Name: tracking and quantifying developmental processes in c. elegans using open-source tools
Uploaded: 2015-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools at JoVE.com

The authors have nothing to disclose.

C.の調製エレガンス胚は、タイムラプス顕微鏡用のマイクロビーズを使用して<ol><li>歯のピック/ピペット先端に取り付けられた第1の勢いよく撹拌した後、アイラッシュを使用して、M9の隣のドロップにそれぞれワームを転送することによりM9バッファのドロップにワームピック（白金線）を使用して妊娠成虫を移し、細菌をきれいにまたは尖ったガラスキャピラリーを使用しています。 </li><li> M9緩衝液中に直径20μmのポリスチレンビーズの10倍を含有する分散液を希釈し（1 L M9バッファーが3gのKH 2 PO 4、6グラムHPO 4、5グラムのNaCl、及び、オートクレーブ後（20分、120℃2のNaが含まれC）、）、1MのMgSO 4溶液の追加の1ミリリットルを追加します。 </li><li>薄いガラスキャピラリー（例えば、注射針を引っ張るために使用されるポイントの毛細血管または毛細血管を溶融）、およそ0.5メートル長いゴムの作品、シリコーンまたは類似の材料のチューブ（理想的に透明）、200μlの任意のタイプから口のピペットを作りますピペットチップ、200μlのPCRチューブの蓋、小さな注射器（ 例えば 、0.2から0.45ミクロンの細孔径と15〜50ミリメートル直径ナイロン、PTFEまたは類似の材料のフィルター）、1000μlのピペットチップのための疎水性フィルター。口のピペットのこのタイプには、生物学的材料は、実験者と接触して得ることができないことを保証します。 </li><li>チューブに最初のヒントと200μlのピペットチップを挿入することにより、ピペットを組み立て、使用毛細血管の直径に一致する中央穿孔を持つPCRチューブの蓋を差し込みます。非常に尖っ錐または調製針が穿孔を生成するために使用することができます。 </li><li>細い毛細血管を描画し、穿孔に挿入します。チューブのもう一方の端にフィルタを挿入し、マウスピース（ 図1）として1000μlのピペットチップを挿入します。 </li><li>きれいなカミソリの刃またはメスで外陰部に横方向にワームを切断することによって妊娠成人を解剖。 注：通常、多くの胚はEになります切断後xpulsed。初期胚が必要な場合は、それらは時々目のラッシュまたは尖った針を用いてカーカスから放出されなければなりません。 </li><li>口のピペットを使用して、このドロップに24x60 mmのカバーガラスと移植胚の上に希釈したポリスチレンビーズの分散（〜4μL）のピペット一滴。 </li><li>ドロップの上にガラスをカバーして、ドロップが完全に広がっていることを確認して小さい（例えば、18×18または20×20 mm）を慎重に配置します。 注：ドロップも小さなカバーガラスの縁に触れないように十分に小さくなければなりません。 </li><li>液化ワセリンでマウントをシール。 24x60ミリメートルのカバースリップ側にイマージョンオイルの滴を追加し、「タイムラプス顕微鏡」セクションに進んでください。 </li></ol>アダルトC.の調製エレガンス動物ナノビーズを用いたタイムラプス顕微鏡用注：一般的に、成体動物を装着するためのプロトコルは、参考文献からプロトコルを適応したものです。 18。このプロトコルでは、成体動物の長期経時的共焦点顕微鏡検査を行うことができます。 <ol><li> 1.5％を準備M9緩衝液中のアガロース溶液（w / v）の、沸騰（1分、水浴または電子レンジで100℃）。これは腸および/または生殖腺の部分の押し出しにつながることができますので、アガロースのより高い濃度の使用が推奨されていません。 </li><li> 2顕微鏡スライド上に各テープの2-3層を下に貼り付けます。テープで2つのスライド間のテープなしでスライドを置きます。 </li><li>ピペットチップを使用して、中央のスライドの中央に熱いアガロース溶液の一滴を置きます。それはそれぞれの側にテープ層によってサポートされるように急速に低下に別のスライドを配置。これは、周りに直径10mmのラウンドとフラット寒天パッドを作成します。 </li><li>パッド上に（（V）/ wの2.6％である希釈せずに、）100 nmのビーズ溶液の液滴を入れてください。ワームピックとドロップに1-10清掃成虫を転送します。 Protので説明したように18×18ミリメートルのカバーガラスとワセリンとシールocol 1。 </li></ol> 3.タイムラプス顕微鏡<ol><li>顕微鏡スライドまたはカバーガラスサンドイッチ上にイマージョンオイルの滴を入れてください。サンプルを見つけるために低倍率（5倍または10倍レンズ）で明視野を使用してください。 注：（特にC.胚エレガンスのための）可能な限り多くの青色光への露出を制限し、 例えば、試料を集中ではなく、明視野を使用する/見つけるためにエピ蛍光顕微鏡を使用しないでください。 </li><li> （収集ソフトウェアに応じて、中心面またはサンプルのトップ/ボトム面のいずれか）の焦点に試料をもたらす、より高い倍率（40倍または60倍目標）に変更します。 </li><li> 1ミクロン間隔で30面にサンプリング間隔を設定するには、すべての1分を記録しました。自動化されたXY-またはXYZステージが利用可能である場合には、複数のスポットは、1回のセッションで記録することができます。蛍光イメージングに切り替え、再びフォーカスをチェックしてください。 注：むしろわずかに長い露光時間を使用し、高いレーザー出力を使用しないようにしてください非常に低い強度で。測定は、飽和を避けるために、画像取得プログラムまたはImageJのいずれかで、すぐに画像を取得し、ダイナミックレンジをトリミングし、また過度の放射線被ばくを意味しています。 </li><li>タイムラプスシリーズの記録を開始します。 注：アーティファクトを分析除外サンプルスキャン間の長い（3-10分）の時間間隔で開始し、徐々に任意の間隔に時間的なサンプリングを増やします。統計的分析を実行するときにどちらの場合も発生のタイミングだけでなく、エンドポイントは類似していなければなりません。また、毒性および生存率を評価することがしばしば必要です。したがって、長期的タイムラプス顕微鏡検査の後、マウントからの試料を回収し、彼らはライブ/開発を続けているかどうかを確認。 </li></ol> 4. IMODで3Dセルの形状モデルの再構築注：http://bio3d.colorado.edu/imod/：IMODソフトウェアは、IMODのWebページから入手可能です。ソフトウェアのインストールは説明していますそこ日間。 WindowsのOSを使用する場合は、Unixのツールキットには、IMODのWebページ上のパッケージとして見つけることができる、インストールする必要があります。また、IMODのウェブページ（http://bio3d.colorado.edu/imod/doc/3dmodguide.html）で利用可能な良好コンパイル3dmod導入があります。 <ol><li> Unixシェルを開き、「IMOD」を入力します。 IMODウィンドウが開きます。 3Dモデルを生成するために、そこから生データ（理想的に積み重ねられたTIFまたは類似）を使用してファイルを選択します。 </li><li>情報ウィンドウ（アップ＆ツールをスクロールダウン）を使用して、ZAPウィンドウ内のオブジェクトの底部と上部の位置を確認します。 </li><li>セルのアウトラインをトレースを開始します。重要なのは、各セルは一つのオブジェクトであることを確認してください。各セルの上部面で始まり、情報ウィンドウを使用して、そこに第1の輪郭を作成します。 Zを下にスクロールし、各z平面のための新しい輪郭を作成します。 </li><li> 3Dでモデル化するのに必要な数のセルに対して同じ操作を行います。新しいセルを開始するとき、新しいオブジェクトを作成することを忘れないでください。 NOTE：輪郭追跡と、いくつかの便利なプラグインのための多くの異なる方法があります。詳細については、IMODのウェブページやオンラインチュートリアルをご覧ください。ここに示す例では、デフォルトの設定が使用されています。 </li><li>オブジェクトとその輪郭を検査する「モデルビュー」ウィンドウを開きます。 </li><li> 「オブジェクト」 - 「モデルビュー」ツールバーの「編集」を選択します。それぞれの編集ウィンドウが開きます。 </li><li> 「データ型を描く」と「描画スタイル」と「塗りつぶし」と「メッシュ」を選択し、充填され、閉じたオブジェクトなどの細胞をモデル化します。ウィンドウの左下のスクロール可能な選択で「メッシュ」をクリックします。右下の選択にオプション「キャップ」を確認してください。必要な数のオブジェクトを確認し、「すべてをメッシュ」をクリックします。プログラムは輪郭のスタックからの固体のオブジェクトを生成します。 Zサンプリング係数は、「表示」ウィンドウの「Zスケール」を変えることによって調整することができます。 </li><li>移動/ 3D OBJECを回転させますトン（「編集」 - 「表示」）およびスナップショットや動画を保存（「ファイル」 - 「スナップティフとして...」または「ムービー/モンタージュ」）。 </li></ol> Endrov 5.トラッキング蛍光標識構造注：細胞分裂の残党を追跡するために、セル識別（例えば、H2B、PH-PLC-D1）および細胞分裂残骸マーカーのために、核または原形質膜マーカーで株を用いる（例えば、Nmyの-2、ZEN-4 ）。核やプラズマ膜マーカーは、細胞分裂の残骸を継承するセルを決定することが重要です。 <ol><li>高速ロードと使用を容易にするために、生データは、（ImageJの中など）、TIFFファイルに変換する必要があります。次に、オープンEndrov、ファイルメニューから「読み込みファイル」オプションを選択することによって分析するファイルをロードします。ツールバーの「2Dビューア」アイコンをクリックします。 </li><li> 「フィット範囲」アイコン（右下隅にある青いアイコンをクリックして、ヒストグラムを調整しますEndrov画面の）。 &quot;ファイル名&quot; - - &quot;Imageset&quot; - &quot;チャンネル&quot; - &quot;XYZ解像度の設定」「データ」に行くことによって、XYZ解像度を設定します。 XとYの解像度が0.2μmである場合、X、Y、Zの、 例えば、5,5、1の値を入力し、Zにすべての1ミクロンをサンプリング</li><li>核に注釈を付けるために、関心の面に移動し、「2Dビューア」をクリックしてください。ドロップダウンメニューから「リネージュ」を選択し、「新しい系譜 &quot;を選択します。 </li><li>クリックして核にドラッグすることで、マークを付けることができます。核に名前を付けるには、右クリックし、ドロップダウンメニューから「粒子の名前を変更」を選択します。円の直径を増減するには、マークされた円の左側に表示される矢印のアイコンをドラッグします。核の中心面をマークするには、右のアイコンをクリックしてください。原形質膜のマーカーを使用する場合、大きな球体は、細胞の大部分をカバーすること描くことができます。 </li><li>時間や平面に進むには、「フレーム」と「Z」を選択してください下部のツールバーにあるオプション。次の時点に行くの後、それに応じて核をマーク円の位置やサイズを調整します。追跡された細胞が分裂するまで、これを繰り返します。 </li><li>細胞分裂があると、娘核をマークし、「リネージュビューア」に切り替えます。これは、上部のツールバーの「Windows」アイコンをクリックして選択することができます。同時に3つのすべての核マークは、トップツールバーの「リネージュ」オプションに移動し、「准親」を選択します。 </li><li>細胞追跡が終了すると、トラッキングのために細胞分裂の残りマーキングチャネルに切り替えます。チャンネルを切り替えるには、ツールバーの左下隅にファイル名をクリックしてください。核のために上記のように細胞分裂の残り（または任意の他の構造体）を追跡することができます。 </li><li> 「リネージュ」 - - 「編集」および編集される系統番号をクリックして閉じた後、ソフトウェアに戻ったとき、それは「2Dビューア」に行くことが必要です。 </LI&gt; </ol> 6. PIVlabと皮質アクトミオシンフローの分析注：PIVlabがより自由に利用可能なソフトウェアです。http://pivlab.blogspot.de/。それはPIVlab_GUIを入力して、MATLABコマンドライン環境内から呼び出すことができます。 PIVlabで作業する場合、それは別のフォルダに画像シリーズを保存することをお勧めします。 <ol><li> 「ファイルメニュー」から新しいセッションを開始します。 「ロードイメージ」ボタンをクリックして画像ファイルをロードします。 </li><li>シーケンシングスタイル1-2、2-3、選択...と希望する画像のシーケンスが含まれているディレクトリに移動します。画像を選択し、「追加」ボタンおよびインポートをクリックしてください。 </li><li> 「解析の設定」に移動し、「除外（ROI、マスク）」を選択します。また、押して &quot;Ctrlキー+ E」。画像/秒（胚外すなわち、面積）の不要部分を不活性化するために、「現在のフレームのマスク（複数可）を描画」ボタンを使用します。 </li><li> 「PIVの設定」を選択し、FR「分析設定」メニューをオム。また、押して &quot;Ctrlキー+ S」。希望PIVアルゴリズムとして「FFTウィンドウ変形」を選択してください。 注：高速フーリエ変換（FFT）が、計算コストを削減するだけで、信号がよく、ノイズの上、研究粒子の変位を分析半分パス領域を（6.5を参照）を超えていない場合であることをお勧めします。 </li><li> 16のステップと32ピクセルの尋問面積：32パス2のステップと64ピクセルの尋問エリア：1を渡します。その後の画像間の強度の相互相関のために尋問の面積である3つのパスに次の値を入力してください。ドロップダウンメニューウィンドウの変形から「線形」を選択します。サブピクセル変位推定のためのガウス2 * 3点法を選択してください。 </li><li>選択して「分析！ &quot; Analysisメニューから、ボタンを使用して分析を開始するには、「すべてのフレームを分析します」。 </li><li>後処理のために &quot;&quot;ベクトルの検証」を選択;ポスト処理」メニューおよび7に標準偏差（STDEV）フィルタ閾値を設定し、すべてのフレームに適用されます。 </li><li> 「プロット」メニューから「データを変更/パラメータを導出」を選択します。ドロップダウンメニューから「ベクトル[PX /フレーム]」を選択します。ベクトルとハイパスフィルタの滑らかさを調整し、すべてのフレームに適用されます。 </li><li> 、すべてのフレームの平均ベクトルを計算する1に「使用済みフレーム」に設定するには、次の終了をし、「平均ベクトルを計算する」ボタンをクリックします。 </li></ol>

