HIV - 1エイケン実験室での脱殻の研究は、NIHの助成金AI40364、AI50423とAI076121によってサポートされていました。 P24 ELISAで使用される試薬を含む、いくつかの重要な材料は、、NIH AIDSリサーチ＆リファレンスプログラム、エイズの部、NIAID、NIHによって提供されていました。

1。 HIV - 1粒子の製造先に進む前に、許可を得なければならないし、感染性HIVのために承認されたバイオセーフティ施設で働くためにあなたの機関のバイオセーフティのオフィスからのガイドラインに従ってください。あなたは適切なケアと安全注意をバイオセーフティ実験室で作業中に続いていることを確認する必要があります。 HIV - 1粒子の製造は、通常、リン酸カルシウムトランスフェクション法7,8を用いて HIV - 1プロウイルスDNAと293T細胞の一過性トランスフェクションによって実行されます。感染したT細胞の培養によって育成された高力価のウイルスストックにも適しています。 <ol><li> 10％ウシ胎児血清（FBS）および抗生物質を補充を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で培養293T細胞[ペニシリン（100 IU / ml）およびストレプトマイシン（100μg/ mlの）] 37℃、5％CO 2で。 </li><li> 0.25％トリプシン- EDTAとシード2 × 6を使用し、ほぼコンフルエント皿から細胞を剥離</sトランスフェクションの前に最大100 mmの培養皿ごとに9 mlの&gt;細胞一日。種子ビリオンの生産のための6つの百ミリメートル培養皿を。コアの濃縮製剤が必要な場合は、より多くの料理は、トランスフェクションのために播種することができます。 </li><li>翌日、細胞単層は、約25％コンフルエントとトランスフェクションのための準備ができているはずです。トランスフェクトされる細胞六皿のために、滅菌水2.7 mlの容積にプロウイルスDNAの120μgを持ち出す。この混合物に2.5 M CaCl 2を 0.3 mlおよび2XBBSの3 mlを追加し、上下に数回ピペッティングして適切に混合する。混合物が10〜20分間室温で放置する。 </li><li>ミックスに優しく渦巻くながら、各皿の中心に得られた混合物を滴下液1mlを追加。 35 ° C、3％CO 2インキュベータセットで一晩の料理を（〜16時間）に置きます。 </li><li>培地を吸引除去し、穏やかに5 mlのPBSを加える。 </li><li> PBSを吸引除去し、新鮮培地5mlを加える。文化37＆でのインキュベーターで細胞度、C、5％追加の24〜48時間のためのCO 2。 </li><li>ウイルス粒子を含む培養上清を収集し、50 mlコニカル遠心チューブに移す。すべての皿から上清を組み合わせて、細胞をペレット化し、破片に5分間1,500 xgで遠心。 0.45μmの孔サイズのシリンジフィルターを用いて上清をフィルターします。注意事項は、生きているウイルスでの作業中にエアロゾルの形成を最小限に抑えるよう注意が必要です。これは、遠心分離のステップの間にO -リングまたはローターバケットカバー付きコニカルチューブの使用が含まれています。これが不可能な場合は、チューブのスクリューキャップをパラフィルムでラップする必要があります。 </li></ol> 2。超遠心分離によるHIV - 1ビリオンの濃度<ol><li> 38.5ミリリットルのポリアロマー遠心管（ベックマンSW32Tiローターまたは同等品用）の培養上清（30 ml）を置きます。穏やかに5 mlのピ​​ペットを用いてPBSで20％のショ糖の5mlのソリューションを持つウイルスを含む上清をアンダーレイ。 </li><li>で3時間遠心4℃32000回転° C（R 最大で175000 × g）でペレットのウイルス粒子へ。 </li><li>チューブの底にペレットを乱さないように注意しながら、吸引して上清を取り除く。 4でチューブと場所に1XSTEバッファー（10mMのトリス- HCl [pH7.4の]、100mMのNaCl、1mMのEDTA）0.5 mlを加え℃で1時間ペレットを緩めます。静かにピペットで吸排出を数回チューブの底からペレットを切断するためにワイドボア1mlのピペットチップを使用する。次に、発泡ように注意しながら、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに緩んでペレットを転送する。ウイルスの小さな塊が分散できるように、別の1〜3時間4℃でインキュベートする。この期間中、ステップ3.1で説明したショ糖密度勾配を準備。 </li><li> 4で8000回転（6,000 × g）で上下にそっとピペットウイルス懸濁液を数回し、遠心を·残留凝集塊を除去するために1分間冷却遠心でC。このプロセス中にサンプルの寒さを保つ。 </li></ol> 3。ショ糖勾配コアを分離する遠心分離 HIV - 1のコアは、HIV - 2コア10の精製の ​​ための前述の方法の変更である&quot;スピンスルー&quot;方式9を使用して絶縁されています。 <ol><li> SW32.1Tiローター用14.5ミリリットルのポリアロマーの遠沈管に1XSTEバッファに12ミリリットルリニア30％〜70％ショ糖勾配を準備します。勾配を準備するには、かつての20 mlの勾配を使用して、代わりに近い側の70％ショ糖溶液6ml（近い出口ポートへの）と遠い側の30％ショ糖溶液6mlを。気泡は、2つのチャンバーを接続するチャネルにトラップされていないことを確認してください。底部から下部に85％ショ糖溶液1 mlを含むチューブの上部にグラデーションを送り出す旧オートイルミナフローの勾配を使用してください。ゆっくりと4で勾配を配置° C冷却するまで（2-4時間）。 </li><li>ワイドボア1mlのピペットチップを使用すると、ゆっくりと1％トリトンX - 100を含むSTEの15％ショ糖溶液0.25mlを持つグラデーションをオーバーレイ。 </LI&gt; <li>ワイドボア1mlのピペットチップを使用してSTEで7.5％ショ糖溶液0.25mlと静かにオーバーレイ。層を混合しないように注意してください。 </li><li>ステップ2.4​​から0.5 mlのウイルス懸濁液と優しくオーバーレイ。この手順は下に置かれたショ糖層の勾配と混合であらゆる妨害を避けるために慎重に行う必要があります。 </li><li>一晩4 32000回転（R 最大で187000 × g）で（16〜20時間）で予冷SW32.1Tiのバケットと遠心機でチューブを置きます℃を遠心分離機内の真空が250ミクロンに達するまで、遠心機の一時停止を避けるために、遠心分離を開始しないでください</li><li>オートイルミナフロー勾配分留塔を使用してグラデーションの上から下まで1mlの画分を集める。採取後すぐに氷中にチューブをセット。反転数回でチューブの内容物を混合し、ELISAによって定量化または逆転写酵素活性アッセイのための各フラクション50μlを撤回。 </li></ol> 4。 HIV - 1コアの局在とコアの保管<ol><li>脱外アッセイを行う前に、それは、分数はそのままHIV - 1のコアが含まれているかを判定することが重要です。