Roche's Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.

tdTomato-etiketli doğal tip ve motorsuz KIF5B Proteinler 1. Klonlama <ol><li> Tablo 1 &#39;de primerler kullanılarak insan vahşi tip ve motorsuz KIF5B proteinleri için cDNAlar yükseltin, Taq DNA polimerazı (100 uL, 5 birim), dNTP karışımı (her bir deoksinükleotit 2 mM) ve 30 devir için 10 X tamponu. Her döngü denatürasyon, aşama (30 saniye için 95 ° C) bir tavlama etabı (30 saniye için 45 ° C) ve bir uzatma aşamasından oluşuyordu (3 dakika için 72 ° C) meydana gelir. </li><li> fenol / kloroform eşit hacimde Yükseltilmiş DNA ürünü ekstrakte (1: 1). Not: Fenol yanıcı ve yanıklara neden olabilir. Kloroform tehlikelidir. Onlarla doğrudan temastan kaçının ve bir kimyasal davlumbaz altında bunları kullanmak. Seçenek olarak ise, PCR ürünleri, çeşitli kitleri ile saflaştırılabilir. <ol><li> 1 dakika için oda sıcaklığında, bir mikrosantrifüj içinde 18,000 x g&#39;de dönerler. yeni bir tüpe, sulu çözeltisini ve kloroform eşit hacimde ile ekstrakte edin. </li><li> dönüş0.5 dakika boyunca, oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj içinde 18,000 xg&#39;de. yeni bir tüpe sulu çözelti aktarın. </li><li> 3 M Na-asetat onda biri hacmi ve mutlak etanol iki hacim sulu çözelti ile karıştırılır. </li><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj içinde 18,000 x g&#39;de dönerler. Sulu çözüm atın. </li><li> % 75 etanol, iki hacim DNA pelet yıkayın. Sulu çözelti atın ve 5 dakika hava vermek için oda sıcaklığında DNA pelet kurutulur. 34 ul su DNA pelletini. </li></ol></li><li> sınırlama 40 ul&#39;lik nihai hacimde amplifiye ürünleri sindirmek SalI (10 birim) ve BamHI (10 birim) ve iki saat süre ile 37 ° C &#39;de kendi 10X tampon maddesi 4 ul enzim. etidyum bromür (0.2 ug / ml) ihtiva eden bir agaroz jeli içinde dijeste ürünleri (100 V&#39;ta% 1.0) giderin. Not: Etidyum bromür güçlü bir mutajen ve deri yoluyla absorbe edilebilir. Nedenle, W, doğrudan ya da dolaylı olarak temas önlemek için önemlidiri etidyum bromür. </li><li> sütunlarla arıtma için doğru bantları kesip. DNA fragmanını içeren agaroz jeli tartılır. Daha sonra yaklaşık 20 dakika süreyle, 37 ° C de çözücü tampon (0.1 g, 300 ul) içinde çözülür. </li><li> 5 saniye boyunca oda sıcaklığında bir mikrosantrifüj bir sütun ve bir dönüş sonuçlandı çözüm ekleyin. flow-through atın. </li><li> adım 1.5 tekrar 0.5 mi solübilizasyon, tampon ile kolon yıkayın. adım 1.5 tekrarlayarak 0.75 ml yıkama tamponu ile tekrar kolon yıkayın. 2 dk kalan yıkama tamponu kurtulmak için sütun Spin. </li><li> adım 1.5 tekrar 50 ul su ile DNA fragmanını yıkayın. etidyum bromür (0.2 ug / ml) ihtiva eden bir agaroz jel (100 V&#39;ta% 1.0), bir DNA büyüklüğü merdiveni karşı bunu bir kısım çalıştırarak DNA fragmanının konsantrasyonu tahmin. </li><li> Daha önce th ile sindirilmiş ptdTomato C1 vektörü 17 (yaklaşık 100 ng) ile saflaştırılmış ürünleri (yaklaşık 100 ng) ligateE aynı restriksiyon 16 saat oda sıcaklığında T4 DNA ligazı (2.000 ünite), 1 ul 10x ligasyon tamponu kullanılarak 10 ul enzim. Not: vahşi tip ve motorsuz mutant sırasıyla 2 ila 963 963 ve 584 amino asit ihtiva eder. Daha önce, daha büyük bir motorsuz KIF5B mutan işlevini 9 tespit etmek için kullanıldı. Daha küçük bir motorsuz KIF5B mutantı olarak ifade seviyelerini arttırmak amacıyla, bu çalışmalar için kullanılmıştır. </li></ol> 2. İmmünofloresan Mikroskopi <ol><li> Canlı hücre ya da ya da 40X aşağıdaki büyütme ile dolaylı flüoresan görüntüleme için, 1 ml komple ortam içinde 0,2-0.300.000 HeLa hücrelerini tohum her bir gözündeki [Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı,% 10 fetal sığır serumu ile (DMEM) (FBS)] altı plaka. % 5 CO2 37 ° C&#39;de büyütülmüştür. </li><li> 40X üstünde büyütme ile dolaylı immünfloresan çalışmaları, kapak gözlük yıkamak için, mutlak etanol kısaca ve (18 mm x 18 mm 1.5 kalınlık) onları havada kurutunBir biyogüvenlik kabini içinde altı plaka kuyuları, kontaminasyonu önlemek için. <ol><li> 1 tohum ,2-0.300.000 hücre altı gözlü bir