この研究の一部は、CDにNIDA / NIHからの助成金DA024558、DA30896、DA033892、およびDA021471によってサポートされています。また、ヴァンダービルトCTSAはUL1RR024975、NCRR / NIH、NIMHD / NIHからU54グラントMD007593、およびテネシーCFARグラントP30のAI110527からMeharryトランスレーショナルリサーチセンター（MeTRC）CTSAグラントU54のRR026140を付与し、RCMIグラントG12MD007586を認めます。

1.ウイルス産生注：、感染性HIV-1の高力価を生成する活性化されたデンドリマーベースのトランスフェクション試薬を用いて、感染性HIV-1分子クローンによるヒト胎児腎臓（HEK）細胞株293Tをトランスフェクトします。リン酸カルシウムトランスフェクション法は、同等の結果が得られることが観察されています。 <ol><li>バイオセーフティレベル2（BSL2）ラボでは、シード8 10cmの皿当たり3×10 6 293T細胞mLの10％ウシ胎児血清（FBS）、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の。培養物を37℃に設定したインキュベーター中で細胞を、5％CO 2、O / N。 </li><li>次の日は、各10cmの皿に細胞をトランスフェクトするために、血清および抗生物質を欠くDMEMの300μLの最終容量まで（ 材料表を参照）pNL4-3プラスミドDNAの8μgのを薄めます。 、トランスフェクション試薬の80μLを加え、ピペッティングによりよく混ぜ、そして室温でインキュベート5 - トランスフェクション複合体形成のための10分。 </li><li>吸引により皿から培地を除去し、血清および抗生物質を含む新鮮なDMEMのディッシュあたり7 mLを加え。 </li><li> 、トランスフェクション複合体に血清および抗生物質を含むDMEMの1 mLを加え、ピペッティングにより混合し、細胞に、この混合物を追加します。静かにトランスフェクション複合体の均一な分布を容易にするための皿を旋回。 </li><li>すぐにBSL3実験室、37℃に設定したインキュベーター内の場所および5％CO 2、および文化に48時間細胞を細胞を移します。 </li><li>ピペットを使用してウイルスを含む組織培養上清を回収した後、遠心分離管に移します。 5分間、300×gで遠心分離し、細胞および破片をペレット化し、その後、0.45μmの細孔サイズのシリンジフィルターを通して上清をフィルタリングします。 </li><li>この無細胞ウイルス調製物中の任意のキャリーオーバーのプラスミドDNAを除去するために、1時間、37℃でDNアーゼ1（20μg/ ml）で処置します。 </li><li>定量化するために、HIV-1力価、それは日常的な使用22ための迅速かつ適した方法であるように、p24の固有の酵素免疫測定法（ELISA）を使用します。 注：p24のELISAは、物理的な力価（ウイルス粒子の数）を測定することに留意すべきです。また、ウイルス関連RT活性（外因性RTアッセイ）またはウイルス感染性（TZM-BL指標細胞ラインベース感染性アッセイ）を測定すると、感染性ウイルス粒子の排他的な読み出しを提供します。 </li></ol>燮-T1細胞の2.ウイルス感染（BSL3研究室） <ol><li> BSL2ラボでは、10％の熱不活性化FBS、ペニシリン、および1のストレプトマイシン（スプリット比を補っロズウェルパーク記念研究所（RPMI）培地中に1.0×10 6及び2.0×10 6細胞/ mLの間のSup-T1細胞を維持します：2毎に2から3 D）。 、培養フラスコから燮-T1細胞をプールピペットでよく混和し、血球計およびトリパンブルー排除STを使用することにより生細胞数を決定しますメソッドをaining。 <ol><li> 50 mLのコニカル遠心管中の（ウイルス感染当たり）80×10 6細胞のアリコートの必要数を準備します。 </li><li> 500×gで、スイングバケットローターで細胞を遠心分離し、5分間25℃。細胞培養培地を除去することなく、さらなる処理のためBSL3実験室にペレット化した細胞を含むチューブに移します。慎重に細胞ペレットを乱すことなくチューブから細胞培養培地を吸引します。 </li></ol></li><li>チューブ中の細胞にDNアーゼI処理したウイルス接種物の適切な量を追加し、穏やかにピペッティングによりよく混ぜます。 80×10 6細胞について、DNアーゼI処理ウイルス（P24-同等のウイルスの50μgの）の30ミリリットルを使用します。 注：機能のPICの単離は、感染の非常に高い多重度（MOI）で標的細胞に感染する必要があります。 </li><li> 2 6ウェル組織培養プレートの間で均等に混合物を分配する（ すなわち、12×2.5-mLのアリコートを、未感染あたり2プレートを使用イオン）。 </li><li>スピノキュレーションのために、2時間、480×gでスイングバケットローターを用いてプレートキャリアと遠心分離機で培養プレートに置き、25℃。 </li><li> 5時間spinoculated 37℃で細胞を、5％CO 2でインキュベートします。 </li></ol>感染細胞の3収穫や溶解（BSL3ラボ） <ol><li>細胞は50 mLのコニカル遠心チューブ（〜30 mLの合計）に培養プレートから各感染症に対応するプール。 </li><li> 10分間、300×gで、25℃での遠心分離により細胞を回収。慎重に（あるいは、ピペットを使用）チューブから上清を吸引除去します。 </li><li> - / - （150ミリモルのKCl、20mMのHEPES、pH7.6の、5mMのMgCl 2）、300×gで、25°Cのためにサンプルを遠心分離し、残留ウイルス粒子を除去するために、緩衝液Kの2ミリリットルを添加することにより、各細胞ペレットを洗浄10分。その後、ペレットを乱すことなく、慎重に吸引またはピペットを使用して、上清を除去します。 </li><li> Repeaトンのステップ3.3。 </li><li>慎重にマイクロピペットを使用して、任意の残った液を取り除き。