Roche's Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.

tdTomatoタグ付き野生型とモータレスKIF5Bタンパク質の1クローニング<ol><li> 表1のプライマーを用いてヒト野生型とモータレスKIF5Bタンパク質のためのcDNAを増幅し、Taq DNAポリメラーゼ（100μlの5単位）、dNTPミックス（各デオキシヌクレオチド2ミリモル）および30サイクルの10×緩衝液。各サイクルは、変性工程（30秒間、95℃）、アニーリングステップ（30秒45°C）と伸長工程（3分間72°C）からなります。 </li><li>等量のフェノール/クロロホルムを用いて増幅されたDNA産物を抽出し（1：1）。 注：フェノールは可燃性で火傷を引き起こす可能性があります。クロロホルムは危険です。彼らとの直接接触を避け、化学ヒュームフードの下でそれらを使用しています。あるいは、PCR産物は、種々のキットによって精製することができます。 <ol><li> 1分間室温で微量で18,000×gでスピン。新しいチューブに水溶液に移し、等量のクロロホルムで抽出します。 </li><li>スピン0.5分間、室温で微量で18,000×gで。新しいチューブに水溶液を移します。 </li><li> 3 M酢酸Na、無水エタノールの2容積の10分の1の体積の水溶液を混ぜます。 </li><li>室温で5分間微量で18,000×gでスピン。水溶液を捨てます。 </li><li> 75％エタノールの2つのボリュームでDNAペレットを洗浄します。 5分間室温でDNAペレットを乾燥させた水溶液と空気を捨てます。 34μlの水でDNAペレットを再懸濁します。 </li></ol></li><li>制限酵素SalIを（10単位）とBamHI（10単位）と2時間37℃でその10×緩衝液4μlの40μlの最終容量で増幅産物を消化します。臭化エチジウム（0.2μgの/ ml）を含むアガロースゲル（100 Vで1.0％）で消化された製品を解決します。 注：エチジウムブロマイドは、強力な突然変異誘発物質であり、皮膚を介して吸収することができます。したがって、W直接的または間接的な接触を避けることが重要ですi番目の臭化エチジウム。 </li><li>カラムによる精製のための正しいバンドを切り出します。 DNA断片を含むアガロースゲルを秤量します。その後、約20分間37℃で可溶化緩衝液（0.1グラム、300μL）でそれを溶解します。 </li><li> 5秒間、室温で微量の列とスピンに得られた溶液を追加します。フロースルーを捨てます。 </li><li>ステップ1.5を繰り返して、0.5ミリリットルの可溶化緩衝液でカラムを洗浄します。ステップ1.5を繰り返して、0.75ミリリットル洗浄緩衝液で再びカラムを洗浄。残りの洗浄緩衝液を取り除くために2分間の列をスピン。 </li><li>ステップ1.5を繰り返して、50μlの水を有するDNA断片を溶出します。臭化エチジウム（0.2μgの/ ml）を含むアガロースゲル（100 Vで1.0％）でDNAサイズラダーに対してそれのアリコートを実行して、DNA断片の濃度を推定します。 </li><li>以前番目で消化ptdTomato-C1ベクター17（約100 ngの）で精製品（約100 ngのを）連結E同じ制限を16時間室温でT4 DNAリガーゼ（2,000単位）および1μlの10×ライゲーション緩衝液を用いて、10μlの酵素。 注：野生型およびモータレス変異体は、それぞれ、2 963から963と584のアミノ酸が含まれています。以前は、より大きなモータレスKIF5B変異体は、その機能9を同定するために使用しました。より小さいモータレスKIF5B変異体は、その発現レベルを増加させるために、本研究に使用しました。 </li></ol> 2.免疫蛍光顕微鏡<ol><li>生細胞または、又は40X以下の倍率との間接蛍光イメージング、1mlの完全培地中に0.2〜0.3百万HeLa細胞を播種の各ウェルの[ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清（DMEM）（FBS）] 6ウェルプレート。 5％CO 2で37℃で成長します。 </li><li>空気乾燥それらの中に、短時間無水エタノールに、40倍以上の倍率との間接免疫蛍光研究のために、（1.5厚さのx 18ミリメートル18ミリメートル）カバーガラスを洗います安全キャビネット内部の6ウェルプレートのウェルは、汚染を回避します。 <ol><li> 1種0.2〜0.3百万個の細胞を6ウェルプレートの各ウェルにDMEM培地を完了mLです。 </li></ol></li><li>トランスフェクション複合体の調製<ol><li>次の日は、バイオセーフティキャビネット内、貨物候補タンパク質のための発現プラスミドの存在下または非存在下でtdTomatoタグ付き野生型またはモータレスKIF5Bのための発現プラスミドの0.6μgの（合計）希薄（pTagCFP-C-MYC 5 ）1.6ミリリットルマイクロ遠心チューブで0.1ミリリットルトランスフェクション培地と。 注：ベクトルpTagCFP-C-MYCはTagCFPタグ付きのc-MYCを発現します。 </li><li>別の1.6ミリリットルのマイクロチューブに0.1ミリリットルトランスフェクション培地にトランスフェクション試薬の1.8μlを添加します。一般的に、12個のサンプルのための十分な希釈トランスフェクション試薬のマスターミックスを調製します。 </li><li>室温で、5分間インキュベートします。 </li><li>希釈した0.1ミリリットルのDNAに希釈した0.1ミリリットルトランスフェクション試薬を追加します。ミチューブを反転させて内容をxは。微量で5秒間チューブをスピン。 </li><li>室温で、45分間インキュベートします。 </li></ol></li><li>細胞の洗浄<ol><li>トランスフェクション複合体の形成のためのインキュベーション期間中に播種した細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄します。 </li><li>各ウェル0.8ミリリットルと予め温めたトランスフェクション培地中で播種した細胞の培地を交換してください。 37℃のインキュベーターにプレートを返します。 </li></ol></li><li>細胞のトランスフェクション<ol><li> 45分のインキュベーションの後、（ステップ2.3で調製した）DNA /トランスフェクション試薬複合体0.2 mlを加え、プレートの各ウェルに滴下しました。 </li><li>彼らは、37℃のインキュベーターに戻される前に、5秒間穏やかに6ウェルプレートを揺らし。 </li><li> 6-8時間後、完全DMEM培地で培地を交換してください。 </li></ol></li><li>ライブセル蛍光イメージング18 <ol><li>インキュベーションaの追加の16時間後トン37°Cは、1μMの最終濃度になるように培地にDNA挿入染色ヘキスト33342を追加します。 注：ヘキスト33342は、細胞核を染色する細胞透過性、DNAインターカレート色素です。 </li><li> 40倍の対物レンズを用いた蛍光顕微鏡によって蛍光タンパク質の発現のためにそれらを検査する前に、37℃のインキュベーター中で10分間トランスフェクトされた細胞を培養します。 DAPI、CFP、FITCおよびCy3用のフィルターセットはそれぞれ、（Ex350 nmの/ Em460のnm）を、（Ex436 nmの/ Em480のnm）を、（Ex470 nmの/ Em525のnm）を（Ex545 nmの/ Em605のnm）です。 注：バックグラウンドが原因で完全DMEM培地の自己蛍光に高い場合、フェノールレッドを含まない培地を使用しています。 </li></ol></li></ol>間接免疫学3. <ol><li>パラホルムアルデヒド溶液の調製<ol><li>パラホルムアルデヒド粉末（100ミリリットルPBSあたり4グラム）を計量し、PBSに追加します。 注：パラホルムアルデヒドは、可燃性固体と潜在的な癌ハザルですD。それは、目、呼吸器系および皮膚を刺激します。したがって、との接触またはパラホルムアルデヒドの吸入を避けることが重要です。 </li><li>溶液（150μlの10 NのNaOH / 100ミリリットル）に水酸化ナトリウムを追加します。 </li><li>時折振とうしながら2〜3時間、37〜42℃で溶液を保管してください。 </li><li>パラホルムアルデヒド粉末を溶解させた後に溶液（約75マイクロリットル/ 100ミリリットル）に氷酢酸を加えることによって、pHを7.0に調整します。 </li></ol></li><li>ターゲットタンパク質染色<ol><li> 37℃で16時間さらにインキュベートした後、5秒間6ウェルプレートを旋回することによりPBSで一度室温でトランスフェクトされた細胞を洗浄します。 </li><li>ウェルあたり新たに調製し、4％パラホルムアルデヒド溶液1mlで細胞を固定してください。室温で30分間インキュベートします。 </li><li> 5秒間6ウェルプレートを旋回させることにより、一度PBSで細胞を洗浄。ソリューションを捨てます。 </li><li> 30分間室温にて（PBS中）0.1％トリトンX-100の1mlで細胞をインキュベートします。 DETトリトンX-100は、それらの細胞内標的への抗体のアクセスを可能にするために、細胞膜を透過しますergent。 </li><li> 5秒ずつ時間を6ウェルプレートを旋回することにより、PBSで4回細胞を洗浄。各洗浄後の溶液を捨てます。 </li><li> 4時間揺動することにより、室温でPBS溶液中で、10％FBS中で、（0.1 / mlのC-MYCのウサギ抗体またはp53マウス抗体）一次抗体の1ミリリットルで細胞をインキュベートします。 </li><li> 5秒ずつ時間を6ウェルプレートを旋回することにより、PBSで4回洗浄します。各洗浄後の溶液を捨てます。 </li><li> 2時間揺動することによって暗所で室温でPBS中10％FBS中で、蛍光色素結合二次抗体（0.5 / mlのアレクサフルオロ488結合抗ウサギまたは抗マウスIgG抗体）1mlでインキュベートします。 </li><li> 5秒ずつ時間を6ウェルプレートを旋回することにより、PBSで4回洗浄します。各洗浄後の溶液を捨てます。 </li></ol></li><li>核染色および取り付け<ol><l10分間、暗所で、室温でPBS中、（0.5 / mlのDAPI）i&gt;はDNA挿入色素4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドールを1mlで細胞をインキュベートします。何のカバーガラスが使用されていない場合3.4に進みます。 注：DAPIは細胞核を染色するDNAインターカレート色素です。 </li><li>各顕微鏡スライド上にマウント溶液10μlを適用します。顕微鏡スライド上にマウントソリューションの上に、各カバーガラスをマウントします。 </li><li>暗所で一晩中、室温でインキュベートします。 </li><li>マニキュアでカバーガラスの端をシールします。一晩マニキュア煙を除去するために、ヒュームフード内部の暗所に置きます。 </li></ol></li><li>蛍光顕微鏡19 <ol><li>翌日、40倍の対物レンズを用いた蛍光顕微鏡によって細胞を調べます。 DAPI、CFP、FITCおよびCy3用のフィルターセットはそれぞれ、（Ex350 nmの/ Em460のnm）を、（Ex436 nmの/ Em480のnm）を、（Ex470 nmの/ Em525のnm）を（Ex545 nmの/ Em605のnm）です。 </li></ol></li></ol>