plakanın her çukuruna DMEM ortamı tam ml. </li></ol></li><li> Transfeksiyon Kompleksinin Hazırlanması <ol><li> Sonraki gün, bir biyo-güvenlik kabini içinde, bir kargo aday protein için bir ekspresyon plazmidi varlığında ya da yokluğunda tdTomato-etiketli doğal tip veya motorsuz KIF5B için ekspresyon plazmidi, 0.6 ug (toplam) seyreltin (pTagCFP-c-myc 5 ) 1.6 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 0.1 ml transfeksiyon ortamı ile. Not: Vector pTagCFP-c-myc TagCFP-etiketli c-myc ifade eder. </li><li> Başka bir 1.6 ml mikrosantrifüj tüpü içinde 0.1 ml transfeksiyon ortamı transfeksiyon reaktifi 1.8 ul ekle. Tipik olarak, 12 örnek için yeterli seyreltilmiş transfeksiyon reaktif bir ana karışımı hazırlayın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. </li><li> seyreltilmiş 0.1 ml DNA&#39;lar seyreltilmiş 0.1 ml transfeksiyon reaktifı ilave edin. Mitüpleri tersine çevirerek içindekileri x. Bir mikrosantrifüj 5 saniye boyunca tüpler Spin. </li><li> Oda sıcaklığında, 45 dakika süre ile inkübe edilir. </li></ol></li><li> Hücrelerin Yıkama <ol><li> transfeksiyon kompleksi oluşumu için kuluçka süresi boyunca serpilmiş hücreleri fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile üç kez yıkanır. </li><li> Her seribaşı hücrelerin orta değiştirin iyi ile 0.8 ml önceden ısıtılmış transfeksiyon ortamı. 37 ° C&#39;de inkübatör plakaları dönün. </li></ol></li><li> Hücrelerin transfeksiyonu <ol><li> 45 dakika inkübasyondan sonra, plakanın her bir DNA / transfeksiyon reaktifi (adım 2.3 hazırlandı) kompleksi damla damla 0.2 ml ilave ediniz. </li><li> bunlar, 37 ° C&#39;de kuluçka makinesine geri döndürülmüştür önce 5 saniye yavaşça 6 plaka sallayın. </li><li> 6-8 saat sonra, tam bir DMEM ortamıyla yapılan orta yerine. </li></ol></li><li> Canlı hücre Floresans Görüntüleme 18 için <ol><li> İnkübasyon karışımını bir ek 16 saat sonraT 37 ° C, 1 uM nihai konsantrasyona kadar orta DNA interkalasyon leke Hoechst 33342 ekleyin. Not: Hoechst 33342 hücre çekirdekleri lekeleyen bir hücre geçirgen DNA interkalasyon boyadır. </li><li> 40X objektif kullanılarak flüoresan mikroskopi ile floresan proteinleri ekspresyonu için bunları incelemeden önce 37 ° C&#39;de inkübatör içinde 10 dakika süre ile transfekte edilmiş hücreler inkübe edin. DAPI, OBP, FITC ve Cy3 için filtre setleri sırasıyla (Ex350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (Ex470 nm / Em525 nm) ve (Ex545 nm / Em605 nm) &#39;dir. Not: Arka nedeniyle tam bir DMEM ortamı otomatik floresan yüksekse, fenol kırmızısı olmadan orta kullanılır. </li></ol></li></ol> Dolaylı İmmünoflöresan Çalışmaları 3. <ol><li> Paraformaldehyde Çözüm hazırlanması <ol><li> paraformaldehit tozu (100 ml PBS başına 4 gr) tartılır ve PBS ekleyin. Not: Paraformaldehyde yanıcı katı ve potansiyel kanser hazar olduğunud. Bu gözleri, solunum sistemini ve deriyi tahriş edicidir. Nedenle, bu paraformaldehit ile temas veya inhalasyon önlemek için önemlidir. </li><li> çözeltisi (150 ul 10 N NaOH / 100 mi) NaOH ekleyin. </li><li> Ara sıra çalkalanarak 2-3 saat boyunca 42 ° C&#39;ye kadar 37 ° C&#39;de çözelti tutun. </li><li> eritilir paraformaldehit toz sonra çözelti (yaklaşık 75 ul / 100 mi), buzlu asetik asit eklenerek 7.0 pH&#39;a ayarlamak. </li></ol></li><li> Hedef proteinler Boyama <ol><li> 37 ° C&#39;de 16 saat daha inkübasyondan sonra, 5 saniye için, altı oyuklu plaka dönen tarafından bir kez PBS ile oda sıcaklığında transfekte hücreler yıkayın. </li><li> oyuk başına taze hazırlanmış,% 4 paraformaldehit çözeltisi 1 ml hücreleri saptamak. 