これは、ステップ3.6からの50μlのアリコートを用いてp24をELISAまたは逆転写酵素活性のアッセイによって決定することができます。 </li><li>コアに関連付けられているCAの回復は、多くの場合、コアの安定性に関連しています。 P24 ELISA 9各画分からサ ​​ンプルを使用してコアに関連付けられたCAを測定します。また、各画分の逆転写酵素活性を測定する。両方の方法を使用してピークは分数10日前後になります。 </li><li>コアを含む画分をプール。コアは0.2〜0.3mlのアリコート、-80℃で液体窒素や店舗で急速冷凍℃にプールされたコアは、すぐにアリコートをアッセイを脱外に使用されるものではない場合この方法で凍結コアは脱外アッセイに適しています。コアに関連したCAの収率は通常、P24あたりミリリットルの1〜2μgのか合計ビリオン関連の約15％です。P24。 </li></ol> 5。 HIV - 1脱殻の速度論的分析<ol><li>脱殻反応ごとに必要なHIV - 1コアの量は、約50 ngのです。 in vitroの脱殻アッセイで実行するには、懸濁液の粘度を減らすために冷たい1XSTE等量のバッファーでのコアのアリコートをpredilute、ピペッティングエラーを最小限に抑える。 </li><li>さらに1.5 mlのマイクロ遠心チューブにBSAの10μg/ mlを含む冷1XSTEバッファー0.15 mlのコアの100μlを希釈する。我々は、チューブの壁に、CAの吸着を最小限に抑えるためにBSA（10μg/ mlの）とSTEバッファーを補足する。チューブを転倒数回で混ぜる。サンプルはボルテックスしないでください。 37水浴中でチューブをインキュベート° Cタイムアウト間隔（15、30、60および120分）。チューブは、さらに温暖化を確実にするためには、少なくとも、最大内部サンプルのレベルに水浴に浸漬する必要があります。 </li><li> - インキュベーションの間、静かに（通常5定期的にチューブの内容物を混ぜるチューブをフリックで10分）。ゼロ分の制御については、冷1XSTEバッファー0.15 mlのコアの100μlを希釈し、実験（120分）の全体の長さのために氷上でインキュベートする。ゼロ分の制御は、基底脱殻の値を与え、異なる時間間隔で37 ° Cでインキュベートしたコアの脱外の増加を決定するために使用されます。 </li><li>潜伏期間の終わりに、10分間氷上でチューブを配置することにより、脱外のプロセスを停止します。 </li><li> 4℃20分間℃、45000回転（R 最大で125000 × gでTLA - 55ローター）でチューブを遠心これは、ペレットはそのままコアとコアの脱外の結果として、リリースされたフリーのCAは、上清に残るでしょう。ローターは、° Cより前のサンプルをロードするために4であらかじめ冷却してください。 </li><li>好ましくは室温で保存したゲルローディングチップを使用して、新しい冷却したマイクロチューブに上清を移す。ペレットは、肉眼では表示されませんがございますので、細心の注意wを取る上清をピペッティングhile。 ELISAのサンプルの希釈液を250μl（PBS中の0.5％トリトンX - 100および5％ドナー子牛血清）でペレットを再懸濁します。ペレット、ELISAの試料希釈液を追加した後の渦の効率的な溶解を確実に。次の節で説明するようにP24 ELISAを用いてペレットと上清のCAコンテンツを定量化する。 </li><li>脱殻の範囲は、上清に存在するCAの割合を計算することによって得られる。 </li></ol> 6。 P24 ELISAによるCAのためのアッセイ<ol><li>多くの市販ELISAキットをご用意していますし、CAを定量化するために使用することができます。あらゆる商用または&quot;社内&quot;ELISAを使用して、アッセイの直線性を決定するためにP24規格が含まれています。試料の希釈は正確性を保証するためにアッセイされるべきである。 </li><li>我々は日常的にCAのアッセイに使用する自家製のELISAを開発した。手順は前回の報告書11から適応され、NIHのAIDから利用可能なキャプチャおよび検出器の抗体を使用して実行されますSの研究およびリファレンス試薬プログラム。 </li></ol> 7。代表的な結果： コアを含む画分を決定するためのELISAの結果の例を図1に示されています。分画（1ミリリットルずつ）収集した後、各フラクションからサンプルの50μlを段階希釈を作るために使用され、ELISA法により分析した。 twelve分数の値を合計したものP24は14.5μgのだ。この図の画分に8から10に含まれるコアを示した。コアを含有する分画のためのP24値は2.17μgのだ。 （14.97パーセント）コアに関連するp24の割合は、合計P24値（14.5μgの）へのコアの分画のためのP24値（2.17μg）の比をとることにより決定した。画分1または2が常にp24の最高額が含まれますが、これはコアに関連付けられていないフリーのCAを表します。これは、後続の各画分とP24の値が徐々に減少、その後急激な増加とp24の最後に急落が続いているの値。勾配のロード中に適切なケアが行われている場合、コアに関連したCAのピークは、フラクション10の周囲に見られる。 HIV - 1コアの脱外の反応速度を測定することにより得られる典型的な結果を図2に示されています。グラフは、野生型HIV - 1コアの脱外で時間依存的な増加を示しています。値を脱外％が上清に存在するCAの割合を計算することによって得られた。練習すれば、このアッセイは、非常に再現性とin vitroでのウイルスのコアの安定性を判別するのに便利です。アッセイの再現性は、手続き時にサンプルの適切な取り扱いに大きく依存することに注意してください。コアは熱に不安定なので、サンプルは℃でアッセイを通して、インキュベーション期間中を除いて4℃で維持されるべきである。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig1.jpg" /> 1平衡密度勾配遠心分離を図HIV - 1のコア。濃縮したウイルス懸濁液を1％トリトン- X - 100を重ねて30から70パーセント直線ショ糖勾配の上に塗布した。 187000 × gで、4で一晩遠心分離に続い° C、1 mlの画分を上から下へ（フラクション1）（フラクション12）から収集されたとp24をELISAによって定量した。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3384/3384fig2.jpg" /> in vitroで HIV - 1脱殻の2時間コースを示します 。精製HIV - 1のコアは、° C指定された時間間隔で希釈し、37℃でインキュベートした。ゼロ分のサンプルは、実験の全体​​の長さを氷上でインキュベートした。インキュベーション後、サンプルは4℃で20分間125000 xgで超遠心した上清とペレットは、P24 ELISAによって分離し、分析した。プロトコルのテキストで説明されているように脱殻の程度を決定した。それぞれの脱外反応は二重に行われた、エラーバーは2つの値の範囲に及ぶ。