<ol>
	<li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 100 (1), 64-119 (1983).</li><li>Kimmel, C. B., Warga, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+cell+lineages+originate+in+the+gastrula+of+the+zebrafish.">Tissue-specific cell lineages originate in the gastrula of the zebrafish.</a> Science. 231 (4736), 365-368 (1986).</li><li>Nishida, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+analysis+in+ascidian+embryos+by+intracellular+injection+of+a+tracer+enzyme.+III.+Up+to+the+tissue+restricted+stage.">Cell lineage analysis in ascidian embryos by intracellular injection of a tracer enzyme. III. Up to the tissue restricted stage.</a> Dev. Biol. 121 (2), 526-541 (1987).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis.">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li><li>Fernandez, R., Das, P., Mirabet, V., Moscardi, E., Traas, J., Verdeil, J. L., Malandain, G., Godin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+plant+growth+in+4D:+robust+tissue+reconstruction+and+lineaging+at+cell+resolution.">Imaging plant growth in 4D: robust tissue reconstruction and lineaging at cell resolution.</a> Nat. Methods. 7 (7), 547-553 (2010).</li><li>Olivier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lineage+reconstruction+of+early+zebrafish+embryos+using+label-free+nonlinear+microscopy.">Cell lineage reconstruction of early zebrafish embryos using label-free nonlinear microscopy.</a> Science. 329 (5994), 967-971 (2010).</li><li>Kitajima, T. S., Ohsugi, M., Ellenberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+kinetochore+tracking+reveals+error-prone+homologous+chromosome+biorientation+in+mammalian+oocytes.">Complete kinetochore tracking reveals error-prone homologous chromosome biorientation in mammalian oocytes.</a> Cell. 146 (4), 568-581 (2011).</li><li>Schr&#246;del, T., Prevedel, R., Aumayr, K., Zimmer, M., Vaziri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+3D+imaging+of+neuronal+activity+in+Caenorhabditis+elegans+with+sculpted+light.">Brain-wide 3D imaging of neuronal activity in Caenorhabditis elegans with sculpted light.</a> Nat. Methods. 10 (10), 1013-1020 (2013).</li><li>Du, Z., Santella, A., He, F., Tiongson, M., Bao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+inference+of+systems-level+mechanistic+models+of+development+from+live-imaging-based+phenotype+analysis.">De novo inference of systems-level mechanistic models of development from live-imaging-based phenotype analysis.</a> Cell. 156 (1-2), 359-372 (2014).</li><li>Amat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast,+accurate+reconstruction+of+cell+lineages+from+large-scale+fluorescence+microscopy+data.">Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data.</a> Nat. Methods. 11 (9), 951-958 (2014).</li><li>He, B., Doubrovinski, K., Polyakov, O., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+constriction+drives+tissue-scale+hydrodynamic+flow+to+mediate+cell+elongation.">Apical constriction drives tissue-scale hydrodynamic flow to mediate cell elongation.</a> Nature. 508 (7496), 392-396 (2014).</li><li>Singh, D., Pohl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+rotational+cortical+flow,+asymmetric+midbody+positioning,+and+spindle+rotation+mediates+dorsoventral+axis+formation+in+C.+elegans.">Coupling of rotational cortical flow, asymmetric midbody positioning, and spindle rotation mediates dorsoventral axis formation in C. elegans.</a> Dev. Cell. 28 (3), 253-267 (2014).</li><li>Singh, D., Pohl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+function+for+the+midbody+remnant+in+embryonic+patterning.">A function for the midbody remnant in embryonic patterning.</a> Commun. Integr. Biol. 7, e28533 (2014).</li><li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD.">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J. Struct. Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li><li>Henriksson, J., Hench, J., Tong, Y. G., Johansson, A., Johansson, D., B&#252;rglin, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endrov:+an+integrated+platform+for+image+analysis.">Endrov: an integrated platform for image analysis.</a> Nat. Methods. 10 (6), 454-456 (2013).</li><li>Thielicke, W., Stamhuis, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIVlab+-+Towards+User-friendly,+Affordable+and+Accurate+Digital+Particle+Image+Velocimetry+in+MATLAB.">PIVlab - Towards User-friendly, Affordable and Accurate Digital Particle Image Velocimetry in MATLAB.</a> Journal of Open Research Software. 2 (1), e30 (2014).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+imaging+of+Caenorhabditis+elegans+using+nanoparticle-mediated+immobilization.">Long-term imaging of Caenorhabditis elegans using nanoparticle-mediated immobilization.</a> PLoS One. 8 (1), e53419 (2013).</li><li>Dickinson, D. J., Ward, J. D., Reiner, D. J., Goldstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+Cas9-triggered+homologous+recombination.">Engineering the Caenorhabditis elegans genome using Cas9-triggered homologous recombination.</a> Nat. Methods. 10 (10), 1028-1034 (2013).</li><li>Schonegg, S., Constantinescu, A. T., Hoege, C., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Rho+GTPase-activating+proteins+RGA-3+and+RGA-4+are+required+to+set+the+initial+size+of+PAR+domains+in+Caenorhabditis+elegans+one-cell+embryos.">The Rho GTPase-activating proteins RGA-3 and RGA-4 are required to set the initial size of PAR domains in Caenorhabditis elegans one-cell embryos.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (38), 14976-14981 (2007).</li><li>Schmutz, C., Stevens, J., Spang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+the+novel+RhoGAP+proteins+RGA-3+and+RGA-4+in+the+germ+line+and+in+the+early+embryo+of+C.+elegans.">Functions of the novel RhoGAP proteins RGA-3 and RGA-4 in the germ line and in the early embryo of C. elegans.</a> Development. 134 (19), 3495-3505 (2007).</li><li>Naganathan, S. R., F&#252;rthauer, S., Nishikawa, M., J&#252;licher, F., Grill, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+torque+generation+by+the+actomyosin+cell+cortex+drives+left-right+symmetry+breaking.">Active torque generation by the actomyosin cell cortex drives left-right symmetry breaking.</a> Elife. 3, e04165 (2014).</li><li>Kaletta, T., Schnabel, H., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binary+specification+of+the+embryonic+lineage+in+Caenorhabditis+elegans.">Binary specification of the embryonic lineage in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 390 (6657), 294-298 (1997).</li><li>Schnabel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+cell+sorting+in+the+C.+elegans+embryo+defines+a+new+mechanism+for+pattern+formation.">Global cell sorting in the C. elegans embryo defines a new mechanism for pattern formation.</a> Dev. Biol. 294 (2), 418-431 (2006).</li><li>Murray, J. I., Bao, Z., Boyle, T. J., Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lineaging+of+fluorescently-labeled+Caenorhabditis+elegans+embryos+with+StarryNite+and+AceTree.">The lineaging of fluorescently-labeled Caenorhabditis elegans embryos with StarryNite and AceTree.</a> Nat. Protoc. 1 (3), 1468-1476 (2006).</li><li>Giurumescu, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos.">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139 (22), 4271-4279 (2012).</li><li>Dejima, K., Kang, S., Mitani, S., Cosman, P. C., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syndecan+defines+precise+spindle+orientation+by+modulating+Wnt+signaling+in+C.+elegans.">Syndecan defines precise spindle orientation by modulating Wnt signaling in C. elegans.</a> Development. 141 (22), 4354-4365 (2014).</li><li>Schnabel, R., Hutter, H., Moerman, D., Schnabel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessing+normal+embryogenesis+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+4D+microscope:+variability+of+development+and+regional+specification.">Assessing normal embryogenesis in Caenorhabditis elegans using a 4D microscope: variability of development and regional specification.</a> Dev Biol. 184 (2), 234-265 (1997).</li></ol>