30 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> bir kez 5 saniye altı-plaka için dönen PBS ile hücreleri yıkayın. çözüm atın. </li><li> 30 dakika boyunca oda sıcaklığında% 0.1 (PBS içinde) Triton-X-100, 1 ml kuluçkaya bırakılır. dethücre içi hedeflere antikorların erişmesine izin vermek için hücre zarı permeabilize olacak Triton-X 100 ergent. </li><li> 5 saniye, her seferinde altı gözenekli plaka karıştırılırken PBS ile dört kez hücreleri yıkayın. Her yıkamadan sonra çözüm atın. </li><li> 4 saat sallayarak, oda sıcaklığında PBS çözeltisi içinde bir% 10 FBS içinde, (0.1 ug / ml c-myc tavşan antikoru veya p53 fare antikoru) birincil antikor 1 ml kuluçkaya bırakılır. </li><li> 5 saniye, her seferinde altı gözenekli plaka karıştırılırken PBS ile dört kez yıkayın. Her yıkamadan sonra çözüm atın. </li><li> 2 saat sallayarak karanlıkta, oda sıcaklığında PBS içinde% 10 FBS içinde, (0.5 ug / ml ve Alexa Fluor 488-bağlı anti-tavşan veya anti-fare IgG antikoru) fluoresan boya-konjüge edilmiş ikincil antikor, 1 ml kuluçkalayın. </li><li> 5 saniye, her seferinde altı gözenekli plaka karıştırılırken PBS ile dört kez yıkayın. Her yıkamadan sonra çözüm atın. </li></ol></li><li> Nükleer Boyama ve Montaj <ol><l10 dakika süre ile karanlıkta, oda sıcaklığında PBS içinde (0.5 ug / ml DAPI) i&gt; DNA araya eklenen boyanın 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol, 1 ml kuluçkaya bırakılır. kapak gözlük kullanılmaktadır zaman 3.4 adıma geçin. Not: DAPI hücre çekirdekleri lekeleyen bir DNA interkalasyon boyadır. </li><li> Her bir mikroskop lamı üzerine monte çözeltisi 10 ul uygulanır. bir mikroskop lamı üzerine montaj çözümü üzerinde her cam kapak monte edin. </li><li> gece boyunca karanlıkta oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> oje ile kapak gözlük kenarları mühür. Gecede oje duman kaldırmak için bir davlumbaz içine karanlıkta yerleştirin. </li></ol></li><li> Floresan Mikroskopi 19 <ol><li> Ertesi gün, 40X objektif kullanılarak floresan mikroskop ile hücrelerin inceleyin. DAPI, OBP, FITC ve Cy3 için filtre setleri sırasıyla (Ex350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (Ex470 nm / Em525 nm) ve (Ex545 nm / Em605 nm) &#39;dir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+in+neurons:+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function,+development,+and+disease.">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68, 610-638 (2010).</li><li>Yu, Y., Feng, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+kinesin+family+proteins+in+tumorigenesis+and+progression:+potential+biomarkers+and+molecular+targets+for+cancer+therapy.">The role of kinesin family proteins in tumorigenesis and progression: potential biomarkers and molecular targets for cancer therapy.</a> Cancer. 116, 5150-5160 (2010).</li><li>Verhey, K. J., Hammond, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+control:+regulation+of+kinesin+motors.">Traffic control: regulation of kinesin motors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 765-777 (2009).</li><li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport.">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).</li><li>Lee, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+c-MYC+by+Kinesin-1+for+proteasomal+degradation+in+the+cytoplasm.">Transport of c-MYC by Kinesin-1 for proteasomal degradation in the cytoplasm.</a> Biochim Biophys Acta. 1843, 2027-2036 (2014).</li><li>Bittins, C. M., Eichler, T. W., Hammer, J. A., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant-negative+myosin+Va+impairs+retrograde+but+not+anterograde+axonal+transport+of+large+dense+core+vesicles.">Dominant-negative myosin Va impairs retrograde but not anterograde axonal transport of large dense core vesicles.</a> Cell Mol Neurobiol. 30, 369-379 (2010).</li><li>Kimura, T., Watanabe, H., Iwamatsu, A., Kaibuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+and+CRMP-2+complex+is+transported+via+Kinesin-1.">Tubulin and CRMP-2 complex is transported via Kinesin-1.</a> J Neurochem. 93, 1371-1382 (2005).</li><li>Lindsay, A. J., McCaffrey, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+is+required+for+the+transport+of+fragile+X+mental+retardation+protein+(FMRP)+granules.">Myosin Va is required for the transport of fragile X mental retardation protein (FMRP) granules.</a> Biol Cell. 106, 57-71 (2014).</li><li>Rivera, J., Chu, P. J., Lewis, T. L., Arnold, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Kif5B+in+axonal+localization+of+Kv1+K(+)+channels.">The role of Kif5B in axonal localization of Kv1 K(+) channels.