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	<li>Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+analysis+of+conical+models+for+the+HIV-1+core.">Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core.</a> Science. 283, 80-83 (1999).</li><li>Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+reconstructions+of+helical+assemblies+of+the+HIV-1+CA+protein.">Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein.</a> Nature. 407, 409-413 (2000).</li><li>Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viral+and+cellular+factors+that+regulate+HIV-1+uncoating.">Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating.</a> Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).</li><li>Forshey, B. M., Schwedler, U. v. o. n., Sundquist, W. I., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+a+human+immunodeficiency+virus+type+1+core+of+optimal+stability+is+crucial+for+viral+replication.">Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication.</a> J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).</li><li>Forshey, B. M., Aiken, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disassembly+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores+in+vitro+reveals+association+of+Nef+with+the+subviral+ribonucleoprotein+complex.">Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex.</a> J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).</li><li>Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+capsid+mutations+on+HIV-1+uncoating.">The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating.</a> Virology. 358, 48-54 (2007).</li><li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA.">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).</li><li>Aiken, C., Prasad, V. R., Ganjam, K. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+organization+of+authentic,+mature+HIV-1+virions+and+cores.">Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores.</a> EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).</li><li>Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncoating+of+HIV-1+requires+cellular+activation.">Uncoating of HIV-1 requires cellular activation.</a> Virology. 337, 93-101 (2005).</li><li>Accola, M. A., Ohagen, A., G&#246;ttlinger, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+cores:+retention+of+Vpr+in+the+absence+of+p6(gag.">Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag.</a> J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

