に変わったら Cdk1 G2 段階で、cNLS のリン酸化を介して細胞局在を調整するかもしれないことを示す CENP F (表 1) の cNLS 内にあります。
これらの Cdk1 固有のリン酸化サイトと生理機能を確認するには、phosphomimetic バリアント S3048D10を作成しました。Phosphomimetic 突然変異は、負荷電残基がリン酸化の効果を模倣します。次に、我々 は、cNLS に含まれている CENP F フラグメントの phosphomimetic バージョンを精製しました。CENP F の cNLS が高い親和性と結合し、CENP F の核のインポートに必要な核内輸送受容体 karyopherin α で認識されます。Phosphomimetic 突然変異はその核内輸送受容体 karyopherin α で CENP F の cNLS 間の相互作用を弱めるかどうかをテストするには、バインディング アッセイ (図 3)10を実行されます。これらの実験で精製 CENP F フラグメント (野生型または S3048D バリアント) は浄化された人間 karyopherin α と混合し、混合物が分析サイズ排除クロマトグラフィーによって分離されました。さらに、蛋白質が個別に分析もしました。溶出画分の SDS ページの分析では、こと、cNLS を持つ野生型 CENP F フラグメントと強い相互作用 karyopherin α 以来、両蛋白質共同溶出 (図 3)10を明らかにしました。Karyopherin α に CENP F S3048D フラグメントのごくわずかな量だけをバインドし、これらのタンパク質溶出別々 に (図 3)10。これらの結果は、そのリン酸化を提案する残基の CENP F の cNLS の 3,048 が核輸送因子 karyopherin α との相互作用に強い効果があります。それは、核輸入率が核輸送因子46, に向かって核ローカリゼーションのシグナルの親和性に大きく依存して、したがって、それはこれらの突然変異は遅く核輸入10予定です注意してください。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57674/57674fig1.jpg"> 図 1: キナーゼ試金の in vitro Cdk1 の略図。<a href="/files/ftp_upload/57674/57674fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57674/57674fig2.jpg"> 図 2: CENP F は Cdk1/サイクリン B によってリン酸化(A) と精製 CENP-F (2,987 3,065 残基) のサイト特定のリン酸化キナーゼの in vitroアッセイを行った Cdk1 を識別します。左側の車線なし Cdk1/サイクリン B 陰性対照の SDS ページの分析が表示されます (-Cdk1)、横に右車線 (+ Cdk1) リン酸化 CENP F を生体外で。分子の重量の基準が示されます。SDS ページのリン酸化 CENP F の上方シフトに成功したリン酸化に一貫している注意してください。Cdk1 とサイクリン B 34 kDa と 60 kDa にかすかな帯として表示されます。(B) (A) からそのままリン酸化 CENP F の ESI イオン トラップ質量分析法を用いてそのままリン酸化 CENP-F (84-mer) のリン酸の負荷を判断します。対応する質量スペクトルが表示されます。強度は、質量電荷比 (m/z) に対してプロットされます。スペクトルは、リン酸化後そのまま CENP F フラグメントの +14 電荷状態に +10 を示しています。種人口 0、1、2、3、および 4 リン酸エステルを示します。それぞれの種の総蛋白量の比を定量化するには、ピークの高さを求めたし、比較 (表 1)。この図は10から変更されており、テイラーとフランシスの発行元の許可を得て再現だった。<a href="/files/ftp_upload/57674/57674fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57674/57674fig3.jpg"> 図 3: 機能検証: CENP F の phosphomimetic 突然変異は強く核内輸送受容体 karyopherin α との相互作用を減少します。(A-F)CENP F フラグメント (2,987 3,065 残基) を浄化 (0.1 mg) と karyopherin α (0.7 mg) を精製した 1:1 のモル比で混合され、サイズ排除クロマトグラフィーで分析します。CENP F フラグメントと karyopherin α も個別に分析しました。ピーク画分の SDS ページの分析が表示されます。(0.6 mL 刻み) の底に溶出容量が示されます。左の kDa の分子量マーカー バンドと彼らの大衆の位置が示されます。アスタリスクは、残留 GST (グルタチオン S トランスフェラーゼ) の痕跡をマークします。(A) Karyopherin α。 (B) 溶出プロファイル。吸光度 280 nm は溶出容量対サします。Karyopherin α (レッド) の溶出プロファイルは CENP F の断片の karyopherin α の混合物の溶出プロファイルをかぶせて (野生型: 緑; phosphomimetic S3048D 突然変異体: 青)。野生型 CENP F フラグメントの追加が高い質量 CENP F 野生型フラグメントのバインディングと一致しているに karyopherin α ピークの溶出量をシフトするに注意してください。Phosphomimetic 突然変異が大きく CENP F karyopherin α (C) CENP F 野生型の断片 (wt) との相互作用を減少させることを示唆している phosphomimetic の突然変異 S3048D CENP F フラグメントを追加するとき、このシフトを守らないとkaryopherin α (D) CENP F wt の断片。(E) CENP F S3048D フラグメントと karyopherin α。 (F) CENP F S3048D フラグメントします。この図は、10からのデータで作成されました。<a href="/files/ftp_upload/57674/57674fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="3">表 1 a。CENP F フラグメント (2987-3065 残基) のシーケンスより大きいフォント サイズで強調表示された Cdk1 のリン酸化サイトを予測しました。トリプシンの断片が太字で強調表示されている、下線します。</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">GPLGSQQSKQDSRGSPLLGPVVPGPSPIPSVTEKRLSSGQNKAS</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">GKRQRSSGIWENGGGPTPATPESFSKKSKKAVMSGIHPAE</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">表 1 b。そのまま CENP F の質量分析</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Cdk1/サイクリン B と体外のリン酸化後 84 mer</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>リン酸化サイト (P) 検出数</td>
			<td>総蛋白の % として表されるリン酸負荷</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">CENP F 2987-3065</td>
			<td>0 P</td>
			<td>6%</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 P</td>
			<td>37%</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 P</td>
			<td>40%</td>
		</tr>
<tr>
<td>3 P</td>
			<td>15%</td>
		</tr>
<tr>
<td>4 P</td>
			<td>3%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">テーブル 1Cdk1/サイクリン B と体外のリン酸化後 CENP-F の由来ペプチドの質量分析</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>リン酸化のサイトの数</td>
			<td>リン酸負荷</td>
		</tr>
<tr>
<td>トリプシンのリン酸化ペプチド</td>
			<td>0 P</td>
			<td>57%</td>
		</tr>
<tr>
<td>残留 2995-3016</td>
			<td>1 P</td>
			<td>43%</td>
		</tr>
<tr>
<td>トリプシンのリン酸化ペプチド</td>
			<td>0 P</td>
			<td>7%</td>
		</tr>
<tr>
<td>残留 3031-3052</td>
			<td>1 P</td>
			<td>64%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2 P</td>
			<td>29%</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>3 P</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: Cdk1/サイクリン B と体外のリン酸化後の CENP F フラグメントの分析における分析の質量このテーブルは、10からのデータで作成されました。