</a> Eur J Neurosci. 25, 136-146 (2007).</li><li>Roland, J. T., Kenworthy, A. K., Peranen, J., Caplan, S., Goldenring, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Vb+interacts+with+Rab8a+on+a+tubular+network+containing+EHD1+and+EHD3.">Myosin Vb interacts with Rab8a on a tubular network containing EHD1 and EHD3.</a> Mol Biol Cell. 18, 2828-2837 (2007).</li><li>Uchida, A., Alami, N. H., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+functional+coupling+of+kinesin-1A+and+dynein+motors+in+the+bidirectional+transport+of+neurofilaments.">Tight functional coupling of kinesin-1A and dynein motors in the bidirectional transport of neurofilaments.</a> Mol Biol Cell. 20, 4997-5006 (2009).</li><li>Zadeh, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kif5b+is+an+essential+forward+trafficking+motor+for+the+Kv1.5+cardiac+potassium+channel.">Kif5b is an essential forward trafficking motor for the Kv1.5 cardiac potassium channel.</a> J Physiol. 587, 4565-4574 (2009).</li><li>Su, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF5B+promotes+the+forward+transport+and+axonal+function+of+the+voltage-gated+sodium+channel+Nav1.8.">KIF5B promotes the forward transport and axonal function of the voltage-gated sodium channel Nav1.8.</a> J Neurosci. 33, 17884-17896 (2013).</li><li>Lalioti, V. S., Vergarajauregui, S., Tsuchiya, Y., Hernandez-Tiedra, S., Sandoval, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daxx+functions+as+a+scaffold+of+a+protein+assembly+constituted+by+GLUT4,+JNK1+and+KIF5B.">Daxx functions as a scaffold of a protein assembly constituted by GLUT4, JNK1 and KIF5B.</a> . J Cell Physiol. 218, 416-426 (2009).</li><li>Cho, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+kinesin-binding+domain+of+RanBP2+to+KIF5B+and+KIF5C+determines+mitochondria+localization+and+function.">Association of the kinesin-binding domain of RanBP2 to KIF5B and KIF5C determines mitochondria localization and function.</a> Traffic. 8, 1722-1735 (2007).</li><li>Diefenbach, R. J., Diefenbach, E., Douglas, M. W., Cunningham, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+receptor,+p180,+interacts+with+kinesin+heavy+chain,+KIF5B.">The ribosome receptor, p180, interacts with kinesin heavy chain, KIF5B.</a> Biochem Biophys Res Commun. 319, 987-992 (2004).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+imaging.">Live-cell fluorescence imaging.</a> Methods Cell Biol. 114, 125-150 (2013).</li><li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014, (2014).</li><li>Hopkins, S. C., Vale, R. D., Kuntz, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+kinesin+activity+from+structure-based+computer+screening.">Inhibitors of kinesin activity from structure-based computer screening.</a> Biochemistry. 39, 2805-2814 (2000).</li><li>Zhang, Y., Xiong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+p53+ubiquitination+and+nuclear+export+by+MDM2+and+ARF.">Control of p53 ubiquitination and nuclear export by MDM2 and ARF.</a> Cell Growth Differ. 12, 175-186 (2001).</li><li>Michael, D., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p53-Mdm2+module+and+the+ubiquitin+system.">The p53-Mdm2 module and the ubiquitin system.</a> Semin Cancer Biol. 13, 49-58 (2003).</li><li>Kneussel, M., Wagner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+motors+at+neuronal+synapses:+drivers+of+membrane+transport+and+actin+dynamics.">Myosin motors at neuronal synapses: drivers of membrane transport and actin dynamics.</a> Nat Rev Neurosci. 14, 233-247 (2013).</li><li>Maravillas-Montero, J. L., Santos-Argumedo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+family:+unconventional+roles+of+actin-dependent+molecular+motors+in+immune+cells.">The myosin family: unconventional roles of actin-dependent molecular motors in immune cells.</a> J Leukoc Biol. 91, 35-46 (2012).</li></ol>

Bu yazıda Serbest Erişim yayın ve üretim Roche tarafından ödenir.