方法は、標的細胞にHIV - 1脱殻を分析するために、検証方法の無効性が、特にためにHIV - 1のライフサイクルのこの段階を、研究するための有用なin vitroで脱外勉強するHIV - 1のコアを浄化するためにここで説明する。このメソッドはコアを浄化するために平衡超遠心分離を使用していますが、その他は1％トリトン- X - 100 12、13または0.1％のTriton - X - 100 14、15に重ねショ糖クッションを介してペレットと簡単な溶解後に直接ペレットを使用している。 この方法で得られたコアの回復は、実験的な変動の対象となります。このプロトコルの成功の変数は、トランスフェクション効率です。一般的に我々は、勾配上でp24の少なくとも7μgのと同等のウイルス量を読み込みます。当研究室では、ウイルス産生のためのリン酸カルシウムトランスフェクション法を使用しています。他のトランスフェクションの方法も適切かもしれないが、我々は、コアの分離のためにそれらを評価していない。他の重要なVARコアの歩留まりに影響を与えるiablesはグラデーションレイヤーを適用すると、サンプルは冷たいままで取られた心配です。勾配の混合を避けるために、ショ糖勾配を準備するときに最大の注意を払う必要がある。濃縮したウイルス浮遊液をかけながらあらゆる妨害はバリアスクロース層の下に洗剤でビリオンの望ましくないと早期に接触する可能性があります。そのような長期の接触により、脆弱なコアを分解し、減少カプシド関連する可能性があります。それは、ショ糖密度勾配と手続きを通じてウイルス懸濁液の寒さを保つためにも同様に重要です。手続きは、当研究室で様々な科学者が習得し、正常に使用されています。 HIV - 1のコアは、4熱不安定であり、それは寒さと氷の上ですぐに収集された分画を配置する一方したがって、それは分画、ショ糖勾配に非常に重要です。コアの脱殻でもバッファーのpHと塩濃度に依存するので4、それは分析に進む前に、STEバッファーのpHを測定することを強くお勧めです。脱殻率は若干コアの各バッチによって異なる場合があります。脱外の反応は二重に行われるべき、との値が15％以上異なっている場合は一貫性が達成されるまで、その後の反応は三重に行ってください。無料のCAタンパク質は、試験管の内壁に付着する傾向を持つためには、チューブの壁に、CAの吸着を最小限に抑えるために反応混合物中の10μg/ mlの最終濃度でBSAを含めることが不可欠です。 前述したように、脱殻アッセイは、ここで説明する脱殻に影響を与える細胞因子を同定し、研究するために使用することができます。また、内因性の逆転写アッセイを使用してコアの逆転写でカプシド標的化合物と細胞因子の効果を研究するために使用されることがあります。十分な量のHIV - 1コアの分離、分析を許可することが免疫金電子顕微鏡法による細胞因子とのカプシドの相互作用の。