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Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

サイクリン依存性キナーゼ 1 (Cdk1) 細胞周期 G2 段階で活性化し、多くの細胞経路を調節します。この重要なキナーゼの細胞内標的を確立するため Cdk1 固有のリン酸化部位の同定を可能にする Cdk1 と体外キナーゼ試金のためのプロトコルを紹介します。

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

identification-cyclin-dependent-kinase-1-specific-phosphorylation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

18.4K ビュー.  State University of New York at Binghamton. サイクリン依存性キナーゼ 1 (Cdk1) 細胞周期 G2 段階で活性化し、多くの細胞経路を調節します。この重要なキナーゼの細胞内標的を確立するため Cdk1 固有のリン酸化部位の同定を可能にする Cdk1 と体外キナーゼ試金のためのプロトコルを紹介します。

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Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

ニトロセルロース結合アッセイを用いて細菌ヒスチジンキナーゼ自己リン酸化の定量化

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

生化学

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering allosteric details of their regulation. Kinases comprise signaling networks whose defects are often hallmarks of multiple forms of cancer and related diseases, making an assay platform amenable to manipulation of upstream regulatory factors and validation of reaction requirements critical in the search for improved therapeutics. Here, we describe a basic kinase assay that can be easily adapted to suit specific experimental questions including but not limited to testing the effects of biochemical and pharmacological agents, genetic manipulations such as mutation and deletion, as well as cell culture conditions and treatments to probe cell signaling mechanisms. This assay utilizes radiolabeled [&#947;-32P] ATP, which allows for quantitative comparisons and clear visualization of results, and can be modified for use with immunoprecipitated or recombinant kinase, specific or typified substrates, all over a wide range of reaction conditions.

Protein kinases are highly evolved signaling enzymes and scaffolds that are critical for inter- and intracellular signal transduction. We present a protocol for measuring kinase activity through the use of radiolabeled adenosine triphosphate ([&#947;-32P] ATP), a reliable method to aid in elucidation of cellular signaling regulation.