Research in the lab of CP is funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (EXC 115; FOR 1756) and the LOEWE Research Cluster Ubiquitin Networks. CP is further supported by the European Union Framework Program 7 (Marie Curie Actions Project 326632).

開発中のオブジェクトの追跡を介して、特定の核の追跡では、Cの中央のパターン形成機構を解明することが可能でした胚1,23,24 エレガンス 。より高いスループットにこの戦略を展開するには、追加のパターニングルールを明らかにし、パターニング規則に新たに 10を推定する方法の方法を提案する最近ことが可能でした。多くの変異体は、しかし、正確なパターニング欠陥はまだ不明です。ここで説明する方法は、それらの解明に尽力することができるツールです。重要なのは、それはあるが、他の多くのモデルシステムは、Cのような不変の開発に従わないことを近年明らかになってきましたエレガンス 、オブジェクト追跡及び定量的追跡データの分析は、発生メカニズムおよび疾患の機序を特定するための重要なツールです。 ここに示す方法は、それがすぎるかになるような状況では特によく適していますそれぞれ、市販のソフトウェアツールを実装するために、より複雑な、および/または自己生成ソフトウェアソリューション、またはあまりにもコスト高を実現するために挑戦。重要なのは、ここで説明するツールは、彼らが記録されている機器で独立して任意のデータをロードし、分析する研究者を可能にします。独自の画像取得ソフトウェアを使用している場合また、ImageJが独自フォーマットでデータをロードし、標準形式（JPEG、TIFF）で保存することができますバイオ形式のプラグインを提供します。 タイムラプス顕微鏡検査に依存しているすべてのプロトコルにおける重要なステップは、適切な条件を選択するために顕微鏡画像において十分なコントラストを得るために、そして、同時に、検体への放射線被曝を低減することです。これは、頻繁に使用される顕微鏡の種類に依存し、それは一般に、回転ディスクまたは単一平面照明顕微鏡などの高速スキャン技術を使用することをお勧めします。具体的には、皮質ダイナミクスのPIV、ポイントスキャンの古いバージョンのための顕微鏡は、有効な分析を実行するのに十分な解像度とスピードで皮質の信号をキャプチャ可能にするには遅すぎるかもしれません。したがって、常に慎重に放射線被ばくを評価し、試験片の生存能力をテストすることが重要です。ここで説明するプロトコルは、胚をマウントするmicobeadsを使用していますがまた、それだけで準備にもう少し時間がかかりますが、安価で、同じように再現性のあるいくつかの経験を持つアガロースパッドを使用することも可能です。しかし、それは任意の麻痺剤の使用を回避するため、アガロースパッド及びナノビーズの組み合わせは、例えば、レバミゾール、成虫の長期の固定化のための優れた方法であることが指摘されるべきです。 それは完全に自動化されたデータ分析を実行しないので、ここで説明したツールは、その限界があることが指摘されるべきです。しかし、細胞分裂の残骸のような構造のために、それは多くの場合だけだ分子マーカーを同定するために挑戦されています信頼性の追跡のために重要である。この構造は、TAINS。主要な今後の課題は、したがって、機械学習、我々はここで議論し、使いやすいとオープンアクセスソフトウェアの適応性の検出/セグメント化アルゴリズムなどの機能を含むことにあります。これらの機能のいくつかは、より長い時間間隔で繰り返し追跡を扱うことができ、特定のソフトウェアでは、他のソフトウェアモジュールで見つけることができ、またはそれはするように設計されているトラッキングデータの大きな集合（例えば、StarryNite / AceTree 25またはNucleitracker4D 26を 、比較することができますヒストン融合タンパク質またはスピンドル27を使用して、トラックの核、またはシミBioCell 28）。これらのツールは、核以外の構造の追跡を目的としたとき、実装が複雑になることがあります。大量の画像データを分析する際に追跡する必要がある特定の構造にもかかわらず、これらのプログラムは、一般的に非常に便利です。重要なことは、上記のソフトウェアMODUL間の互換性がありますエス。 他のモデル系（例えば、胚、哺乳類培養細胞を、飛ぶ）で作業する場合、ここで紹介する方法はまた、上記のようにオルソロガス構造を追跡するのに適しています。さらに重要なことは、独立等調査中のモデルシステム、異なる細胞内構造、 例えば、中心体、核小体、微粒子、小胞の容易のみ取得パラメータは、対象トラックの完全な捕捉を確実にするために調整する必要があり、追跡することができます。