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記載の方法は、微小管に沿って移動する能力を欠くモータレスKIF5B変異体の特性を利用するが、野生型KIF5Bと二量体を形成し、それによって、四量体タンパク質は、同一の積荷タンパク質と相互作用することを可能にする能力を保持します野生型KIF5Bなど。モータレスKIF5Bは、したがって、その貨物に集約しmislocalizedドミナントネガティブ変異体やフォームとして機能します。この方法は、キネシン-1貨物のc-myc（ 図1）5 を識別するために実証されています。この記事では、同一のモータレスKIF5B変異体は、キネシン-1の別の潜在的なカーゴ（ 図2）としてのp53を同定しました。これは、方法は、キネシン-1の他の貨物を識別することが可能であることを示しています。さらに、変異体の特異性は、陰性対照タンパク質のc-Fosの（ 図3）上の変異の効果の欠如によって提供されます。 このプロトコルでは、tdTomatoタグ付き野生TYPEまたはモータレスKIF5Bタンパク質は、他の蛍光タンパク質タグ付き候補貨物のタンパク質と同時発現されます。この場合、生細胞の蛍光顕微鏡および画像化が行われます。凝集体の形成は、タイムラプスイメージングにより追跡することができます。あるいは、tdTomatoタグ付きタンパク質を単独で発現され、その生理学的なレベルで、候補貨物タンパク質は特異的抗体を用いた間接免疫蛍光顕微鏡法によって可視化されます。蛍光タンパク質tdTomatoは、その明るさと光安定17のために選択されます。背景は完全DMEM培地の自己蛍光に起因する高い場合、フェノールレッドを含まない培地を使用します。 モータレスKIF5B変異体は、化学量論的に野生型KIF5Bと二量体を形成します。したがって、その機能を阻害するために、野生型対応物との二量体を形成し、凝集体を形成するモータレスKIF5B変異体の十分な量を発現することが重要です。 、exprの最適化をこの問題に対処するために、モータレス変異体のessionが不可欠です。これは、二量体化ドメインを含む小さなモータレス変異体を使用することによって達成されます。さらに、適切なトランスフェクション試薬とプロトコルの最適化も必要です。 DNA /トランスフェクション試薬でHeLa細胞のインキュベーションの持続時間は、外因性タンパク質の発現および細胞生存率を、HeLa細胞中で最適化しました。インキュベーション期間は、他の細胞株のために最適化されなければなりません。 40Xへ4X間の倍率については、何のカバーガラスは必要ありません。細胞を直接ウェルに調べることができます。したがって、この場合には、プロトコルは、安価で便利です。 40X上記倍率のために、細胞を染色した後、油浸対物レンズ下の検査のために顕微鏡スライド上にマウントされ、ウェル中のカバーガラス上で増殖させています。 モータレスKIF5Bタンパク質の凝集の観察は、細胞質のサイズによって制限されます。検出が容易です多くの哺乳動物細胞中での集合体。しかし、細胞質の容積が核周囲および神経突起における小さい場合に神経細胞内凝集体を観察することは比較的困難です。 プロトコルは 、インビボ酵母ツーハイブリッドおよび生化学的プルダウンアッセイ13-16に加えKIF5Bと貨物との間の関連を示すために使用されます。すべてのこれらのアッセイは、異なる物理的条件下での関連性を決定し、それらの結果は、お互いを補完することができます。また、他のアッセイに対するこの蛍光アッセイの利点は、KIF5Bによって貨物の細胞内局在化（ 図1及び2）の調節を示すことができることです。 プロトコルは、KIF5Bに限定されるものではなく、そのような他のいくつかのキネシンモーター3と貨物3の細胞内輸送に使用されるミオシンモーター23,24の一部として、他のモータータンパク質の貨物を識別するために使用することができます。これらのモータータンパク質はまた、オリゴマー化のためのキネシンモーターとミオシンモーター用マイクロフィラメント、およびコイルドコイルセグメントのための微小管に沿って移動用モータドメインを含みます。それらのほとんどは、ホモ二量体3,23を形成します 。したがって、同様の戦略は、その貨物を識別するために、それらのモータレスドミナントネガティブ変異体を作成することによって、それらを適用することができます。