<table border="1"><tbody><tr><td width="190"> 試薬の名前 </td><td width="197"> 会社 </td><td width="114"> カタログ番号 </td><td width="161"> コメント（省略可能） </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Cellgro </td><td> 10から013 - CV </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Cellgro </td><td> 21から031 - CV </td><td></td></tr><tr><td>トリトンX - 100 </td><td> Mallinckrodtベイカー株式会社</td><td> 9002-93-1 </td><td></td></tr><tr><td>ツイーン20 </td><td>アクロス</td><td> 9005-64-5 </td><td></td></tr><tr><td> 0.25％トリプシン- EDTA </td><td> Cellgro </td><td> 25から053 - CI </td><td></td></tr><tr><td> 2XBBS </td><td></td><td></td><td>構成：50mmのBES [P H 6.95]、280 mM NaClおよび1.5mMののNa 2 HPO 4。 6.95にpHを調整する室温で。滅菌＆-20℃でアリコートで保存をフィルタリング</td></tr><tr><td>コー​​ティングの抗体：P24に対するモノクローナル抗体（183 - H12 - 5C） </td><td> NIH AIDSリサーチ＆リファレンス試薬プログラム</td><td> 3537 </td><td></td></tr><tr><td>一次抗体：HIV - Igは（高度免疫ヒト患者の血清） </td><td> NIHのエイズ研究とリファレンス試薬プログラム</td><td> 3957 </td><td></td></tr><tr><td>二次抗体： ヤギ抗ヒトIgG、共役ペルオキシダーゼ</td><td>ピアース</td><td> 31130 </td><td></td></tr><tr><td> HRP基質</td><td> KPL社</td><td> 50-76-11 </td><td></td></tr><tr><td> Immulon 2HB 96ウェルプレート</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 3455 </td><td></td></tr><tr><td> SW32TiとSW32.1のTiローターと互換性のある超遠心機</td> &lt;TD&gt;ベックマンコールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td> TLA - 55ローターと卓上超遠心機</td><td>ベックマンコールター</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高速マイクロチューブ</td><td>ベックマンコールター</td><td> 326823、358123、357448 </td><td></td></tr><tr><td>オートイルミナフロー密度勾配フラク</td><td> Labconco株式会社</td><td> 4517000 </td><td></td></tr><tr><td>勾配元</td><td> CBSサイエンティフィック（株）（株） </td><td> GM - 20 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro uncoating of hiv-1 cores