氷冷溶解バッファーのK + / +（ - / -バッファK 0.025％ジギトニン、1 mMのDTT、20μgの/ mLのアプロチニンを補充した）2mL中に再懸濁各細胞ペレットを、穏やかなピペッティングによって内容物を混合し、への転送2mLのマイクロチューブ。 </li></ol>細胞質のPICの4準備（BSL3ラボ） <ol><li> 10分間室温でロータリーシェーカー上でサンプルをロック。 </li><li> 1,500×gで、4℃に予備冷却回転子を、サンプルを遠心分離し、4分間、4°C。 </li><li>ペレットを乱すことなく、慎重に1分間16,000×gで4℃で新鮮なマイクロ遠心チューブと遠心分離機に上清を移します。 </li><li>慎重に新しいマイクロ遠心チューブに上清を移します。 30分（なし揺動）をRTで内容を20μgの/ mLの（PICを2mLのための2μL）の最終濃度までのRNase A（20 mg / mlで）を追加し、インキュベートします。&lt;/李&gt; <li> 7％の最終濃度にし、穏やかにピペッティングによりよく混ぜ（ - - /バッファKにワット60％/ v）のスクロースを追加します。長期保存のために-80℃の冷凍庫に微量遠心管、液体窒素中でフラッシュ凍結し、場所でのPICのアリコート（ 例えば、200μL）を準備します。 </li></ol> インビトロの統合5. HIV-1のPICを使う（IVI）アッセイ<ol><li>カスタムメイドのプライマー、phiX174-FとphiX174-Rを用いたPCRでphiX174プラスミドDNAから2.0キロバイトの領域を増幅することにより、IVIアッセイで使用した標的DNAを準備します。 <ol><li> 表1に記載されているようにPCR混合物を組み立てます。 表2に推奨サーマルサイクリング条件を用いてサーマルサイクラーにPCRを行います。 （メーカー推奨のプロトコルに従って）ゲル精製キットを用いて、PCR産物をゲル精製し、そして使用するまで-80℃でアリコートとして精製された標的DNAを保存します。 </li></ol></li><li> 200に標的DNAの600 ngの追加 - ＆＃181;のPICのLアリコートを、よく混ぜ、45分間37℃でインキュベートします。 注：インテグラーゼ阻害剤（ 例えば、ラルテグラビル）を標的DNAを省略したりなど、IVIの反応はコントロール反応を推奨しています。 </li><li> 0.5％、8 mMの、それぞれ0.5 mg / mlでの最終濃度までSDS、EDTA、及びプロテイナーゼKを添加することにより、IVI反応を停止させます。反応内容物を完全に混合し、56℃で一晩インキュベートします。 </li><li>翌日、フェノール/クロロホルム抽出及びエタノール沈殿によりIVI反応からの全DNAを精製します。 16,000×gで、室温ですべての遠心操作を実行します。 </li><li> 2分間、脱タンパクサンプルに等量のフェノールを加え、ボルテックスで激しく混合し、遠心。慎重に上部の水相を除去し、新しいチューブに移します。 </li><li>繰り返し手順5.5。新しいチューブに上部の水相を転送します。 </li><li> 、クロロホルム混合物ボルテックスで激しく混合し、遠心分離器のfo：1フェノール：1等量の追加R 2分間。新しいチューブに上部の水相を転送します。 </li><li> 、等量のクロロホルムを加え、ボルテックスで激しく混合し、2分間遠心します。新しいチューブに上部の水相を転送します。 </li><li> DNAを沈殿させ、最終0.3 Mの濃度、および100％エタノール（氷冷）の2.5倍量には0.1μg/μL、酢酸ナトリウムの3 Mの最終濃度にグリコーゲンを追加します。コンテンツを収集し、-80°CO / Nでチューブを配置するために、短時間遠心分離を混合する渦。 </li><li>次の日は、16,000×gで30分間サンプルを遠心分離し、30分間、4°C。ペレットを乱さないように注意して上清を除去します。 </li><li> 16,000×gでペレットや遠心分離機に80％エタノール（氷冷）の500μLを加え、4℃で10分間。 RTでDNAペレットを空気乾燥し、完全にヌクレアーゼフリー水50μLに再懸濁します。 -20℃でDNAサンプルを保管してください。 </li></ol>定量化PIC活動6. PCRアッセイ<ol><li>統合されたHIV-1 DNAの接合部を増幅するために（それぞれ、LTRとphiX174プライマー）ウイルスのLTRおよびphiX174 DNAを標的とするプライマーを用いて、第1ラウンド従来のPCRを行います。 <ol><li> 表3に記載されているように第一ラウンドPCR混合物を組み立てます。鋳型DNAを除くすべてのコンポーネントのマスターミックスを組み立て、別々のPCRチューブに45-μLアリコートを分配し、鋳型DNAまたはヌクレアーゼフリー水（コントロール）の5μLを追加します。 </li><li> 表4に、推奨サーマルサイクリング条件を用いてサーマルサイクラーにPCRを行います。 </li></ol></li><li>選択的に第一-ROから統合vDNA配列を増幅するために、ウイルスLTR（LTR-RおよびLTR-Uプライマー）の短い領域に隣接するプライマーを用いて、第2ラウンドのqPCRを実行しますウントPCR産物。統合vDNAコピー数を決定するために、既知のコピー数の10倍連続希釈液を使用して標準曲線を生成する（ 例えば、10 0から10まで 8）HIV-1分子クローンの。 <ol><li> 表5に説明したように、第2ラウンドのqPCR混合物を組み立てます。 96ウェルPCR反応プレート中のウェルの適切な数に25μLのアリコートを分配慎重に、テンプレートDNAを除くすべてのコンポーネントのマスターミックスを組み立て、その後、未精製の第一ラウンドのPCR産物またはヌクレアーゼフリー水を5μLを追加（コントロール）。三重ですべてのqPCR反応を実行します。 </li><li>リアルタイムPCR装置にPCRプレートをロードし、 表6に推奨サイクリング条件を用いて定量PCRを行います。 </li><li>適切なソフトウェアを使用してデータを分析します。 </li></ol></li></ol>