キネシン-1は、その貨物1,2の順行性輸送を媒介するモータータンパク質です。これは、キネシン軽鎖1（KLC1）とキネシン重鎖の2つのサブユニット（KHCs）の二つのサブユニットのヘテロ四量体です。 KIF5B 1、KHCは、そのN末端 ​​、ATPを加水分解し、微小管に沿った移動のための機械的エネルギーに化学エネルギーに変換するにモータードメインが含まれています。そのC末端領域は、貨物と関連付けるKLC1、と相互作用する二量体化ドメインが含まれています。キネシン-1は、小胞、細胞小器官およびmRNAを3,4として貨物を輸送します。最近、KIF5Bは細胞質5プロテオソーム分解の核転写因子のc-MYCを輸送することが示されました。三つの方法（化学的阻害剤は、siRNA / shRNAのドミナントネガティブ変異体）は、キネシン-1機能を阻害するために使用されました。彼らはすべての細胞質中でのc-MYCの凝集を誘導しました。最後の方法論では、c-MYCのみが支配的negatの影響を受けましたアイブKIF5Bの変異体ではなく、別の関連KIF5Aモータータンパク質のそれによって、変異体は、（微小管破壊など）の細胞内成分上またはタンパク質凝集の一般的な影響を及ぼさないことを示唆しています。 KIF5Bのドミナントネガティブ変異体はまた、転写因子の一般的な効果を発揮しないことを示唆している、他の転写因子に影響を及ぼしませんでした。むしろ、それは、ドミナントネガティブ変異体は、その貨物の特定の効果を発揮することを示唆しています。 ドミナントネガティブ変異体の使用は、モータータンパク質の分野では一般的です。キネシンとミオシンの類似モータレス変異体は、以前に使用されました。これらは主に貨物の細胞内局在にまたは6-12細胞機能の変異体の効果を実証するために使用されました。あまり重点が変異体およびそれらによって影響を受けた貨物の間の空間的関係に置かれました。しかし、いくつかの発生率では、変異体は、そのCAと共局在することが観察されましたrgos 6,10。 KIF5Bおよびその関連タンパク質との間の相互作用は、以前のインビボ酵母ツーハイブリッドアッセイなどの共免疫沈降およびインビトロプルダウンアッセイ13-16 における生化学的プルダウンアッセイにより確認されました。この記事では、蛍光顕微鏡を使用して追加の視覚的方法は、KIF5B貨物タンパク質を同定するために記載されています。この方法は、ドミナントネガティブ変異体として機能するモータレスKIF5B変異体を使用しています。これは、細胞質内で凝集し、その貨物の凝集を誘導します。 17 tdTomato蛍光タンパク質と野生型およびモータレスKIF5B変異体のタグ付けは、蛍光顕微鏡によって、その可視化を可能にします。タグ付けされたKIF5Bタンパク質は、適切にKIF5Bタグから分離されたスペクトル特性を有する異なる蛍光タンパク質に融合された候補タンパク質と共発現させることができます。タグ付けされたタンパク質は、生きた細胞内で直接観察されます蛍光顕微鏡下で。モータレスKIF5B変異によって候補タンパク質の凝集の誘導は、候補タンパク質がKIF5B の in vivoでの貨物であることを確認します。また、tdTomatoタグKIF5Bタンパク質は、内因性の積荷タンパク質に対するそれらの効果を研究するために細胞内で単独で発現させることができます。その後、免疫蛍光顕微鏡は、蛍光色素と結合し、適切な二次抗体、続いて、トランスフェクトした細胞を固定し、内因性候補タンパク質に対して特異的な抗体で染色された中で行われます。この場合には、その生理的なレベルで内因性の候補タンパク質が検討されています。他のモータータンパク質の類似モータレス変異体は、その貨物を識別するために調製することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="620">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">absolute ethanol (200 proof)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:113px;">BP2818</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM-I (transfection medium)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td align="right">51985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">formaldehyde, para</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-X100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td align="right">10342020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix)</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">12111424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink Quick Gel Extraction kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K210012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BamHI</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>R0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SalI</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>R0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">17898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">c-MYC rabbit antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td align="right">5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p53 mouse antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluorescent microscope&#160;</td>
			<td colspan="2">Olympus IX71_Fluoview</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">computer software for imaging</td>
			<td>&#160;cellSens&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of kinesin-1 cargos using fluorescence microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