レトロウイルスのゲノムは、脂質エンベロープに囲まれたカプシドに包まれています。このようなHIV - 1のようなレンチウイルス、の場合は、円錐形のカプシドの殻は、六角形の格子として配置されたCAのタンパク質で構成されています。カプシドはコーン1、2の狭い方の端で7広い端の五量体と5でクローズされます。このカプシドの殻で覆われて、ウイルスリボ核タンパク質複合体である、と一緒に彼らは、コアを備える。 標的細胞膜とウイルス膜の融合に続いて、HIV - 1は細胞質に放出される。カプシドは、脱殻と呼ばれるプロセスで可溶性の形態3にフリーCAを解放逆アセンブルします。 HIV - 1脱殻の細胞内の場所とタイミングはよくわかっていない。キャプシドの安定性を変更するカリフォルニア州の単一アミノ酸置換はまた、細胞4を感染させるHIV - 1の能力を損なう。これは、カプシドの安定性は、HIV - 1感染に重要であることを示しています。 </p&gt; HIV - 1脱殻は、このプロセスのための高感度かつ信頼性の高いアッセイの可用性の不足のために勉強することは困難であった。ここでは、感染性HIV - 1粒子から分離されたコアを用いてインビトロで脱殻を研究するための定量的な方法を説明します。アプローチは、寒さで、洗剤の層を通って直線スクロース勾配に集中ビリオンの沈降によってコアの分離を行います。脱殻を定量するために、分離されたコアは37℃でインキュベートする·さまざまな時間間隔および超遠心分離によって、その後ペレット化のためのC。脱殻の範囲は、上清に、CAの割合を定量することによって分析されます。このアプローチは、HIV - 1キャプシドの安定性4、5、6のウイルス変異の影響を分析するために採用されています。また、HIV - 1の脱殻の細胞因子の役割を研究するために有用でなければなりません。

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In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

脱殻は、HIV - 1のライフサイクルの初期段階に必須の工程であるとカプシド殻の分解とウイルスリボ核タンパク質複合体（vRNP）のリリースとして定義されています。ここで、我々はHIV - 1ビリオンから無傷のコアを分離するためと、その脱殻を定量化するための手法を示します<em&gt; in vitroで</em&gt;。

HIV - 1コアのin vitroでの脱殻で

The genome of the retroviruses is encased in a capsid surrounded by a lipid envelope. For lentiviruses, such as HIV-1, the conical capsid shell is ...

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

15.6K ビュー.  Vanderbilt University School of Medicine. 脱殻は、HIV - 1のライフサイクルの初期段階に必須の工程であるとカプシド殻の分解とウイルスリボ核タンパク質複合体（vRNP）のリリースとして定義されています。ここで、我々はHIV - 1ビリオンから無傷のコアを分離するためと、その脱殻を定量化するための手法を示します in vitroで。