tarif edilen yöntem, mikrotübül boyunca hareket yeteneği olmayan motorsuz KIF5B mutant özelliklerini kullanmaktadır, ama aynı kargo proteinleri ile etkileşim tetramerik proteini doğal tipte KIF5B olan dimerler ve böylece izin yeteneğini muhafaza eder yabani tip KIF5B olarak. Motorsuz KIF5B, bu nedenle, kargoyla agrega mislocalized dominant negatif mutant ve form olarak görev yapmaktadır. Bu yöntem (Şekil 1) 5 kinesin-1 kargo c-MYC tanımlamak için kanıtlanmıştır. Bu makalede, aynı motorsuz KIF5B mutant kinesin-1 bir başka potansiyel yük (Şekil 2) ve p53 tespit etmek için kullanıldı. Bu metodoloji Kinesin-1 ve diğer yüklerin tespit etmek mümkün olduğunu göstermektedir. Bundan başka, mutant özgüllüğü negatif kontrol proteini, c-fos (Şekil 3) mutant etkisinin olmaması sağlanır. Bu protokolde, vahşi ty tdTomato etiketliPE veya motorsuz KIF5B proteinin diğer bir floresan protein-etiketli bir aday kargo proteini ile birlikte eksprese edilmiştir. Bu durumda, canlı hücre, flüoresans mikroskopisi ve görüntüleme gerçekleştirilir. agrega oluşumu time-lapse görüntüleme ile izlenebilir. Alternatif olarak, tdTomato-etiketli protein tek başına ifade edilir ve fizyolojik düzeyde aday kargo protein spesifik antikorlar kullanılarak indirekt mikroskobik tarafından görüntülenmiştir. Floresan protein tdTomato parlaklığı ve Fotostabilitesi 17 için seçilir. Arka plan tam bir DMEM ortamıyla otomatik floresans dolayı yüksek ise, fenol kırmızısı olmadan orta kullanılır. motorsuz KIF5B mutant stoikiometrik doğal tipte KIF5B olan dimerler oluşturur. Bu nedenle, kendi işlevini inhibe etmek ve agregatlar oluşturması için, vahşi tip muadilleri ile dimerleri meydana getirmek üzere motorsuz KIF5B mutantının yeterli miktarda ifade için çok önemlidir. , İfade optimizasyonu bu sorunu gidermek içinmotorsuz mutantının salgılamanın gereklidir. Bu dimerizasyon domenini ihtiva eden küçük bir motorsuz mutantı kullanılarak elde edilir. Buna ek olarak, uygun bir transfeksiyon reaktifi ve protokol optimizasyonu da gereklidir. DNA / transfeksiyon reaktifi ile HeLa hücre inkübasyon süresi ekzojen proteinleri ve hücre canlılığı ekspresyonu için, HeLa hücrelerinde optimize edilmiştir. İnkübasyon süresi, diğer hücre hatları için optimize edilmesi gerekebilir. 40X 4X arasındaki büyütme için, kapak gözlük gereklidir. Hücreler doğrudan kuyularda incelenebilir. Bu nedenle, bu durumda, iletişim kuralı, ucuz ve uygundur. 40X Yukarıdaki büyütme için, hücreler boyandıktan sonra, yağ daldırma hedefleri kapsamında incelenmek üzere mikroskop slaytlar üzerine monte edilmiştir, kuyularda kapak camları yetiştirilir ve edilmektedir. motorsuz KIF5B protein agregatları gözlenmesi sitoplazma büyüklüğü ile sınırlıdır. Tespit etmek kolaydırBirçok memeli hücrelerinde toplar. Bununla birlikte, sitoplazma hacmi çekirdekleri yaklaşık ve nöritlere küçük olduğunda nöronal hücrelerde agrega gözlemlemek nispeten zordur. Protokol, in vivo maya iki-hibrid ve biyokimyasal açılan deneyleri 13-16 ilave olarak KIF5B ve yükler arasındaki ilişkiyi göstermek için kullanılır. Bütün bu deneyler farklı fiziksel koşullarda ilişkisini belirlemek ve bunların sonuçları birbirini tamamlayabilir. Ayrıca, diğer testlere göre, bu flüoresans deneyi avantajı KIF5B ile yüklerin hücre içi lokalizasyonu düzenlenmesini göstermektedir ki, (1 Şekil 2). Protokol KIF5B ile sınırlı değildir ve başka bir kinesin motorların 3 ve yükler 3 hücre içi ulaşım kullanılan miyozin motorlar 23,24 gibi bazı diğer motorlu proteinlerin yükleri tanımlamak için kullanılabilir. Bu motor proteinler de oligomerization için kinesin motorlar ve miyozin motorlar için mikrofilamentlerin, ve helezonik-coil kesimleri için mikrotübül boyunca hareket için motorlu etki içerir. Çoğu homodimerler 3,23 oluşturur. Bu durumda, benzer bir strateji şekilde yüklerini belirlemek üzere motorsuz baskın negatif mutantlar oluşturarak bunlara uygulanabilir.