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	<li>Sattentau, Q. J., Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CD4+antigen:+physiological+ligand+and+HIV+receptor.">The CD4 antigen: physiological ligand and HIV receptor.</a> Cell. 52 (5), 631-633 (1988).</li><li>Wilen, C. B., Tilton, J. C., Doms, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+HIV+entry.">Molecular mechanisms of HIV entry.</a> Adv Exp Med Biol. 726, 223-242 (2012).</li><li>Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nucleoprotein+complex+mediates+the+integration+of+retroviral+DNA.">A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA.</a> Genes Dev. 3 (4), 469-478 (1989).</li><li>Bukrinsky, M. I., Sharova, N., Dempsey, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+nuclear+import+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+preintegration+complexes.">Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes.</a> Proc Natl Acad Sci. 9 (14), 6580-6584 (1992).</li><li>Hansen, M. S., Smith, G. J., Kafri, T., Molteni, V., Siegel, J. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+complexes+derived+from+HIV+vectors+for+rapid+assays+in+vitro.">Integration complexes derived from HIV vectors for rapid assays in vitro.</a> Nature biotechnol. 17 (6), 578-582 (1999).</li><li>Farnet, C. M., Haseltine, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+DNA+in+vitro.">Integration of human immunodeficiency virus type 1 DNA in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci. 87 (11), 4164-4168 (1990).</li><li>Fujiwara, T., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration:+structure+of+an+integration+intermediate.">Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate.</a> Cell. 54 (4), 497-504 (1988).</li><li>Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correct+integration+of+retroviral+DNA+in+vitro.">Correct integration of retroviral DNA in vitro.</a> Cell. 49 (3), 347-356 (1987).</li><li>Lewinski, M. K., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+DNA+integration--mechanism+and+consequences.">Retroviral DNA integration--mechanism and consequences.</a> Adv Genet. 55, 147-181 (2005).</li><li>Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+DNA+integration:+mechanism+of+viral+DNA+cleavage+and+DNA+strand+transfer.">HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer.</a> Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).</li><li>Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+retroviral+integration.">Genetics of retroviral integration.</a> Ann rev gen. 26, 527-544 (1992).</li><li>Panganiban, A. T., Temin, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+terminal+nucleotides+of+retrovirus+DNA+are+required+for+integration+but+not+virus+production.">The terminal nucleotides of retrovirus DNA are required for integration but not virus production.</a> Nature. 306 (5939), 155-160 (1983).</li><li>Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+HIV-1+virion+genesis.">The cell biology of HIV-1 virion genesis.</a> Cell host microbe. 5 (6), 550-558 (2009).</li><li>Sherman, P. A., Fyfe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+immunodeficiency+virus+integration+protein+expressed+in+Escherichia+coli+possesses+selective+DNA+cleaving+activity.">Human immunodeficiency virus integration protein expressed in Escherichia coli possesses selective DNA cleaving activity.</a> Proc Natl Acad Sci. 87 (13), 5119-5123 (1990).</li><li>Katzman, M., Katz, R. A., Skalka, A. M., Leis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+avian+retroviral+integration+protein+cleaves+the+terminal+sequences+of+linear+viral+DNA+at+the+in+vivo+sites+of+integration.">The avian retroviral integration protein cleaves the terminal sequences of linear viral DNA at the in vivo sites of integration.</a> J Virol. 63 (12), 5319-5327 (1989).</li><li>Craigie, R., Mizuuchi, K., Bushman, F. D., Engelman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+in+vitro+assay+for+HIV+DNA+integration.">A rapid in vitro assay for HIV DNA integration.</a> Nucl acid res. 19 (10), 2729-2734 (1991).</li><li>Bushman, F. D., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activities+of+human+immunodeficiency+virus+(HIV)+integration+protein+in+vitro:+specific+cleavage+and+integration+of+HIV+DNA.">Activities of human immunodeficiency virus (HIV) integration protein in vitro: specific cleavage and integration of HIV DNA.</a> Proc Natl Acad Sci. 88 (4), 1339-1343 (1991).</li><li>Pauza, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+bases+are+deleted+from+the+termini+of+HIV-1+linear+DNA+during+integrative+recombination.">Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination.</a> Virology. 179 (2), 886-889 (1990).</li><li>Engelman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+analysis+of+HIV-1+preintegration+complexes.">Isolation and analysis of HIV-1 preintegration complexes.</a> Meth Mol Biol. 485, 135-149 (2009).</li><li>Engelman, A., Oztop, I., Vandegraaff, N., Raghavendra, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+HIV-1+preintegration+complexes.">Quantitative analysis of HIV-1 preintegration complexes.</a> Methods. 47 (4), 283-290 (2009).</li><li>Addai, A. B., Pandhare, J., Paromov, V., Mantri, C. K., Pratap, S., Dash, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cocaine+modulates+HIV-1+integration+in+primary+CD4++T+cells:+implications+in+HIV-1+pathogenesis+in+drug-abusing+patients.">Cocaine modulates HIV-1 integration in primary CD4+ T cells: implications in HIV-1 pathogenesis in drug-abusing patients.</a> J Leuk Biol. 97 (4), 779-790 (2015).</li><li>Wehrly, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p24+antigen+capture+assay+for+quantification+of+human+immunodeficiency+virus+using+readily+available+inexpensive+reagents.">p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents.</a> Methods. 12 (4), 288-293 (1997).</li></ol>