蛍光タンパク質、ゲノム工学、光学顕微鏡、およびコンピュータ・ソフト及びハードウェアの着実な改善と、それは前例のない、時空間分解能で多くのモデル生物の開発を記録することが可能になりました。これは、研究者は、以前に対処することができなかった質問をするか、見落とさ側面を探索するために知られている発達過程を再検討することができます。この進歩は、徹底した測定と統計解析によって定量的モデルに定性的な、非公式のモデルを変換することを目的と量的発生生物学の分野を巻き起こしました。 追跡細胞と細胞内構造は、胚発生、神経系の活性、または細胞分裂1-12の定量的モデルを導出することを可能にしました。 Cの初期の開発中に細胞分裂の残党を追跡することによりエレガンス胚 、我々は、彼らがステレオに従っていることを明らかに最近できましたパスを入力し、構成する重要な偏光は13,14因子 。 ここでは、プロトコルは、非専門家のためのアクセス可能な定量的な発生生物学のアプローチを行うことが提示されています。焦点は、標準的な共焦点顕微鏡およびコンピュータへのアクセスを持つ任意のラボで実施可能である3つのストレートフォワード、自由に利用できるツールです。これらは、3Dセル形状を生成するためのプロトコル、細胞分裂の残りを追跡するためのプロトコル、および定量皮質アクトミオシンのダイナミクスを説明するためのプロトコルを含みます。線虫C.エレガンスは、典型的なケースとして使用されている、しかし、ここで説明する方法とツールがなど他の生物学的モデルでの質問、 例えば、培養細胞、組織外植片、オルガノイドまたはスフェロイド、他の胚、各種のに適しています一般的に、ここに示した分析のいくつかはまた、人気のあるオープンソースのツールはImageJ（http://imagej.nih.gov/ij/docs/indexを行うことができます。HTML;またはフィジー、別の定量分析のための多くのプラグインが利用可能なImageJの、http://fiji.sc/Fiji）のバージョンを「電池が含まれます」。しかし、ここで説明するプログラムは、特定の問題に取り組むために設計されています。 まず、IMOD、画像処理、モデリング、ディスプレイスイートは、電子又は光学顕微鏡15からの連続切片の3次元再構成のために使用することができます。 IMODはまた、任意の方向から3Dデータを表示するためのツールが含まれています。第二に、Endrov、ImageJのプラグイン互換性16と 、ネットワークまたは拡張プラグインアーキテクチャに基づいて（とりわけ）トラックの画像解析、データ処理、および注釈を実行するように設計されたJavaプログラム。これは、140以上の画像処理操作とモデルと生データを別々に表示されている拡張可能なユーザー・インターフェースが含まれています。そのソースコードはhttps://github.com/mahogny/Endrovで見つけることができます。第三に、PIVlab、Mユーザは、定量的および定性的粒子の流れ場17を分析することを可能にするデジタル粒子画像流速用ATLABツール。このプログラムの使用は、画像処理ツールボックス（http://mathworks.com）が含まれ、MATLABのライセンスが必要です。 PIVlabを定量的に流れを記述するために設計されたプログラムです。これは、画像対またはシリーズ内の速度分布、大きさ、渦度、発散、または剪断を算出します。このためには、画像対の画像（プロトコルセクションに「パス」と呼ばれる）の小領域は、最も可能性の高い粒子変位を導出するために相互相関します。この相互相関は、それぞれ、直接相互相関または高速フーリエ変換（FFT）を使用して空間または周波数領域で分析することができ、相関行列が得られます。 ここで使用される機器は、ニポー（ &#39;回転&#39;）ディスク、EMCCD、488および561 nmの標準固を備えた倒立顕微鏡でありますステートレーザ、および油性または水浸対物レンズアポクロマート20X空気または40倍または60倍プラン/。しかし、他の撮像モダリティでタイムラプス撮影を行うことも可能であり、 例えば、ポイント- 、ライン-またはデコンボリューションまたは構造と組み合わせたシート走査レーザベース顕微鏡、多光子顕微鏡法、ならびにエピ蛍光顕微鏡照明。ニポーディスクシステムを使用する利点は、ストリーミング・モード（連続移動及びz次元でのオブジェクトのスキャン）が利用可能である場合は特に、非常に高速な画像取得です。また、解像度を向上させるために、EMCCDの前に1.5倍拡大エクステンダーを使用することができます。

<table><tbody><tr><td>Stereo microscope</td><td>Motic/VWR</td><td>OT4005S</td><td>Stereo microscope for dissection and mounting</td></tr><tr><td>Polybead Polystyrene Microspheres,&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>18329</td><td>Embryo mounting</td></tr><tr><td>20 &amp;micro;m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polybead Polystyrene Microspheres,&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>876</td><td>Adult animal mounting</td></tr><tr><td>0.1 &amp;micro;m</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>VWR</td><td>631-0902</td><td>Adult animal mounting</td></tr><tr><td>Cover glass 18x18 mm</td><td>VWR</td><td>631-1331</td><td>Embryo/adult mounting</td></tr><tr><td>Cover glass 24x60 mm</td><td>VWR</td><td>631-1339</td><td>Embryo mounting</td></tr><tr><td>Scalpel</td><td>VWR</td><td>233-5455</td><td>Embryo dissection</td></tr><tr><td>Silicone tubing</td><td>VWR</td><td>228-1501</td><td>Tubing for mouth pipette</td></tr><tr><td>30 mm PTFE membrane filter</td><td>NeoLab</td><td>Jul-01</td><td>Filter for mouth pipette</td></tr><tr><td>Capillary tubes</td><td>VWR</td><td>621-0003</td><td>Pipette tip for mouth pipette</td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Roth</td><td>E746.1</td><td>Embryo/adult mounting</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Roth</td><td>5210.5</td><td>Adult animal mounting</td></tr><tr><td>Potassium-di-hydrogenphosphate</td><td>Roth</td><td>P018.2</td><td>M9 buffer</td></tr><tr><td>Di-sodium- hydrogenphosphate</td><td>Roth</td><td>P030.2</td><td>M9 buffer</td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Roth</td><td>3957.1</td><td>M9 buffer</td></tr><tr><td>VisiScope Spinning Disc Confocal System</td><td>Visitron Systems</td><td>n/a</td><td>Confocal microscopy</td></tr></tbody></table>

tracking and quantifying developmental processes in c. elegans using open-source tools

