サミールハムダンは、この技術の開発に支援。E.を大腸菌のタンパク質は、教授ニックディクソンの研究室からウーロンゴン大学であり、T7タンパク質は、教授チャールズリチャードソン、ハーバードメディカルスクールからです。作品は、国立衛生研究所（AMvOにGM077248）とジェーン棺チャイルズ財団（JJL）によってサポートされています。

単一分子の複製の実験を行う前に、いくつかの材料は、事前に準備する必要があります。 1。 DNA複製のテンプレート複製反応の基質は、標準的な分子生物学技術の1,2を用いて調製したビオチン化、両側M13ローリングサークルです。 材料：M13mp18一本鎖DNA、ビオチン尾のオリゴヌクレオチドプライマー（5&#39; -ビオチン- T 36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT - 3&#39;）、T7 DNAポリメラーゼ、ヒートブロック、アミルフェノール/アルコール/クロロホルム<ol><li> TBSバッファー（330 nMの尾オリゴ、33 nMのM13）のオリゴの10倍過剰を追加することでM13にビオチン尾オリゴをアニール。 </li><li>混合物に65℃のヒートブロックで加熱する。一度加熱し、ヒートブロックをオフにし、徐冷が適切にプライマーをアニールすることができます。 </li><li> 64 nMのT7 DNAポリメラーゼやdNTPおよびMgCl 2を含有する T7レプリケーションバッファの混合物にプライミングM13を追加。 </li><li> 12分間37℃で反応をインキュベートし、100mMのEDTAで急冷。 </li><li>精製記入済みの製品のDNAフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出し、TE緩衝液または他の適切な保存バッファーに透析し、DNA濃度（M13をプライム、残留を回復するために、各有機相を逆抽出）を決定した。 </li><li>テンプレートの準備の1回の繰り返しは容易に単一分子実験の数百〜数千のために十分な、ナノモル濃度のテンプレートのいくつかのミリリットルを行うことができます。 </li></ol> 2。官能化されたカバーグラスガラスのカバースリップにDNAを取り付けるために、ガラスはまずビオチン化PEGの分子に結合されてアミノシラン、で官能れる。このコーティングは、表面1,3とDNAと複製タンパク質の非特異的な相互作用を低減することができます。 材料：ガラスのカバーガラス、染色瓶、3 -アミノプロピルトリエトキシシラン、メトキシPEG5k - NHSエステル、ビオチン- PEG5k - NHSester、アセトン、1M KOH、エタノール、オーブン、バス音波処理<ol><li> jarファイルを染色し、エタノールで瓶を充填に配置することにより、ガラス製カバースリップを徹底的に清掃してください。 30分間超音波洗浄し、瓶を洗浄し、1 M KOHで埋める。両方の洗浄を繰り返して30分間超音波洗浄器にかけます。 </li><li>第一機能化反応の場合は、水のすべての痕跡を削除する必要があります。 10分間アセトンと超音波処理してjarを埋める。アセトンで再びjarをすすいでください。 </li><li>アセトンでシラン試薬の2％v / v溶液を準備します。染色瓶に追加し、2分間振とうする。この反応は、カップルガラスにアミノシランのアルコキシ基を、次のカップリングステップの反応性アミンを残して。水の大過剰の反応をクエンチ。 </li><li> 110℃で30分間オーブンで焼成することによってカバースリップを乾かします。 </li><li> 100mMのNaHCO 3で pHを8.2にビオチンPEGの混合物：50:1メトキシを準備します。約0.2％w / vのビオチン化PEGを目指す。 </li><li>乾燥したシラン化カバースリップと場所の上に別のカバースリップ上にPEG混合物の100μL添加します。ガラスのカバースリップのスペーサーを含めると、カバースリップの分離が可能になります。 </li><li> 3時間のPEG溶液中でカバーグラスをインキュベートし、カバーガラスの各ペアを分離し、水で広範囲に洗ってください。一度だけの側として側を上に官能カバースリップがPEGでコーティングされるように十分注意してください。 </li><li>真空下でカバースリップとストアを乾かします。表面は、少なくとも月には安定なので、カバースリップの数十はバッチで行われ、必要に応じて使用することができます。 </li></ol>これらの材料は、事前に行われ、その後、各実験に使用する必要があります。すべての単一分子実験を開始するには、フローチャンバーを組み立てることから始めます。 3。フローチャンバーの準備実験は、官能カバー、両面テープ、石英スライドとチューブで構成されたシンプルなフローチャンバーを使用して実行されます。つのフローチャンバーは、それぞれの単一分子実験1,4のために準備されます。 