著者には、競合する金融・非金融利益を宣言しません。

レトロウイルスのPICの生化学的分析は、レトロウイルスDNAの統合のメカニズムに重要な洞察を提供しています。レトロウイルスのPICの統合活性の測定は、プラーク形成アッセイ、サザンブロット分析、およびネストされた定量PCRにより達成することができます。プラークアッセイの実験戦略は面倒であり、統合6、7、18を測定するための間接的な方法を利用しています。サザンブロットベースアッセイ対策統合は、直接が、PICの6、7、18の比較的高い量を必要とします。 このレポートでは、in vitroで HIV-1 PIC-関連統合活性を測定するためのネストされた定量PCR戦略を詳しく説明します。この方法の主な利点と重要性は、反応あたりPICの準備の比較的少量の要件である4、5、19。この方法の最も重要なステップは、感染のための高力価のウイルスの発生やPIC製剤の取り扱いです。 PCRの最初のラウンドは、統合接合部の指数関数的増幅を含むことに留意すべきです。これにより、第2ラウンドの定量PCRで決定集積vDNAのコピー数は、従って、PIC関連vDNAコピーの尺度を与えないという制限している半定量的であり。しかし、PIC-関連vDNAはLTR特異的プライマーとのPICから精製されたDNAの定量PCRによって決定することができます。統合vDNAの比率は、in vitroでの統合反応の統合効率に関する情報を提供することができ、対応するPIC-関連vDNAに番号をコピーします。この方法では、両方の方向での統合を検出するように選択し、他のプライマーの他の異種標的DNAを組み込むことによって改変することができます。要約すると、方法ここで説明する定量的HIV-1のPICの統合活性を測定し、レトロウイルス組み込みの生化学的な詳細の理解を開発する研究のために採用することができます。

初期および後期のイベント：標的細胞におけるHIV-1複製は、大きく2段階にグループ化された複数のステップを伴います。 HIV-1順次標的細胞表面受容体CD4二共受容体（CCR5またはCXCR4）1のいずれかに結合したときに初期のイベントが始まります。その結果、ウイルスの細胞膜が融合、およびウイルスカプシド（CA）コアが細胞質2に放出されます。 CAのコアは、ウイルスゲノムの一本鎖RNA（ssRNA）と原点におけるウイルスおよび細胞の両方のいくつかのタンパク質が含まれています。 CA関連ウイルスタンパク質は、逆転写酵素（RT）及びインテグラーゼ（IN）、ウイルス複製の初期のイベント中に重要なステップを仲介する二つの酵素が含まれます。それぞれRTおよび複合核タンパク質複合体、すなわち逆転写（RTC）とプレインテグレーション複合体（PIC）の文脈で機能IN、3、4、5 &lt;SUP&gt;、6。ウイルスのssRNAゲノム港ターミナルリピート（R）ユニークな配列の（5時U5 &#39;末端）および（3時U3&#39;末端）に隣接する要素の両端。 RTCは、二本鎖（ds）DNAコピー（vDNA）へのウイルスのssRNAゲノムを変換します。この逆転写プロセスは、従ってvDNA 7,8の両端の長い末端反復（LTR）を生成し、U5及びU3配列の重複をもたらします。その後、PIC-関連INは宿主染色体9、10、11にvDNAの統合を可能にする2つの連続生化学反応を触媒します。まず、細胞質内で、多量体の両方のLTR 12に係合および3 &#39;末端のそれぞれからジヌクレオチドを切断します。この3 &#39;末端の処理は、各3&#39;末端vDNAの（CA OH）にヒドロキシル基を生成します。INは千鳥状に染色体DNAの両方の鎖を切断する求核剤としてOH vDNA CAを使用する、請求次に、PICは、核に入稿。同時に、INは協調染色体DNAの反対の鎖上に得られたリン酸ジエステル結合にvDNAの両端を継ぎ。この鎖の転写工程に続いて、宿主細胞機構は、5 &#39;vDNAの両端と修理に2つの不対ヌクレオチド組み込み部位の接合部に続く一本鎖ギャップを削除します。初期の事象は、このようにHIV-1ゲノムの統合されたDNAコピー（プロウイルス）の設立で絶頂に達します。プロウイルスは、ウイルスにコードされたタンパク質の発現を含む、後のイベントを、開始し、効率的なウイルス遺伝子の発現に適した環境を提供します。未成熟ウイルスのアセンブリ。そして、リリース、および感染性ビリオン13への成熟出芽。 精製された組換えレトロウイルスINはに有能ですin vitroで 、行って、両方の3 &#39;末端プロセシングおよび鎖移転活動は、上の外因LTRのような基質DNA供給します。このような精製された組換えINを用いて生化学的研究は、vDNA統合14、15、16、17の重要な側面を明らかにしました。しかし、自然感染とは異なり、このインビトロ生化学反応は、標的DNAに基質DNAの両端の協調統合をサポートしていません。これとは対照的に、急性感染細胞から単離されたレトロウイルスのPICは、協奏異種標的DNAの中に内在性vDNAの両端を統合します。これは、単離された天然のPICを使って広く採用し、I nはインビトロインテグレーション（IVI）アッセイのその後の改良につながりました。 最初に報告されたレトロウイルスIVIアッセイでは、細胞からの細胞質抽出物は、組換えマウスに感染させましたそのLTRに大腸菌supF遺伝子を有する白血病ウイルス（MLV）は、IN活動の源を務め、および溶菌成長の欠損変異体ラムダファージのDNAは、外因的に標的DNAとして供給しました。組換えMLV DNAの統合を成功さは、ファージDNAにコピーして、その後のsupF式は、組換えファージのプラーク形成能力の回復につながりました。しかし、この実験的な戦略は面倒であり、間接的な方法で統合を測定します。このような警告に対処するために、vDNAは外因性の線形化バクテリオphiX174 DNAに組み込まれ、内因性の尺度としてPIC関連IVI活動を定量化するサザンブロットベースの間接末端標識アッセイは、18、7、6開発されました。この方法は、組込み事象の直接的な測定を提供するが、PICの調製の比較的高い量は技術的に困難なままである、必要とされます努力。これを回避するには、写真のわずかな量を必要とするネストされたPCRベースのアッセイは、19 5、4開発されました。 この報告書では、我々は、in vitroの方法で 、ネストされたベースのPCRの更新バージョンを記述自然感染時に発生するHIV-1 PIC媒介統合アクティビティを再現するために考案しました。この方法は、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）を用いて測定された内因性のPIC活性の供給源として、HIV-1に感染した標的細胞の細胞質抽出物を使用します。 PICを単離し、それらの統合の活動を測定するための手順は、エンゲルマンの実験室20によって発行されたプロトコルから、修正を加えて、適合されています。この方法では、PIC関連積分活性は、外因性の直鎖標的DNA 21から得られたDNA産物を提供することによって開始されますこの統合化反応を精製し、その後のPCRに基づく定量化のための出発物質として使用されます。第一ラウンドの従来のPCRにおいては、ウイルス標的DNAの接合は、適切なプライマーを用いて増幅されます。第二ラウンドでのqPCRは、LTR特異的プライマーは、具体的には第一ラウンドのPCR産物からvDNA集団を豊かにするために使用されています。この方法の詳細な説明のためのプロトコルのセクションを参照してください。 レトロウイルスのPICを用いたin vitroの研究では、レトロウイルスDNAの統合のメカニズムの理解にとINの阻害剤の開発に大きな進歩につながっています。 HIV-1の統合におけるウイルスと宿主因子の役割を決定し、薬剤耐性との闘いに向けて新たな抗ウイルス薬の開発、マッピング、HIV-1の統合サイトでの最近の増加の焦点に基づいて、我々は、IVIアッセイの関心の高まりや広範な使用を想定します、この報告書に記載のものなどがあります。これは、今度は、につながりますそれによって、そのアプリケーションの範囲を多様化する方法で将来の改良、。