定量的に発生過程を捉えることは、変異体の表現型を識別し、記述するためのメカニズムのモデルと鍵を導出することが重要です。ここではプロトコルは、胚および成体Cを調製するために提示されていますエレガンス短期および長期タイムラプス顕微鏡検査のために動物や発達過程の追跡と定量化のための方法。提示された方法は、すべてのCに基づいています線虫遺伝学センターから入手でき、簡単に独立して使用する顕微鏡システムのいずれかの実験室で実現することができるオープンソースソフトウェアの株エレガンス 。モデリングソフトウェアIMOD、汎用の画像解析プログラムEndrovを使用して蛍光標識された細胞内構造の手動追跡、及びPIVlab（時間分解デジタル粒子画像流速を使用して、皮質収縮フローの分析を用いて、3Dセル形状モデルの再構築MATLAB用ツール）が示されています。しかし、これらの方法はまた、Tを展開する方法を説明されていますO定量的に、細胞追跡と系譜トレース 、 例えば 、小胞の流れの追跡を異なるモデルの他の発生プロセスをキャプチャします。

プロトコール2、3、および4を使用して、野生型における生殖腺の、タイムラプスイメージングC.エレガンス大人が実行される（株OD58（UNC-119（ED3）III; ltIs38 [PAA1;パイ-1 :: GFP :: PH（PLC1delta1）+ UNC-119（+）]）、生殖細胞系のプロモーターからの膜マーカーを発現します）。生殖腺の順番に着目し、生殖細胞の3Dモデルは、顕微鏡データ（ 図2）から生成されます。 //www.wormatlasを：このモデルは、細胞の通過は、近位アームに先端を形成しながら、細胞の大きさの変化を分析することができ、また、HTTPを参照してください（花軸に花軸の組織や個々のセルのコンタクトの大きさを明らかにしています。 ORG /ふたなり/胚芽％20line / Germframeset.html）。 次に、プロトコル1,3、および5 は 、Cの長期タイムラプス顕微鏡検査を実行するために使用されitIs37 [パイ-1P :: mCherryを:: H2B ::パイ-1 3&#39;UTR + UNC-119（+）]; stIs10226（UNC-119（ED3）III株RW10226のクロスでエレガンス胚（株CHP52 [彼の-72プロモーターHIS-24 :: mCherryを翻訳融合させ-858の3 &#39;UTR + UNC-119（+）]）とひずみLP162（Nmyの-2（CP13 [Nmyの-2 :: GFP +のLoxP]）Iを）。この株では、GFPはCRISPR / Cas9技術19を介してフレームに統合されたゲノム改変された非筋肉ミオシンII軌跡を通して（mCherryをヒストン融合タンパク質を介して）核および細胞分裂の残党（両方に従うことが可能です）二色タイムラプス顕微鏡（ 図3を使用した場合 、同時に、左パネル）。 Endrovで両構造のlineagingによって得られたモデルは、細胞分裂レムナント継承13,14の前に説明したステレオタイプのパターンを示しています。また、lineagingデータ、各細胞と細胞分裂レムナント（ 図3、右パネル）および細胞分裂レムナント持続時間の間、トラックからだけでなく、細胞との相関（Nmyの-2 GFP -signalに基づきます）分割タイミングが（得られます&lt;ABA系統のみ）のために示した強い&gt;図4、。加えて、原形質膜のマーカーを使用する場合、それは細胞分裂残留内在化の時点を観察することも可能です。 最後に、高時間分解能皮質非筋肉ミオシンII（Nmyの-2 GFP）の（zスタックを記録する間に5 ​​秒間隔）でプロトコール1、3、6、短期タイムラプス顕微鏡を用いて行われます。ここでの焦点は、野生型胚のRho GTPアーゼ活性化タンパク質のRGA-3 20,21のためのRNAi枯渇の間にこのフローを比較することにより、皮質の偏光の流れのダイナミクスの違いにあります。 RGA-3のRNAi胚内の流れは、この軸に直交する一方で、最近の観測22と同様に、野生型の胚に流れることは、主に胚の長軸（ 図5、左パネル）に沿っています。これは、連続した時間点をオーバーレイまたはPIV analysから容易に明らかです（ 図5、下のパネル）です。 皮質流れ粒子はデータの正確な解釈を明確に解決することができるように、これらの違いを観察するためには、サンプリング間隔を選択することが重要です。短い時間間隔（≤5秒）は、大きな変位や不足しているベクトルを避けることをお勧めします。質問ウィンドウは、分析される粒子（顆粒皮質）のサイズを収容するのに十分な大きさであるべきです。隣接質問ウィンドウ間の重なりは、ベクトル空間を減らすことができ、したがって、格子内のベクトルの数を増加させます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53469/53469fig1.jpg" /> 図1口のピペットを組み立て左 ：フィルタで口のピペットを組み立てるために必要なパーツ。右：組み立てピペット<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53469/53469fig1large.jpg" target="_blank">ください</a>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53469/53469fig2.jpg" /> 生殖腺のターン領域の図2. 3Dモデル左上：タイムラプス顕微鏡データから単一時点の3D投影。トップミドル、右：顕微鏡データの3Dモデル。ボトム：細胞花軸の連絡先の詳細は、 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53469/53469fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53469/53469fig3.jpg" /> 核と細胞分裂の残党の図3.追跡左 ：タイムラプス顕微鏡データから3次元の投影。ミドル：両方の核（着色球）および細胞分裂の残骸（灰色の球を）追跡から得られたモデルのスナップショット。右：スナップショット細胞分裂の残留追跡から。残党のパスも示されている。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53469/53469fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53469/53469fig4.jpg" /> 代表胚からABA亜。系譜図4.細胞と細胞分裂レムナント系統が示されています。細胞分裂は四角でマークされています。各目盛りは1分に相当します。細胞分裂の残党がレムナントが生成される間の分裂から生じ娘にちなんで命名された。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53469/53469fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53469/53469fig5.jpg" /><br。PIVトップと皮質収縮の流れ /&gt; 図5.分析：3D投影静止画PIVlabとベクトル場を計算するために使用される時間ウィンドウの開始（最初の行）と終了（2行目）を描くタイムラプス顕微鏡から。パネルの第3行は、時間窓の全ての時点のオーバーレイを示しています。下：。PIVlabしたベクトルフィールド<a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53469/53469fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="ムービー1" src="/files/ftp_upload/53469/53469movie1.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53469/movie_3dmod_annotated.mp4">ビデオ1</a> -生殖腺のターン領域の2. 3Dモデルを図に関連する動画はセグメントに細胞を使用したプレーンのスタック全体をスクロールすることから始まります。スタックのその後の3D最大投影<html> 3Dのsegementationモデルが（セグメント化された生殖腺の穂軸とし、なし）は、x軸とy軸の周りを回転することにより、続いて示されています。 <img alt="ムービー2" src="/files/ftp_upload/53469/53469movie2.jpg" /> <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53469/Max_projection_Endrov_data_annotated_for_movie.mp4">ビデオ2</a> -核と細胞分裂の残党の3追跡左図に関連：タイムラプス顕微鏡データから3D投影を。ミドル：両方の核（着色球）および細胞分裂の残骸（灰色の球を）追跡から得られたモデル。右：細胞分裂の残党とその軌跡。 =10μmのスケールバー。 <img alt="ムービー3" src="/files/ftp_upload/53469/53469movie3.jpg" />_for_movie_with_PIV_data.mp4 &quot;&gt;ビデオ3 - PIVと皮質収縮の流れ5.分析図に関連PIVlabスケールバーとベクトル場を計算するために使用される代表的な野生型およびRGA-3のRNAi胚の3D最大投影タイムラプス録画を。 =10μmです。