材料：両面テープ、レーザーブレード、チューブ、クイックドライエポキシ用の穴を持つ石英スライド、官能カバースリップ（上記参照）、ストレプトアビジン溶液（PBS中の1 mg / mLの25μL）、チューブ、ブロッキング緩衝液（20mMトリスpH7.5、2mMのEDTA、50mMのNaCl、0.2 mg / mLのBSA、0.005％のTween - 20） <ol><li>後の手順については、気泡を除去するデシケーター中でブロッキングバッファーの20-25 mLを置くことによって始めます。 </li><li>表面上のPBSに希釈したストレプトアビジン液のPEG -官能化されたカバースリップと広がり125を取る。ストレプトアビジンは、表面のビオチンを結合させること、チャンバーの他の部分を準備しながら20分間インキュベートするために、このままにしておきます。 </li><li>ダブルサイドの部分をカットdは、テープ石英スライドのサイズを一致させる。フローチャンバーの概略をテープ（1 mg / ml）の上に描画できるように、鉛筆とテープ上のチューブの穴の位置をマークします。 </li><li>穴の周囲2mmの幅の長方形を作る。これは、流路として機能するので、チューブの入口と出口の周りにストレート側面を作り、部屋を出るようにしてください。必要に応じて、複数のチャネルまたは異なるサイズを使用することができます。 </li><li>チャンネルに無接着剤突出していることを確認してまっすぐ、きれいな削減を行って、描かれた輪郭に沿ってカット。 </li><li>徹底的に前のフローセルの構造から接着剤を除去するためアセトンまたはエタノールを用いて石英を清掃してください。 </li><li>チャンネルの概略の最高のアラインメントを見つける、粘着の片側を取り外し、慎重に石英スライドの上にテープを配置。入口と出口の穴がブロック解除を維持する必要があるとして、適切にテープを揃えるように注意してください。 </li><li>フローセルの入口と出口のためにチューブの長さをカット。それは、チューブがチャンバーの底部に対して平らに押ししないように約30 °の角度でチューブの端をカットするのに役立ちます。次のステップでフローセルに簡単に添付ファイルのためにそれらを中断するためのサポートのいくつかの並べ替えにチューブを置きます。 </li><li>水で十分ストレプトアビジンでコートしたカバースリップをリンスし、圧縮空気を用いて乾燥させる。片側のみに官能されていることを思い出してください。カバーを裏返しにしないように注意してください。テープの裏の反対側を外し、カバーグラスの上に石英スライドを配置。 </li><li>軽く接着剤に閉じ込められた空気を押し出すためにカバースリップを押してください。これは、流路に入る気泡を防ぐことができます。 </li><li>エポキシ樹脂とチャンバーの両側をシール。エポキシ樹脂と場所の石英とシールの穴にカットチューブを挿入します。これには数分間乾燥させる必要があります。 </li><li>一度乾燥、真空管のいずれかを使用して脱気ブロッキングバッファーの一部を引っ張って表面をブロッキングを開始。 21ゲージの針は0.76 mmのチューブの内部に完全に適合しています。気泡を除去するために数回はフラッシングを行ってください、とチャンバーは少なくとも半時間インキュベートすることができます。 </li></ol> 4。単一分子の複製実験 材料：準備されたフローチャンバー、SYTOXオレンジ、全反射顕微鏡、532nmのレーザー、CCDカメラ、画像取得ソフトウェアとコンピュータ、ローリングサークルDNA基質、複製タンパク質<ol><li>フローセルがブロックされた後、すべてが単一分子実験を開始する準備が整いました。 </li><li>フローセルを取ると、顕微鏡のステージ上に置きます。ステージのクリップのある場所でチャンバーを持ち、流路が直線y軸に沿って配置されていることを確認してください。 </li><li>より大きな直径のコネクタチューブや注射針を使用してシリンジポンプにフローセルの出口管を接続します。ブロッキング緩衝液で口を配置し、チューブ内の空気を除去するために注射器を後方に引いて。出口管の穏やかな映画は、フローセル内に閉じ込められた気泡をクリアするのに役立ちます。 </li><li>ブロッキング緩衝液1mLに25午後の株式DNA鋳型を希釈する。 DNAの良好な表面被覆率を可能にするために適度な流量でチャンバーに流入。 30分間0.025 mL / minではうまく動作します。これは、カバースリップまたはどのように多くの実験のために望まれているのバッチごとに表面にどのように多くのDNA分子に基づいて変化させることができる。 </li><li> DNAがになると、ブロッキング緩衝液を使用して余分なDNAを洗浄。すべての遊離DNAを取り除くために少なくとも200フローセルボリューム用洗浄する。 </li><li>レプリケーションバッファを脱始める。 E.用大腸菌の複製実験、37℃でこれを行う° C加熱されたフローチャンバーで泡のリスクを軽減する。 </li><li>レーザーとカメラの電源を入れます。冷却CCDは、それが使用できる前に温度に到達する必要があります。 </li><li> 37℃の実験を行う場合、上ヒーターの電源を入れます。目的は、フローセルに接触しているか、後でヒートシンクになることを確認してください。 </li><li>洗濯して脱気した後、反応を調製することができる。ミックスヌクレオチド、DTT、およびレプリケーションのバッファにSYTOX。その後、タンパク質を加え、穏やかに混合する。 </li><li>フローセルに反応混合物を流し込む。この流れの速度は、dsDNAを伸ばすのに十分である必要があります。 2 mm幅、100μmの背の高い流路の場合は0.04 mL / minではうまく動作します。 </li><li>混合チャンバーを入力し、イメージングを開始するための時間を確保します。良いヒントは、チャネルの側面に視野を移動し、接着剤に焦点を当てることです。これは、収束するための表面の近くにあるようにします。 </li><li>レーザパワー、顕微鏡のフォーカス、および全反射の角度を調整します。ステンドDNAの任意のphotocleavageを避けるために、低消費電力を維持する。 DNA複製の速度に応じて、数分間の手順1-5フレーム/秒で取得する。必要に応じて、より長いレプリケーション軌跡を得る以上の分子を見るために新しいフィールドに移動するには繰り返す。 </li><li>反応混合物がほとんど空になった後、それはSとより多くのバッファに流れるように良いアイデアです。ビューの他のフィールドを参照するYTOX。別の複製された分子の複数の画像を取ることはprocessivityの決定のための統計情報を提供します。 </li></ol> 5。代表的な結果積極的に複製する分子が容易に染色されたDNAの成長線として見られている。我々の実験では、M13基板25 PMを流れると、ビューの60倍、125μmの× 125μmのフィールド（図1）で100から1000までの分子を与える。 E.を使用して、レプリケーションの実験を行う37 ° C（詳細は資料を参照）で大腸菌 replisomeタンパク質は、視野当たり50から50を複製する分子が得られます。はるかに効率的に基板上に開始するT7 replisome、同等の濃度では、我々はフィールドの複製の分子の&gt; 70％を観測。これらの条件は、個々の分子が解決し、分析することが困難であることが非常に高く、製品の密度を得るため、T7の実験は、より低いタンパク質濃度で実行されます。 データ解析：率のデータを取得するには、単にDNA対時間のエンドポイントをプロットし、傾き（図2）を計算する。 processivityの場合は、DNAの全長を決定する。これらの数字の両方が塩基対に変換する必要があります。実験を行う前に、適切な倍率でカメラのピクセルサイズを知っている必要があります。塩基対の変換、良好な推定のために単に2.9 BP / NM、DNAの結晶長さに基づいて変換しています。しかしながら、層流が完全にDNAを伸ばししません、DNAの長さのキャリブレーションは、既知の長さのDNA、例えば、48502 bpのλDNAを取ってビオチン化オリゴとフローセルに装着し、で、そのSYTOX染色した長さを測定することによって実行する必要がありますので、複製の実験に使用する流量。塩基対/ピクセルの数を決定する複製率とprocessivitiesの正確な計算が可能になります。多数の画像や動画を取ることは速度とprocessivity分布（図2）1のプロットできるように、製品の分子の多数を提供します。 <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig1.jpg" alt="図1" /> 図1：（文献から1。）ローリングサークル複製アッセイの）漫画。 （SA、ストレプトアビジン）。リーディング鎖合成は、円と表面を結ぶ尾を拡張します。尾は、ラギング鎖のポリメラーゼによって二本鎖DNAに変換され、層流によって引き伸ばされている。 SYTOXオレンジと532nmの励起とビューのb）の例のフィールド。小さな蛍光スポットが繋留、非レプリケート基質である。製品の極端な長さと、フィールドごとの製品（各フローセル&gt; 5000そのようなフィールドを含む）の数が多いことに注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig2.jpg" alt="図2" /> 図2：T7（）とEからの典型的な複製の分子の（。文献から適応1）、b）のKymographs 大腸菌 （b）の実験。 C））とb）から分子のエンドポイントの軌跡は、時間に対してプロット。軌道は、レプリケーションの速度を得るために線形回帰が取り付けられています。示した例は99.4塩基対s -1とし、467.1 bpのs -1となります。 D）長さレプリケーション製品のディストリビューション、processivityを得るために、単一の指数関数的減衰に合う：25.3 ± 1.7 kbpの（T7）、85.3 ± 6.1 kbpの（ 大腸菌 ）。 e）は、単一の分子軌道の速度分布は、単一ガウス分布でフィット。手段：75.9 ± 4.8 BPの-1（T7）、535.5 ± 39 BP s -1の（ 大腸菌 ）。