<table align="left" border="1" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:679px;" width="679">
	<tbody>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Fetal bovine serum (FBS)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			GIBCO/Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			10437-028
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;height:34px;">
			Heat-inactivated Fetal bovine serum (Hi-FBS)
			</td>
			<td style="width:198px;height:34px;">
			GIBCO/Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;height:34px;">
			10438-026
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;height:42px;">
			Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)
			
			</td>
			<td style="width:198px;height:42px;">
			GIBCO/Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;height:42px;">
			11995-065
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium
			</td>
			<td style="width:198px;">
			GIBCO/Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			11875-093
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Phosphate buffered saline (PBS) (1X)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			GIBCO/Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			20012-027
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Trypsin-EDTA (0.25%)
			
			</td>
			<td style="width:198px;">
			GIBCO/Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			25200-056
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Penicillin-Streptomycin solution (100x)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Cellgro/Mediatech
			</td>
			<td style="width:138px;">
			30-002-CI
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			HEK293T cells (293T)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			American Type Culture Collection (ATCC)
			</td>
			<td style="width:138px;">
			CRL-3216
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			HIV-1 proviral molecular clone pNL4-3
			</td>
			<td style="width:198px;">
			NIH AIDS Research and Reference Reagent Program
			
			</td>
			<td style="width:138px;">
			114
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			PolyFect transfection reagent
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Qiagen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			301107
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			DNase
			
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Calbiochem/Merckmillipore
			</td>
			<td style="width:138px;">
			260913
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Immulon 2HB 96-well plates
			
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Thermo Scientific
			
			</td>
			<td style="width:138px;">
			3455
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Triton X-100
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			T9284
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			ELISA coating antibody: anti-CA-183-H12-5C monoclonal antibody
			</td>
			<td style="width:198px;">
			NIH AIDS Research and Reference Reagent Program
			
			</td>
			<td style="width:138px;">
			1513
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			ELISA wash solution (0.2% Tween-20 in PBS)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			---
			</td>
			<td style="width:138px;">
			---
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Donor bovine serum
			</td>
			<td style="width:198px;">
			&#160;Gibco/Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			16030074
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;height:78px;">
			Blocking Buffer (5% donor bovine serum in PBS) - Prepare fresh before use.
			
			</td>
			<td style="width:198px;height:78px;">
			---
			</td>
			<td style="width:138px;height:78px;">
			---
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Sample diluent (SD) buffer (10% donor bovine serum and 0.5% Triton X-100 in PBS) - Sterilize using 0.22 micron pore-size syringe filter and store aliquots at 4&#176;C.
			