Kinesin-1 kendi kargolar 1,2 ileriye taşınmasını aracılık eden motor proteindir. Bu kinesin hafif zincir 1 (KLC1) ve kinesin ağır zincirler, iki alt-birimden (KHCs) iki alt birimden oluşan bir heterotetramer olup. KIF5B 1, bir KHC, N-terminal, ATP hidroliz ile mikro boyunca hareket için mekanik enerjiye kimyasal enerjiyi dönüştürür bir motor fonksiyonun içerir. Bu C-terminal bölgesidir kargoyla ilişkilendiren KLC1, etkileşimde dimerizasyon alanı içerir. Kinesin-1 gibi veziküller, organeller ve mRNA&#39;ların 3,4 olarak kargoları taşır. Son zamanlarda, KIF5B sitoplazma 5 proteozomal degradasyon nükleer transkripsiyon faktörü, c-myc taşımak için gösterilmiştir. Üç yöntemleri (Kimyasal inhibitör, siRNA / shRNA ve dominant negatif mutantı) kinesin-1 fonksiyonunu inhibe etmek için kullanıldı. Hepsi sitoplazmada c-myc agregasyonunu neden olmuştur. Son yöntem, c-myc, sadece hakim negat etkilenmiştirMutant, genel (mikrotübül bozulması) gibi hücre içi bileşenleri üzerindeki etkileri ya da protein agregasyonu üzerinde uyguladığı etmediğini ortaya koyarak, ilgili başka bir KIF5A motoru proteininin göre KIF5B bir mutantı ive değil. KIF5B dominant negatif mutantı da transkripsiyon faktörleri ile ilgili genel etkilere neden etmediğini ortaya koyarak, bir transkripsiyon faktörü etkilemedi. Aksine, bu dominant negatif mutant kendi kargolar üzerinde spesifik etkileri baskı oluşturduğunu düşündürmektedir. baskın negatif mutantlarının kullanımı motor proteinlerinin alanında yaygındır. kinesinlerin ve Miyosinler Benzer motorsuz mutantlar daha önce kullanılmıştır. Onlar esas olarak kendi kargolar hücre içi lokalizasyonu veya hücresel fonksiyonları 6-12 mutantların etkilerini göstermek için kullanılmıştır. Daha az vurgu mutantlar ve onlar tarafından etkilenen kargoların arasındaki mekansal ilişki konulmuştur. Bununla birlikte, bazı olaylar olarak, mutasyonlar, CA ile birlikte lokalize olduğu gözlenmiştirrgos 6,10. KIF5B ve ilgili proteinler arasındaki etkileşimin daha önce in vivo olarak maya iki-hibrid tahlili ve ko-immünopresipitasyon ve in vitro olarak açılan deneylerinde 13-16 biyokimyasal açılan deneyleri ile teyit edilmiştir. Bu yazıda, ek bir görsel yöntem kullanarak floresan mikroskopi KIF5B kargo proteinleri tespit etmek açıklanmıştır. yöntem, bir baskın negatif mutant olarak hareket eden bir motorsuz KIF5B mutant kullanır. Bu sitoplazmalarında agrega ve kargoların agregasyonunu uyarır. 17 tdTomato floresan protein vahşi tip ve motorsuz KIF5B mutantının etiketleme flüoresans mikroskopisi ile görselleştirme sağlar. etiketli KIF5B proteinleri uygun KIF5B etiketten ayrıldı spektral özelliklere sahip bir farklı floresan proteinine aday protein ile birlikte ifade edilebilir. etiketli proteinler canlı hücrelerde doğrudan gözlenirfloresan mikroskobu altında. Motorsuz KIF5B mutant tarafından aday proteini birikiminin indüksiyon aday protein KIF5B in vivo kargo olduğunu teyit edecektir. Ayrıca, tdTomato-etiketli KIF5B proteinleri endojen kargo proteinleri üzerindeki etkilerini incelemek için hücreler tek başına ifade edilebilir. Daha sonra, immünofloresan mikroskopi, bir floresan boya ile konjüge edilmiş uygun bir ikincil antikor, ardından transfekte edilmiş hücreler, sabit ve endojen bir aday proteinine karşı spesifik bir antikor ile boyanmış olan gerçekleştirilir. Bu durumda, kendi fizyolojik olarak endojen Aday Protein incelenmiştir. Diğer motorlu proteinlerinin benzer motorsuz mutantlar da yüklerin tespit etmek hazırlanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="620">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">absolute ethanol (200 proof)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:113px;">BP2818</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM-I (transfection medium)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td align="right">51985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">formaldehyde, para</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-X100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td