外因的には、c-MYCは、核（図1A）に主に現れ、一方、野生型KIF5Bは、細胞質中に均一に見えた発現しました。しかし、モータレスKIF5B変異体は、細胞質（図1A）で凝集体を形成しました。モータレスKIF5Bの集約は、c-MYCの凝集を誘導しました。野生型KIF5Bを発現する細胞内で凝集TagCFPタグのc-MYCを発現する細胞の割合は低かったです。しかし、モータレスKIF5Bが（図1A）を共発現させたときに有意に高かったです。 C-MYCと変異KIF5Bの観察された共局在（図1）は、KIF5Bをc-MYCの細胞内局在を調節およびc-MYCのキネシン-1の貨物であることを示唆しています。構築物は、単独で発現された負の対照は、図1Aの下のパネルに含まれています。結果は、蛍光emissioの有意なブリードスルーがなかったことを示しn個。モータレスKIF5Bはまた、内因性のc-MYC（図1B）および転写因子p53の（ 図2）の凝集を誘導したことを示します c-MYCおよびp53の両方キネシン1の貨物であり、KIF5Bは、両方の内因性タンパク質の細胞内局在を調節します。一緒にキネシン-1阻害剤は、C-MYCおよびp53 5の両方のために高分子量種のベンガルラクトン（RBL）20誘発形成を上昇した結果と、p53はおそらくキネシン1の貨物です。 c-MYCのような核内転 ​​写因子であるp53は、また、プロテアソーム分解21,22のための核から細胞質へ輸出されることに注意することは興味深いことです。 KIF5Bによる転写因子の動きがモータレスKIF5B変異体の発現は、細胞内局在のc-Fosのに影響を与えるか、それが（ 図3）を集約することはありませんでしたので、特異的であるように思われる。上記のデータは、メトことを実証しています本書に使用さdはキネシン1貨物の高特異性の同定を可能にします。同様の戦略は、他のモータータンパク質にも適用することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig1.jpg" /> 図1：モータレスKIF5B変異体の発現は、細胞質におけるc-MYCの凝集を誘導する （A）HeLa細胞をtdTomatoタグ化野生型（WT）KIF5B（赤）及びTagCFPタグC-MYC（青）でトランスフェクトしました。 TagCFPタグ付きのc-MYCは核で主に登場しながらtdTomatoタグ付きWT KIF5Bは、細胞質に主に登場しました。しかし、tdTomatoタグ付きモータレスKIF5B変異体（赤）は、細胞質中の糸状または点状凝集体を形成しました。モータレスKIF5Bの発現は、c-MYCの凝集を誘導しました。変異KIF5Bおよびc-MYCが一緒に共局在（ピンク）。 CFP-C-MYC（％）の凝集を示す細胞（％）の割合が示されています。結果は以下のように示されています平均±SD（N = 3）。 tdTomatoタグ付きKIF5Bタンパク質または空のベクター（V）と一緒にTagCFPタグ付きのc-MYCの発現を有するネガティブコントロールは、下のパネルに示されています。 （B）同様の結果がtdTomatoタグ付きWTまたはモータレスKIF5Bタンパク質（赤）を発現させた内因性のc-MYC（緑）で得られました。 tdTomatoタグ付きモータレスKIF5B変異体は、細胞質内で凝集体を形成し、内因性のc-MYCの凝集を誘導しました。細胞質（オレンジ色）で一緒に共局在凝集体の両方の種類。核染料ヘキスト33342、またはDAPIで染色しました。スケールバー; 20μmである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53632/53632fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig2.jpg" /> 図2：モータレスKIF5B変異体の発現は、トンで、内因性のp53の凝集を誘発します彼は、HeLa細胞では細胞質、外因性tdTomatoタグ付き野生型（WT）KIF5B（赤）、内因性のp53（緑）は、主に核内に登場している間、細胞質で主に登場。これとは対照的に、tdTomatoタグ付きモータレスKIF5B変異体（赤）は、細胞質内で凝集体を形成しました。モータレスKIF5Bの発現は、細胞質（黄色）でKIF5Bの共局在とp53で、その結果、p53の凝集を誘導しました。実験は3回行いました。核色素DAPIで染色しました。スケールバー; 20μmである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53632/53632fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig3.jpg" /> 図3：モータレスKIF5B変異体の発現は細胞質中でのc-Fosのの凝集を誘導しない tdTomatoタグ付き野生型（WT）KIF5B（赤）が登場しました主に、HeLa細胞の細胞質に、EGFP-C-Fosの（緑色）、一方、核に主に現れました。逆に、tdTomatoタグ付きモータレスKIF5B変異体（赤）は、細胞質内で凝集体を形成しました。モータレスKIF5Bの発現は、c-Fosのの凝集を誘導しませんでした。実験は4回行いました。細胞の核を染色DAPIで染色しました。スケールバー; 20μmである。 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53632/53632fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>共通のリバースプライマー</td><td> 5&#39;-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 &#39; </td></tr><tr><td>野生型KIF5Bフォワードプライマー</td><td> 5&#39;- AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT-3 &#39; </td></tr><tr><td>モータレスKIF5Bフォワードプライマー</td><td> 5&#39;- AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC-3 &#39; </td></tr></tbody></table>表1：野生型およびモータレスKIF5Bタンパク質をクローニングするためのプライマー配列。