			</td>
			<td style="width:198px;">
			---
			</td>
			<td style="width:138px;">
			---
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Recombinant p24 protein
			(Full-length CA protein was expressed from pET21a-CA plasmid in E. coli BL21-DE3 and purified as described in Ref # ----)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Dr. Wesley Sundquist
			</td>
			<td style="width:138px;">
			---
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			HIV IgG
			</td>
			<td style="width:198px;">
			NIH AIDS Research and Reference Reagent Program
			
			</td>
			<td style="width:138px;">
			3957
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Goat anti-human IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, HRP conjugate
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Pierce/ThermoFisher
			
			</td>
			<td style="width:138px;">
			31412
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			TMB Microwell Peroxidase substrate system
			</td>
			<td style="width:198px;">
			KPL, Inc.
			</td>
			<td style="width:138px;">
			50-76-00
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			SupT1 cells
			</td>
			<td style="width:198px;">
			American Type Culture Collection (ATCC)
			</td>
			<td style="width:138px;">
			CRL-1942
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			HEPES pH 7.2-7.5
			(ready-to-use solution)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			GIBCO/Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			15630-080
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Potassium chloride (KCl) solution
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			60142
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Magnesium chloride (MgCl2) solution
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			M1028
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Dithiothreitol (DTT)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			43815
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Aprotinin
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			A6106
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Digitonin
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			D141
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			RNase A
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			12091-021
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;height:29px;">
			Sucrose
			</td>
			<td style="width:198px;height:29px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;height:29px;">
			S0389
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			phiX174 Replicative Form 1 DNA
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Promega
			</td>
			<td style="width:138px;">
			D1531
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			PhiX174-F primer:
			5&#8217;-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3&#8217;
			
			PhiX174-R primer:
			5&#8217;-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3&#8217;
			
			
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Invitrogen and/or IDT-DNA
			</td>
			<td style="width:138px;">
			
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			dNTP mix
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Promega
			</td>
			<td style="width:138px;">
			U1515
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Go Taq DNA Polymerase
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Promega
			</td>
			<td style="width:138px;">
			M3005
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Qiaquick gel extraction kit
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Qiagen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			28706
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Ultrapure distilled water
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			10977-015
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Tris-EDTA (TE) buffer (100X)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			T9285
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Sodium dodecyl sulphate (SDS)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			L3771
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;height:50px;">
			Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt (EDTA) solution, 0.5 M, pH 8.0
			</td>
			<td style="width:198px;height:50px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;height:50px;">
			E7889
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Proteinase K (20 mg/ml ready-to-use solution)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Qiagen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			19131
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Phenol (equilibrated with 10&#160;mM Tris HCl, pH&#160;8.0 and 1&#160;mM EDTA)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			P4557
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Chloroform
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			288306
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Glycogen (5 mg/ml solution)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Ambion/Invitrogen
			</td>
			<td style="width:138px;">
			AM9510
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Sodium acetate (3M, pH 5.2)
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			57899
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Ethanol
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Sigma-Aldrich
			</td>
			<td style="width:138px;">
			E7023
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			First round LTR primer:
			5&#8217;-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3&#8217;)
			First round phiX174 primer:
			5&#8217;-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3&#8217;
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Invitrogen and/or IDT-DNA
			</td>
			<td style="width:138px;">
			---
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			Second round LTR-R primer:
			5&#8217;-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3&#8217;
			Second round LTR-U primer:
			5&#8217;-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3&#8217;;
			
			Second round Taqman probe:
			&#160;5&#8217;-56- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC
			CTTGAGTGC/36-TAMRA/-3&#8217;
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Invitrogen and/or IDT-DNA
			</td>
			<td style="width:138px;">
			---
			</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="width:312px;">
			iQ Supermix
			</td>
			<td style="width:198px;">
			Bio-Rad
			</td>
			<td style="width:138px;">
			170-8862
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of in vitro integration activity of hiv-1 preintegration complexes

HIV-1エンベロープタンパク質は、細胞質へのウイルスのカプシド（CA）コアの放出に続いてウイルスの細胞膜融合をもたらす、標的細胞表面上の同族受容体に係合します。その後、ウイルス逆転写酵素（RT）は、同名核タンパク質複合体の一部のような複雑な逆転写（RTC）は、二本鎖DNAコピー（vDNA）へのウイルスの一本鎖RNAゲノムを変換と呼ばれます。これは、他の核タンパク質複合体の生合成につながる、vDNAと関連するウイルスタンパク質と宿主因子で構成される統合前複合体（PIC）は、と呼ばれます。 PIC関連ウイルスインテグラーゼ（IN）は、時間的および空間的に調節二段階プロセスで宿主染色体DNAへvDNAの統合を調整します。まず、INは、細胞質内vDNAの3 &#39;末端を処理して、PICは、核に入稿した後に第二、それは染色体DNAに加工vDNAの組込みを媒介します。 PICには、単離されました急性HIV-1に感染した標的細胞から、彼らは外因的に添加された異種標的DNAに関連vDNAを統合する能力があるとして、in vitroで機能的です。このようなインビトロの統合アッセイで PICベースのかなりレトロウイルス組み込みのメカニズムの詳細を描写するおよび阻害剤IN発見に貢献しています。本稿では、単離された天然のPICのin vitroでの統合の活性を測定するためのネストされたリアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）ベースの戦略を採用して更新されたHIV-1のPICアッセイに手の込んだ。