align="right">10342020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix)</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">12111424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink Quick Gel Extraction kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K210012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BamHI</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>R0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SalI</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>R0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">17898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">c-MYC rabbit antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td align="right">5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p53 mouse antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluorescent microscope&#160;</td>
			<td colspan="2">Olympus IX71_Fluoview</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">computer software for imaging</td>
			<td>&#160;cellSens&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of kinesin-1 cargos using fluorescence microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Eksojen c-MYC çekirdeği (Şekil 1A) ağırlıklı çıktı ise yabani tip KIF5B, sitoplazmada homojen çıktı dile getirdi. Ancak, motorsuz KIF5B mutant sitoplazma (Şekil 1A) içinde agrega kurdu. motorsuz KIF5B agregasyonu c-myc agregasyonunu neden olmuştur. hücrelerin yüzdesi düşük doğal tipte KIF5B ifade eden hücrelerde TagCFP-etiketli c-myc birleştirilmiş ifade edilmesi. Bununla birlikte, motorsuz KIF5B (Şekil 1A), birlikte ifade edildiğinde önemli ölçüde daha yüksek olmuştur. C-myc mutant KIF5B gözlenen ortak yeri (Şekil 1) KIF5B c-myc ve hücre içi lokalizasyonu düzenler ve c-myc Kinesin-1 &#39;deki bir kargo olduğunu göstermektedir. Konstrukt tek başına ifade edildiği Negatif kontroller Şekil 1A alt panelde yer almaktadır. Sonuçlar floresan emissio anlamlı boşaltma yoluyla olduğunu göstermektedirn. Motorsuz KIF5B da endojen c-myc (Şekil 1B) ve transkripsiyon faktör p53 (Şekil 2) &#39;nin birarada toplanmasını neden olduğunu belirten c-myc ve p53 hem Kinesin-1 yükler ve KIF5B hem endojen proteinlerin hücre içi lokalizasyonu düzenler. Birlikte kinesin-1 inhibitörü, c-myc ve p53 5 hem de bengal lakton (RBL) yüksek molekül ağırlıklı türlerin 20 indükler oluşumunu yükseldiğini sonuçları p53 olasılıkla Kinesin-1 bir kargo olup. C-MYC gibi nükleer transkripsiyon faktörü p53, aynı zamanda proteozomal bozulması 21,22 için sitoplazmaya çekirdekten dışa dikkat çekicidir. Motorsuz KIF5B mutantının sentezleme hücre içi lokalizasyonu, c-fos etkiler ya da bir araya getirmek için (Şekil 3) sebep çünkü KIF5B transkripsiyon faktörlerinin hareket spesifiktir. Yukarıdaki veriler metoksi göstermektedirBu yayında kullanılan d kinesin-1 kargoların yüksek özgüllük tanımlanmasına izin verir. Benzer bir strateji, hem de diğer motorlu proteinlerine uygulanabilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig1.jpg" /> Şekil 1: motorsuz KIF5B mutant sentezlenmesi sitoplazma c-myc toplama indükler (A) HeLa hücreleri tdTomato-etiketli doğal tipte (WT) KIF5B (kırmızı) ve TagCFP-etiketli c-myc (mavi) ile transfekte edilmiştir.. MYC Cı-çekirdeği esas olarak ortaya TagCFP-etiketli ise tdTomato etiketli WT KIF5B sitoplazmada esas olarak ortaya çıktı. Bununla birlikte, tdTomato-etiketli motorsuz KIF5B mutantı (kırmızı) sitoplazmada filamentli veya noktalı agregatlar oluşturan. motorsuz KIF5B sentezlenmesi c-myc agregasyonunu neden olmuştur. Mutant KIF5B ve c-MYC birlikte (pembe) co-lokalize. CFP-c-myc (%) ve bir toplanmayı gösteren hücreler (%) yüzdeleri gösterilmiştir. Sonuçlar olarak gösterilirSD (N = 3) ortalama ±. tdTomato etiketli KIF5B proteinler veya boş vektör (V) ile birlikte TagCFP-etiketli c-myc ekspresyonu ile Negatif kontroller alt panelde gösterilmektedir. (B) Benzer sonuçlar tdTomato etiketli WT, motorsuz KIF5B