ビデオ: In vitro Uncoating of HIV-1 Cores

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

免疫・感染学

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between CD4+ T cells involves the formation of a virological synapse (VS), which is an F-actin-dependent cell-cell junction formed upon the engagement of HIV-1 envelope gp120 on the infected cell with CD4 and the chemokine receptor (CKR) CCR5 or CXCR4 on the target cell 8. In addition to gp120 and its receptors, other membrane proteins, particularly the adhesion molecule LFA-1 and its ligands, the ICAM family, play a major role in VS formation and virus transmission as they are present on the surface of virus-infected donor cells and target cells, as well as on the envelope of HIV-1 virions1,4,5,6,7,13. VS formation is also accompanied by intracellular signaling events that are transduced as a result of gp120-engagement of its receptors. Indeed, we have recently showed that CD4+ T cell interaction with gp120 induces recruitment and phosphorylation of signaling molecules associated with the TCR signalosome including Lck, CD3&zeta;, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk, and PLC&gamma;15.
In this article, we present a method to visualize supramolecular arrangement and membrane-proximal signaling events taking place during VS formation. We take advantage of the glass-supported planar bi-layer system as a reductionist model to represent the surface of HIV-infected cells bearing the viral envelope gp120 and the cellular adhesion molecule ICAM-1. The protocol describes general procedures for monitoring HIV-1 gp120-induced VS assembly and signal activation events that include i) bi-layer preparation and assembly in a flow cell, ii) injection of cells and immunofluorescence staining to detect intracellular signaling molecules on cells interacting with HIV-1 gp120 and ICAM-1 on bi-layers, iii) image acquisition by TIRF microscopy, and iv) data analysis. This system generates high-resolution images of VS interface beyond that achieved with the conventional cell-cell system as it allows detection of distinct clusters of individual molecular components of VS along with specific signaling molecules recruited to these sub-domains.

This article describes a method to visualize formation of an HIV-1 envelope-induced virological synapse on glass supported planar bilayers by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. The method can also be combined with immunofluorescence staining to detect activation and redistribution of signaling molecules that occur during HIV-1 envelope-induced virological synapse formation.

合成脂質二重膜上でHIV-1エンベロープ誘発性ウイルス学的シナプスとシグナリングのイメージング

Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infection occurs most efficiently via cell to cell transmission2,10,11. This cell to cell transfer between ...

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

Plasmodium falciparum, the causative agent of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important health problems worldwide, being responsible for a total of 4 million deaths annually1. Due to their extensive overlap in developing regions, especially Sub-Saharan Africa, co-infections with malaria and HIV-1 are common, but the interplay between the two diseases is poorly understood. Epidemiological reports have suggested that malarial infection transiently enhances HIV-1 replication and increases HIV-1 viral load in co-infected individuals2,3. Because this viremia stays high for several weeks after treatment with antimalarials, this phenomenon could have an impact on disease progression and transmission.
The cellular immunological mechanisms behind these observations have been studied only scarcely. The few in vitro studies investigating the impact of malaria on HIV-1 have demonstrated that exposure to soluble malarial antigens can increase HIV-1 infection and reactivation in immune cells. However, these studies used whole cell extracts of P. falciparum schizont stage parasites and peripheral blood mononuclear cells (PBMC), making it hard to decipher which malarial component(s) was responsible for the observed effects and what the target host cells were4,5. Recent work has demonstrated that exposure of immature monocyte-derived dendritic cells to the malarial pigment hemozoin increased their ability to transfer HIV-1 to CD4+ T cells6,7, but that it decreased HIV-1 infection of macrophages8. To shed light on this complex process, a systematic analysis of the interactions between the malaria parasite and HIV-1 in different relevant human primary cell populations is critically needed.
Several techniques for investigating the impact of HIV-1 on the phagocytosis of micro-organisms and the effect of such pathogens on HIV-1 replication have been described. We here present a method to investigate the effects of P. falciparum-infected erythrocytes on the replication of HIV-1 in human primary monocyte-derived macrophages. The impact of parasite exposure on HIV-1 transcriptional/translational events is monitored by using single cycle pseudotyped viruses in which a luciferase reporter gene has replaced the Env gene while the effect on the quantity of virus released by the infected macrophages is determined by measuring the HIV-1 capsid protein p24 by ELISA in cell supernatants.

An In vitro Co-infection Model to Study Plasmodium falciparum-HIV-1 Interactions in Human Primary Monocyte-derived Immune Cells

We have developed an in vitro malaria-HIV-1 co-infection model to study the impact of Plasmodium falciparum on the HIV-1 replicative cycle in human primary monocyte-derived macrophages. This versatile system can easily be adapted to other primary cell types susceptible to HIV-1 infection.

不定冠詞<em&gt;のin vitro</em研究する&gt;共同感染モデル<em&gt;熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）</emヒトの第一次単球由来の免疫細胞に&gt;-HIV-1の相互作用

Plasmodium falciparum, the causative agent  of the deadliest form of malaria, and human immunodeficiency virus type-1 (HIV-1) are among the most important ...