HIV-1のPICの単離 急性感染のSup-T1細胞からのHIV-1のPICの単離のために使用されるプロトコルの概略図を図1に示されています。このプロトコルは、エンゲルマンらによって記載された方法に由来します。 19、20。 HIV-1のPICは、感染細胞内で組み立てられ、逆転写vDNAで構成されている核タンパク質複合体、ウイルスタンパク質、および細胞性因子19、20です。このレポートに記載された方法は、PIC-関連統合活動の源としてのHIV-1感染細胞の細胞質抽出物を使用しています。 HIV-1のPICの in vitro での統合アクティビティ で 図2に示されています。この方法は、PIC-関連IVI活性を測定するためのネストされた定量PCRベースの戦略を利用して、手順はエンゲルマン室19、20、21によって発行されたプロトコルから、変形して、適合されています。この方法では、PIC関連積分活性は、異種の線状ターゲットDNA 21を設けることにより開始され、この統合反応から得られたDNA産物を精製し、その後のPCRに基づく定量化のための出発物質として使用されます。第一ラウンドの従来のPCRにおいては、ウイルス標的DNAの接合は、適切なプライマーを用いて増幅されます。第二ラウンドでのqPCRは、LTR特異的プライマーは、具体的には第一ラウンドのPCR産物からvDNA集団を豊かにするために使用されています。プロトコルのを参照してください。この方法の詳細についてはection。 IVIアッセイの代表的な結果は、HIV-1のPICは、 図3に示されている使用して行きました。燮-T1細胞（80×10 6細胞/感染症）は480で阻害剤ラルテグラビルが1μmHIV-1の非存在下または存在下でのDNase 1で処理されたHIV-1（P24相当の〜50μgの）30mLでspinoculatedましたXGと2時間25°C。細胞を37℃で5時間、5％CO 2のために続いて培養しました。プロトコルセクションに記載されているようのPICを単離しました。 IVI反応を45分間37℃で、各々用いて写真の200μLと標的DNAの600 ngの（PCRによってphiX174 DNAから増幅された2kbのDNA断片）を行いました。反応は、56℃のCO / NでSDSおよびEDTAの存在下でプロテイナーゼK処理により除蛋白しました。クロロホルム（1：1）反応生成物を一旦フェノールで、二回フェノール抽出された混合物を、一旦クロロホルムで。その後、DNAをエタノール沈殿した塩と共沈殿グリコーゲンの存在であった、そしてDNAペレットを80％エタノールで1回洗浄しました。精製されたDNAは、ヌクレアーゼを含まない水50μLに再懸濁しました。ネストされた定量PCR戦略はphiX174 DNAに組み込まvDNAの数を決定するために使用しました。第一ラウンドの従来のPCRにおいて、phiX174標的DNAとウイルスのLTR領域の配列に相補的なプライマーは、統合反応のDNA産物の5μLから統合されたウイルス標的DNA接合を増幅しました。第二ラウンドのqPCRにおいては、LTR-またがるプライマーはもっぱら第一ラウンドのアンプリコン産物の5μLから、既知のコピー数（10 8 -10）の10倍連続希釈物からHIV特異的DNA配列を増幅するために使用されましたHIV-1分子クローンの（基準）。 すべてのqPCR反応は、三重、データWERで行いましたeは商用ソフトウェアを用いて分析しました。標準から得られた値を積分vDNAコピー数を補間し、そこから標準曲線を生成するためにプロットしました。エラーバーは標準偏差を表します。 図3に示すように 、HIV-1のPICは、ロバスト標的DNA（レーン5）に関連vDNAを統合します。重要なことには、写真のIVI効率を大幅IN阻害剤ラルテグラビル（レーン6）を補充した反応で低下しました。これは強く、HIV-1 INにこのアッセイで測定された統合アクティビティ属性。また、非感染細胞（レーン1）、単独でのPIC（レーン2）から細胞質溶解物を含有するコ​​ントロール反応は、単独（レーン3）DNAを標的にし、緩衝液のみ（レーン4）任意の統合活性を示しませんでした。また、第一回目のPCRにおけるTaqポリメラーゼを除外コントロール（レーン7）は、統合製品を増幅しませんでした。注目すべきは、PICの単独の対照（レーン2）からのデータは、ネストされた定量PCR戦略の仕ことが示されました的に統合されたvDNAではなくPIC-関連vDNAを測定します。まとめると、これらのデータは、PIC-関連積分活性の測定を示します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/54581/54581fig1.jpg" /> 図1：HIV-1のPICの調製のためのプロトコルの概略図。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54581/54581fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> PICを含む細胞質抽出物は、HIV-1感染燮-T1細胞から単離されています。これらのPICは、インビトロ統合アッセイにおける積分活性の供給源として使用されます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/54581/54581fig2.jpg" /> 図2：in vitroでの略図 </e<html> HIV-1のPICのメートル&gt;統合アッセイ。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54581/54581fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 統合アッセイは、HIV-1のPICおよび異種標的phiX174 DNAを用いてインビトロで実施しました。集積HIV-1 DNAは、第一ラウンドの従来のPCRはvDNA特異的配列を優先的に第二ラウンド定量PCRで増幅されてから統合接合を増幅し、前記ネステッドPCR戦略によって測定しました。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/54581/54581fig3.jpg" /> 図3：HIV-1 PIC-関連vDNA統合活動。 <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54581/54581fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 「FOする：キープtogether.within-ページを= &quot;1&quot;&gt;統合vDNAはの10倍段階希釈液を使用して作成した標準曲線から導出された値をプロットすることにより決定された番号をコピーし、HIV-1 PIC-関連統合活性アッセイの代表的な結果。 HIV-1分子クローンの既知のコピー数は、すべての反応は三連で実施し、データは、市販のソフトウエアを用いて分析した。エラーバーは標準偏差を表します。 <table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 成分 </td><td> 株式 </td><td> 50μLの反応のための最終的なボリューム </td></tr><tr><td> phiX174プラスミドDNA </td><td> 10 ngの/μL </td><td> 5.0μL </td></tr><tr><td> GoTaq反応バッファー</td><td> 5倍</td><td> 10.0μL </td></tr><tr><td> dNTPヌクレオチドミックス</td><td> 10mMの各</td&gt; <td> 1.0μL </td></tr><tr><td> phiX174-Fプライマー</td><td> 10μM </td><td> 2.5μL </td></tr><tr><td> phiX174-Rプライマー</td><td> 10μM </td><td> 2.5μL </td></tr><tr><td> GoTaq DNAポリメラーゼ</td><td> （5 U /μL） </td><td> 0.25μL </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー蒸留水</td><td> - </td><td> 28.75μL </td></tr></tbody></table> 表1。 <table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> = 2分95℃ </td></tr><tr><td>サイクルの34回の繰り返し： 95°C = 30秒 53°C = 30秒 72°C = 2分</td></tr><tr><td> 72°C = 10分</td></tr><tr><td> 4°C =ホールド</td></tr></tbody></table> 表2。 <tabルのfo：キープtogether.withinページ= &quot;1&quot;のfo：キープで-next.within-ページ= &quot;常に&quot;&gt; <tbody><tr><td> 成分 </td><td> 株式 </td><td> 50μLの反応のための最終的なボリューム </td></tr><tr><td> IVI反応DNA産物</td><td> - </td><td> 5.0μL </td></tr><tr><td> GoTaq反応バッファー</td><td> 5倍</td><td> 10.0μL </td></tr><tr><td> dNTPヌクレオチドミックス</td><td> 10mMの各</td><td> 1.0μL </td></tr><tr><td> LTRプライマー</td><td> 10μM </td><td> 2.5μL </td></tr><tr><td> phiX174プライマー</td><td> 10μM </td><td> 2.5μL </td></tr><tr><td> GoTaq DNAポリメラーゼ</td><td> （5 U /μL） </td><td> 0.25μL </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー蒸留水</td><td> - </td><td> 28.75μL </td></tr></tbody></table> 表3。 <table fo:kEEP-together.withinページ= &quot;1&quot;のfo：キープで-next.within-ページ= &quot;常に&quot;&gt; <tbody><tr><td> 95°C = 5分</td></tr><tr><td>サイクルの23回の繰り返し： 94°C = 30秒 55°C = 30秒 72°C = 4分</td></tr><tr><td> 72°C = 10分</td></tr><tr><td> 4°C =ホールド</td></tr></tbody></table> 表4。 <table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 成分 </td><td> 株式 </td><td> 30μLの反応のための最終的なボリューム </td></tr><tr><td>第1ラウンドのPCR産物</td><td> - </td><td> 5.0μL </td></tr><tr><td> LTR-Rプライマー</td><td> 10μM </td><td> 0.9μL </td></tr><tr><td> LTR-Uプライマー</td><td> 10μM </td><td> 0.9μL </td></tr><tr> &lt;TD&gt; TaqManプローブ</td><td> 10μM </td><td> 0.3μL </td></tr><tr><td> iQのスーパーミックス</td><td> 2倍</td><td> 15.0μL </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー蒸留水</td><td> - </td><td> 7.9μL </td></tr></tbody></table> 表5。 <table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 95°C = 3分</td></tr><tr><td>サイクルの39回の繰り返し： 94°C = 15秒 58°C = 30秒 72°C = 30秒 プレート読みます</td></tr></tbody></table> 表6。