Watch this Scientific Journal Video about Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools at JoVE.com

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

の発達過程を追跡し、定量化<em&gt; C。エレガンス</em&gt;オープンソースのツールを使用しました

Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

tracking-quantifying-developmental-processes-c-elegans-using-open

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

8.8K ビュー.  Goethe University. Here it is shown how to track and quantify developmental processes in C. elegans. The methods presented are based on open-source tools that can be easily implemented. It is demonstrated how to reconstruct 3D cell-shape models, how to manually track subcellular structures, and how to analyze cortical contractile flow.

ビデオ: Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

のオンデマンド定量分析のためのマイクロ流体ベースの走電性<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt; &#39;ロコモーション

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

生物工学

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the surface of an agar plate. For the study of the genetic, biochemical, and neuronal basis of behavior, C. elegans is an ideal organism because it is genetically tractable, amenable to microscopy, and shows a number of complex behaviors, including taxis, learning, and social interaction1,2. Behavioral analysis based on tracking the movements of worms as they crawl on agar plates have been particularly useful in the study of sensory behavior3, locomotion4, and general mutational phenotyping5. Our system works by moving the camera and illumination system as the worms crawls on a stationary agar plate, which ensures no mechanical stimulus is transmitted to the worm. Our tracking system is easy to use and includes a semi-automatic calibration feature. A challenge of all video tracking systems is that it generates an enormous amount of data that is intrinsically high dimensional. Our image processing and data analysis programs deal with this challenge by reducing the worms shape into a set of independent components, which comprehensively reconstruct the worms behavior as a function of only 3-4 dimensions6,7. As an example of the process we show that the worm enters and exits its reversal state in a phase specific manner.

C. elegans Tracking and Behavioral Measurement

We have developed a video-rate tracking microscope system that can record and quantify C. elegans behavior at high resolution and high speeds. We have also developed computational methods to reduce the dimensionality of the worm images to a fundamental set of measurements that completely describe the shape of the worm.

C. elegansの追跡と行動計測

We have developed instrumentation, image processing, and data analysis techniques to quantify the locomotory behavior of C. elegans as it crawls on the ...

神経科学

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous system can be observed, with single cell resolution, in vivo. Here, we present an integrated protocol for the examination of neurodevelopment in C. elegans embryos. Our protocol combines imaging, lineaging and neuroanatomical tracing of single cells in developing embryos. We achieve long-term, four-dimensional (4D) imaging of living C. elegans&#160;embryos with nearly isotropic spatial resolution through the use of Dual-view Inverted Selective Plane Illumination Microscopy (diSPIM). Nuclei and neuronal structures in the nematode embryos are imaged and isotropically fused to yield images with resolution of ~330 nm in all three dimensions. These minute-by-minute high-resolution 4D data sets are then analyzed to correlate definitive cell-lineage identities with gene expression and morphological dynamics at single-cell and subcellular levels of detail. Our protocol is structured to enable modular implementation of each of the described steps and enhance studies on embryogenesis, gene expression, or neurodevelopment.

Here, we present a combinatorial approach using high-resolution microscopy, computational tools, and single-cell labeling in living C. elegans embryos to understand single cell dynamics during neurodevelopment.

等方性光シート顕微鏡と自動細胞系譜分析による、細胞内分解能を Caenorhabditis elegans 胚発生

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

発生生物学

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

ミトコンドリア病の ケノハブディティス・エレガンス モデルにおける動物活動量の定量化に関する実験法の比較分析

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

行動学

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One challenge is that embryogenesis dynamically unfolds over a period of about 13 h; this half day-long timescale has constrained the scope of experiments by limiting the number of embryos that can be imaged. Here, we describe a semi-high-throughput protocol that allows for the simultaneous 3D time-lapse imaging of development in 80&#8211;100 embryos at moderate time resolution, from up to 14 different conditions, in a single overnight run. The protocol is straightforward and can be implemented by any laboratory with access to a microscope with point visiting capacity. The utility of this protocol is demonstrated by using it to image two custom-built strains expressing fluorescent markers optimized to visualize key aspects of germ-layer specification and morphogenesis. To analyze the data, a custom program that crops individual embryos out of a broader field of view in all channels, z-steps, and timepoints and saves the sequences for each embryo into a separate tiff stack was built. The program, which includes a user-friendly graphical user interface (GUI), streamlines data processing by isolating, pre-processing, and uniformly orienting individual embryos in preparation for visualization or automated analysis. Also supplied is an ImageJ macro that compiles individual embryo data into a multi-panel file that displays maximum intensity fluorescence projection and brightfield images for each embryo at each time point. The protocols and tools described herein were validated by using them to characterize embryonic development following knock-down of 40 previously described developmental genes; this analysis visualized previously annotated developmental phenotypes and revealed new ones. In summary, this work details a semi-high-throughput imaging method coupled with a cropping program and ImageJ visualization tool that, when combined with strains expressing informative fluorescent markers, greatly accelerates experiments to analyze embryonic development.