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

HIV-1に感染した個体からの制御性T細胞を増殖するための新しいツール

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target conserved portions of the HIV-1 genome that escape with difficulty. Sequence changes attributed to cellular immune pressure arise across the genome during infection, and if found within conserved regions of the genome such as Gag, can affect the ability of the virus to replicate in vitro. Transmission of HLA-linked polymorphisms in Gag to HLA-mismatched recipients has been associated with reduced set point viral loads. We hypothesized this may be due to a reduced replication capacity of the virus. Here we present a novel method for assessing the in vitro replication of HIV-1 as influenced by the gag gene isolated from acute time points from subtype C infected Zambians. This method uses restriction enzyme based cloning to insert the gag gene into a common subtype C HIV-1 proviral backbone, MJ4. This makes it more appropriate to the study of subtype C sequences than previous recombination based methods that have assessed the in vitro replication of chronically derived gag-pro sequences. Nevertheless, the protocol could be readily modified for studies of viruses from other subtypes. Moreover, this protocol details a robust and reproducible method for assessing the replication capacity of the Gag-MJ4 chimeric viruses on a CEM-based T cell line. This method was utilized for the study of Gag-MJ4 chimeric viruses derived from 149 subtype C acutely infected Zambians, and has allowed for the identification of residues in Gag that affect replication. More importantly, the implementation of this technique has facilitated a deeper understanding of how viral replication defines parameters of early HIV-1 pathogenesis such as set point viral load and longitudinal CD4+ T cell decline.

A Restriction Enzyme Based Cloning Method to Assess the In vitro Replication Capacity of HIV-1 Subtype C Gag-MJ4 Chimeric Viruses

HIV-1 pathogenesis is defined by both viral characteristics and host genetic factors. Here we describe a robust method that allows for reproducible measurements to assess the impact of the gag gene sequence variation on the in vitro replication capacity of the virus.

評価するために制限酵素ベースのクローニング方法<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1サブタイプC Gag特異MJ4キメラウイルスの複製能力

The protective effect of many HLA class I alleles on HIV-1 pathogenesis and disease progression is, in part, attributed to their ability to target ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

HIV-1陽性個体の血漿からエキソソームの単離

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

巨大単層ベシクル（GUV）膜への結合HIV-1のGagの可視化

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential ...

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

Macrophages are phagocytic cells that play a major role at the crossroads between innate and specific immunity. They can be infected by the human immunodeficiency virus (HIV)-1 and because of their resistance to its cytopathic effects they can be considered to be persistent viral reservoirs. In addition, HIV-infected macrophages exhibit defective functions that contribute to the development of opportunistic diseases.
The exact mechanism by which HIV-1 impairs the phagocytic response of macrophages was unknown. We had previously shown that the uptake of various particulate material by macrophages was inhibited when they were infected with HIV-1. This inhibition was only partial and phagosomes did form within HIV-infected macrophages. Therefore, we focused on analyzing the fate of these phagosomes. Phagosome maturation is accompanied by migration of these compartments towards the cell center, where they fuse with lysosomes, generating phagolysosomes, responsible for degradation of the ingested material. We used IgG-opsonized Sheep Red Blood Cells as a target for phagocytosis. To measure the speed of centripetal movement of phagosomes in individual HIV-infected macrophages, we used a combination of bright field and fluorescence confocal microscopy. We established a method to calculate the distance of phagosomes towards the nucleus, and then to calculate the velocity of the phagosomes. HIV-infected cells were identified thanks to a GFP-expressing virus, but the method is applicable to non-infected cells or any type of infection or treatment.

We describe a method to measure the velocity of phagosomes moving towards the cell center in living cells infected with or without the human immunodeficiency virus (HIV) type 1, using spinning disk confocal fluorescence microscopy to identify fluorescent infected cells and bright field microscopy to detect phagosomes.

HIV - 1コアのin vitroでの脱殻で

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