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Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

の測定<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

measurement-vitro-integration-activity-hiv-1-preintegration

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

7.4K ビュー.  Meharry Medical College. This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy. 

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Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

免疫・感染学

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is composed of CA protein arranged as a lattice of hexagon. The capsid is closed by 7 pentamers at the broad end and 5 at the narrow end of the cone1, 2. Encased in this capsid shell is the viral ribonucleoprotein complex, and together they comprise the core.
Following fusion of the viral membrane with the target cell membrane, the HIV-1 is released into the cytoplasm. The capsid then disassembles releasing free CA in the soluble form3 in a process referred to as uncoating. The intracellular location and timing of HIV-1 uncoating are poorly understood. Single amino-acid substitutions in CA that alter the stability of the capsid also impair the ability of HIV-1 to infect cells4. This indicates that the stability of the capsid is critical for HIV-1 infection.
HIV-1 uncoating has been difficult to study due to lack of availability of sensitive and reliable assays for this process. Here we describe a quantitative method for studying uncoating in vitro using cores isolated from infectious HIV-1 particles. The approach involves isolation of cores by sedimentation of concentrated virions through a layer of detergent and into a linear sucrose gradient, in the cold. To quantify uncoating, the isolated cores are incubated at 37&deg;C for various timed intervals and subsequently pelleted by ultracentrifugation. The extent of uncoating is analyzed by quantifying the fraction of CA in the supernatant. This approach has been employed to analyze effects of viral mutations on HIV-1 capsid stability4, 5, 6. It should also be useful for studying the role of cellular factors in HIV-1 uncoating.

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Uncoating is an essential step in the early phase of the HIV-1 life cycle and is defined as the disassembly of the capsid shell and the release of the viral ribonucleoprotein complex (vRNP). Here, we demonstrate techniques for isolating intact cores from HIV-1 virions and for quantifying their uncoating in vitro.

HIV - 1コアのin vitroでの脱殻で

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

不定冠詞<em&gt;のin vitro</em研究する&gt;共同感染モデル<em&gt;熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</emヒトの第一次単球由来の免疫細胞に&gt;-HIV-1の相互作用

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

評価するために制限酵素ベースのクローニング方法<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1サブタイプC Gag特異MJ4キメラウイルスの複製能力

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1陽性個体の血漿からエキソソームの単離

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

巨大単層ベシクル（GUV）膜への結合HIV-1のGagの可視化

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.