A Semi-high-throughput Imaging Method and Data Visualization Toolkit to Analyze C. elegans Embryonic Development

This work describes a semi-high-throughput protocol that allows simultaneous 3D time-lapse imaging of embryogenesis in 80&#8211;100 C. elegans embryos in a single overnight run. Additionally, image processing and visualization tools are included to streamline data analysis. The combination of these methods with custom reporter strains enables detailed monitoring of embryogenesis.

C.エレガンス胚発生を解析するセミハイスループットイメージング法とデータ可視化ツールキット

C. elegans is the premier system for the systematic analysis of cell fate specification and morphogenetic events during embryonic development. One ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

の長期カルシウムイメージングのためのアガロースマイクロチャンバー<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

イメージング C.エレガンス</em落射蛍光顕微鏡とオープンソースソフトウェアを使用して>胚

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

生物学

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has proven to be an invaluable model organism in helping to tackle this challenge, from inspiring technological approaches,&#160;building the human brain connectome, to actually shedding light on the specific molecular drivers of basic functional patterns. The bulk of the behavioral studies in C. elegans have been performed on solid substrates. In liquid, animals exhibit behavioral patterns that include movement at a range of speeds in 3D, as well as partial body movements, such as a posterior curl without anterior shape change, which introduce new challenges for quantitation. The steps of a simple procedure, and use of a software that enables high-resolution analysis of C. elegans swim behavior, are presented here. The software, named CeleST, uses a specialized computer program that tracks multiple animals simultaneously and provides novel measures of C. elegans locomotion in liquid (swimming). The measures are mostly grounded in animal posture and based on mathematics used in computer vision and pattern recognition, without computational requirements for threshold cut-offs. The software tool can be used to both assess overall swimming prowess in hundreds of animals from combined small batch trials and to reveal novel phenotypes even in well-characterized genetic mutants. The preparation of specimens for analysis with CeleST is simple and low-tech, enabling wide adaptation by the scientific community. Use of the computational approach described here should therefore contribute to the greater understanding of behavior and behavioral circuits in the C. elegans model.

Automated Analysis of C. elegans Swim Behavior Using CeleST Software

An efficient and simple methodology for computer-based analysis of nematode swimming behavior in liquid is described. The method requires little to no investment for C. elegans laboratories. The hardware used is standard, and the computer software for the behavioral analysis (CeleST) is an open source one.

の自動解析<em&gt; C。エレガンス</emセレストソフトウェアを使用&gt;スイム挙動

Dissecting the neuronal and neuromuscular circuits that regulate behavior remains a major challenge in biology. The nematode Caenorhabditis elegans has ...

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the health and fitness of the animals under study, one typically relies on motility readouts, such as the measurement of the number of body bends or the speed of movement. These measurements usually involve manual counting, making it challenging to obtain good statistical significance, as time and labor constraints often limit the number of animals in each experiment to 25 or less. Since high statistical power is necessary to obtain reproducible results and limit false positive and negative results when weak phenotypic effects are investigated, efforts have recently been made to develop automated protocols focused on increasing the sensitivity of motility detection and multi-parametric behavioral profiling. In order to extend the limit of detection to the level needed to capture the small phenotypic changes that are often crucial in genetic studies and drug discovery, we describe here a technological development that enables the study of up to 5,000 individual animals simultaneously, increasing the statistical power of the measurements by about 1,000-fold compared to manual assays and about 100-fold compared to other available automated methods.

Automated Behavioral Analysis of Large C. elegans Populations Using a Wide Field-of-view Tracking Platform

We describe protocols for using the wide field-of-view nematode tracking platform (WF-NTP), which enables high-throughput phenotypic characterization of large populations of Caenorhabditis elegans. These protocols can be used to characterize subtle behavioral changes in mutant strains or in response to pharmacological treatment in a highly scalable fashion.

自動行動分析の大規模なc. の elegans集団による視野が広い追跡プラットフォーム

Caenorhabditis elegans is a well-established animal model in biomedical research, widely employed in functional genomics and ageing studies. To assess the ...

免疫・感染学

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

基本的な<em&gt;線虫Caenorhabditis elegans</em&gt;方法：同期との観測

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

の発達過程を追跡し、定量化

要約

さらに動画を探す

この動画の章

のオンデマンド定量分析のためのマイクロ流体ベースの走電性

C. elegansの追跡と行動計測

等方性光シート顕微鏡と自動細胞系譜分析による、細胞内分解能を Caenorhabditis elegans 胚発生

ミトコンドリア病のケノハブディティス・エレガンスモデルにおける動物活動量の定量化に関する実験法の比較分析

C.エレガンス胚発生を解析するセミハイスループットイメージング法とデータ可視化ツールキット

の長期カルシウムイメージングのためのアガロースマイクロチャンバー

イメージング C.エレガンス胚

の自動解析

自動行動分析の大規模なc. の elegans集団による視野が広い追跡プラットフォーム

基本的な

の発達過程を追跡し、定量化

要約

さらに動画を探す

この動画の章

のオンデマンド定量分析のためのマイクロ流体ベースの走電性

C. elegansの追跡と行動計測

等方性光シート顕微鏡と自動細胞系譜分析による、細胞内分解能を Caenorhabditis elegans 胚発生

ミトコンドリア病の ケノハブディティス・エレガンス モデルにおける動物活動量の定量化に関する実験法の比較分析

C.エレガンス胚発生を解析するセミハイスループットイメージング法とデータ可視化ツールキット

の長期カルシウムイメージングのためのアガロースマイクロチャンバー

イメージング C.エレガンス胚

の自動解析

自動行動分析の大規模なc. の elegans集団による視野が広い追跡プラットフォーム

基本的な

ミトコンドリア病のケノハブディティス・エレガンスモデルにおける動物活動量の定量化に関する実験法の比較分析