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Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

ここでは、プロトコルは、キネシン-1貨物を識別するために提示されています。キネシン-1重鎖（KIF5B）のモータレス変異体は、細胞質内で凝集し、その貨物の凝集を誘導します。両方の凝集体は、蛍光顕微鏡下で検出されます。同様の戦略は、他のモータータンパク質の貨物を識別するために使用することができます。

蛍光顕微鏡を用いたキネシン1貨物の同定

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

identification-of-kinesin-1-cargos-using-fluorescence-microscopy

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.8K ビュー.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai. ここでは、プロトコルは、キネシン-1貨物を識別するために提示されています。キネシン-1重鎖（KIF5B）のモータレス変異体は、細胞質内で凝集し、その貨物の凝集を誘導します。両方の凝集体は、蛍光顕微鏡下で検出されます。同様の戦略は、他のモータータンパク質の貨物を識別するために使用することができます。 

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Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

単一分子複合体の可視化インビボでの高度な蛍光顕微鏡を用いて

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

生物学

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

蛍光顕微鏡による可視化単分子のDNAの複製

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNAトランスフェクション後の有糸分裂のタイムラプスイメージング

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

細胞の電気融合を蛍光顕微鏡で可視化

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

分裂酵母の定量的なライブセル蛍光-顕微鏡解析

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

蛍光顕微鏡スクリーニングと次世代シーケンシング：オルガネラの整合性に関与する遺伝子の同定のための有用なツール

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

高度な3D蛍光顕微鏡を用いたオートファジーの定量分析

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

迅速な分析および蛍光顕微鏡画像の探索

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

オートファジーの解析で<em&gt;ペニシリウム·クリソゲヌム</em&gt;蛍光顕微鏡と組み合わせて飢餓パッドを使用した

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

蛍光顕微鏡でストロミュール頻度を可視化

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...