proteinleri (kırmızı) olarak ifade edilmiştir, endojen c-myc (yeşil) ile elde edilmiştir. tdTomato etiketli motorsuz KIF5B mutant sitoplazmada agrega oluşturulur ve endojen c-myc agregasyonunu neden olmuştur. agrega Her iki tür sitoplazmasında (turuncu) birlikte lokalize eş. çekirdekler boya Hoechst 33342 ve DAPI ile boyanmıştır. Ölçek çubuğu; 20 mikron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53632/53632fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig2.jpg" /> Şekil 2: motorsuz KIF5B mutant sentezlenmesi t endojen p53 birikmesini uyarmaktadırendojen p53 (yeşil) çekirdekte esas olarak ortaya ederken HeLa hücrelerinde. sitoplazma, eksojen tdTomato-etiketli doğal tipte (WT) KIF5B (kırmızı), sitoplazmada esas olarak ortaya çıktı. Bunun aksine, tdTomato-etiketli motorsuz KIF5B mutantı (kırmızı) sitoplazmada agregatlar oluşturan. motorsuz KIF5B sentezlenmesi sitoplazma (sarı) içinde KIF5B eş-lokalizasyonu ve p53 ile sonuçlanan, p53 birikmesini arttırmaktadır. Deney üç kez uygulandı. çekirdek boyası DAPI ile boyanmıştır. Ölçek çubuğu; 20 mikron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53632/53632fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/53632/53632fig3.jpg" /> Şekil 3:. Motorsuz KIF5B mutant sentezlenmesi sitoplazma c-Fos agregasyonunu indüklemez vahşi tip tdTomato-etiketli (WT) KIF5B (kırmızı) çıktıesas olarak EGFP-c-fos (yeşil) çekirdekte esas çıktı ise HeLa hücrelerin sitoplazması içinde. Aksine, tdTomato-etiketli motorsuz KIF5B mutantı (kırmızı) sitoplazmada agregatlar oluşturan. motorsuz KIF5B İfade c-Fos toplanmasını teşvik etmedi. Deney dört kez uygulandı. hücrelerin çekirdekleri, boya DAPI ile boyanmıştır. Ölçek çubuğu; 20 mikron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53632/53632fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Ortak ters primer </td><td> 5&#39;-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 &#39; </td></tr><tr><td> vahşi tip KIF5B ileri primer </td><td> 5&#39;-AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT-3 &#39; </td></tr><tr><td> motorsuz KIF5B ileri primer </td><td> 5&#39;-AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC-3 &#39; </td></tr></tbody></table>Tablo 1: vahşi tip ve motorsuz KIF5B proteinlerini klonlamak için astar dizilerini sıralamaktadır.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Burada, bir protokol kinesin-1 yükleri belirlemek için sunulmuştur. Kinesin-1 ağır zincir (KIF5B) bir motorsuz mutant sitoplazmasında agrega ve kargoların agregasyonunu uyarır. Her iki agrega floresan mikroskobu altında tespit edilir. Benzer bir yöntem, diğer motor proteinlerinin yükleri tespit edilmesi için kullanılabilir.

Floresan mikroskobu kullanarak kinesin-1 Cargos Tanımlanması

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

identification-of-kinesin-1-cargos-using-fluorescence-microscopy

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.8K Görüntüleme.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  Burada, bir protokol kinesin-1 yükleri belirlemek için sunulmuştur. Kinesin-1 ağır zincir (KIF5B) bir motorsuz mutant sitoplazmasında agrega ve kargoların agregasyonunu uyarır. Her iki agrega floresan mikroskobu altında tespit edilir. Benzer bir yöntem, diğer motor proteinlerinin yükleri tespit edilmesi için kullanılabilir. 

Video: Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Tek Moleküler Kompleksleri görselleştirme In Vivo Gelişmiş Floresan Mikroskopi

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Biyoloji

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Hücre Elektrofüzyon Floresan Mikroskop ile görüntülendi

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Otofaji Analiz<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Floresan Mikroskopi ile Kombinasyon Açlık Pedleri kullanarak

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Floresan Mikroskopi ile Stromule Frekansı görselleştirme

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...