放射性標識ATPによるタンパク質キナーゼ活性のアッセイ

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

TRNA イソペンテニル トランスフェラーゼ活性を検出する体外の試金

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 mutations result in hyperactivation of its kinase function. Here, we describe an easy and robust assay to quantify LRRK2 kinase pathway activity in human peripheral blood neutrophils by measuring LRRK2-controlled phosphorylation of one of its physiological substrates, Rab10 at threonine 73. The immunoblotting analysis described requires a fully selective and phosphospecific antibody that recognizes the Rab10 Thr73 epitope phosphorylated by LRRK2, such as the MJFF-pRab10 rabbit monoclonal antibody. It uses human peripheral blood neutrophils, because peripheral blood is easily accessible and neutrophils are an abundant and homogenous constituent. Importantly, neutrophils express relatively high levels of both LRRK2 and Rab10. A potential drawback of neutrophils is their high intrinsic serine protease activity, which necessitates the use of very potent protease inhibitors such as the organophosphorus neurotoxin diisopropylfluorophosphate (DIFP) as part of the lysis buffer. Nevertheless, neutrophils are a valuable resource for research into LRRK2 kinase pathway activity in vivo and should be considered for inclusion into PD biorepository collections.

Mutations in the leucine rich repeat kinase 2 gene (LRRK2) cause hereditary Parkinson&#8217;s disease. We have developed an easy and robust method for assessing LRRK2-controlled phosphorylation of Rab10 in human peripheral blood neutrophils. This may help identify individuals with increased LRRK2 kinase pathway activity.

Rab10リン酸化を評価してパーキンソン病関連LRRK2キナーゼ経路を尋問するためのヒト末梢血好中球分離

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

多彩な生化学的アプローチを用いた新規 CK2 キナーゼ基板の識別

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral RNAs. When bound to viral double-stranded RNAs (dsRNAs), PKR undergoes dimerization and subsequent autophosphorylation. Phosphorylated PKR (pPKR) becomes active and induces phosphorylation of the alpha subunit of eukaryotic initiation factor 2 (eIF2&#945;) to suppress global translation. Increasing evidence suggests that PKR can be activated under physiological conditions such as during the cell cycle or under various stress conditions without infection. However, our understanding of the RNA activators of PKR is limited due to the lack of a standardized experimental method to capture and analyze PKR-interacting dsRNAs. Here, we present an experimental protocol to specifically enrich and analyze PKR bound RNAs during the cell cycle using HeLa cells. We utilize the efficient crosslinking activity of formaldehyde to fix PKR-RNA complexes and isolate them via immunoprecipitation. PKR co-immunoprecipitated RNAs can then be further processed to generate a high-throughput sequencing library. One major class of PKR-interacting cellular dsRNAs is mitochondrial RNAs (mtRNAs), which can exist as intermolecular dsRNAs through complementary interaction between the heavy-strand and the light-strand RNAs. To study the strandedness of these duplex mtRNAs, we also present a protocol for strand-specific qRT-PCR. Our protocol is optimized for the analysis of PKR-bound RNAs, but it can be easily modified to study cellular dsRNAs or RNA-interactors of other dsRNA binding proteins.

We present experimental approaches for studying RNA-interactors of double-stranded RNA binding protein kinase RNA-activated (PKR) during the mammalian cell cycle using HeLa cells. This method utilizes formaldehyde to crosslink RNA-PKR complexes and immunoprecipitation to enrich PKR-bound RNAs. These RNAs can be further analyzed through high-throughput sequencing or qRT-PCR.

哺乳類の細胞周期中に RNA 活性化蛋白質キナーゼの RNA インターアクターを勉強

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Enhancing the Engraftment of Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Cardiomyocytes via a Transient Inhibition of Rho Kinase Activity

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. Y-27632 is a highly potent inhibitor of Rho-associated, coiled-coil-containing protein kinase (RhoA/ROCK) and is used to prevent dissociation-induced cell apoptosis (anoikis). We demonstrate that Y-27632 pretreatment for human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs+RI) prior to implantation results in a cell engraftment rate improvement in a mouse model of acute myocardial infarction (MI). Here, we describe a complete procedure of hiPSC-CMs differentiation, purification, and cell pretreatment with Y-27632, as well as the resulting cell contraction, calcium transient measurements, and transplantation into mouse MI models. The proposed method provides a simple, safe, effective, and low-cost method which significantly increases the cell engraftment rate. This method cannot only be used in conjunction with other methods to further enhance the cell transplantation efficiency but also provides a favorable basis for the study of the mechanisms of other cardiac diseases.

In this protocol, we demonstrate and elaborate on how to use human induced pluripotent stem cells for cardiomyocyte differentiation and purification, and further, on how to improve its transplantation efficiency with Rho-associated protein kinase inhibitor pretreatment in a mouse myocardial infarction model.

Rhoキナーゼ活性の一過性阻害によるヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞の増着増強

A crucial factor in improving cellular therapy effectiveness for myocardial regeneration is to safely and efficiently increase the cell engraftment rate. ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...