<ol>
	<li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+single-molecule+observation+of+rolling-circle+DNA+replication.">Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 37, e27 (2009).</li><li>Tabor, S., Huber, H. E., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+thioredoxin+confers+processivity+on+the+DNA+polymerase+activity+of+the+gene+5+protein+of+bacteriophage+t7.">Escherichia coli thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the gene 5 protein of bacteriophage t7.</a> J Biol Chem. 262, 16212-16223 (1987).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+grafted+to+silicon+surfaces:+Grafting+density+and+protein+adsorption.">Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M., Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication.">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> DNA replication: Methods and protocols. 521, 397-410 (2009).</li><li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis.">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li><li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-562 (2006).</li></ol>

一つの重要な制御は、関心の複製蛋白質で、汚れ、SYTOXオレンジの効果を検討している。これを行う簡単な方法は、前述のようにフローセルではなくSYTOXの省略を使用したレプリケーションの実験を行うことです。反応混合物は、チャンバを通って流入した後、DNAを染色し、複製された分子の長さの分布を調べるためにSYTOXでバッファを追加します。また、標準的なバルクの反応は、レプリケーションの速度と効率上SYTOXの任意の効果を確認するために使用することができます。 ここで説明する実験は、単一の流路を使用しています。これは、マルチチャネルのフローチャンバーを作成またはPDMSまたは類似のマイクロ流体デバイスを用いて容易に変更することができます。チャネルの数を増やすと、大幅にタンパク質濃度、変異体、または阻害剤の分子のスクリーニングを容易にし、レプリケーションデータ収集の迅速性を向上させます。 前述のとおり、我々はE.を行います37 大腸菌の複製実験° C、自作アルミフローセルのヒーター、抵抗加熱要素（カートリッジヒーター）と可変電源を使用する。これにより、良好な温度安定性を与え、客観的なヒーターの購入を避けることができます。ヒーターを校正するために、我々は、単に、石英フローセルの上部の中央に穴をあけ流路に熱電対を挿入し、通常どおりバッファを流れた。増加する電圧でフローセルのバッファの温度を測定することは、正確な加熱が可能になります。

T7レプリケーション ：5mMジチオスレイトールと40mMのトリスpH7.5、50mMのグルタミン酸カリウム、10mMの塩化マグネシウム、100μg/ mlのBSA、、600μMのdNTP、300μMATP、300μMのCTP、および15nmのSYTOXオレンジは、直前に追加使用してください。 5nMのGP4（量体）、40 nMのポリメラーゼ（1:1 gp5をサポート：：チオレドキシン）、360 nmのgp2.5 1,5タンパク質として追加しました。 大腸菌の複製：50mMのHEPES pHは7.9、12mMの酢酸マグネシウム、80mMの塩化カリウム、10mMのジチオスレイトールとの100μg/ mLのBSA、40μMのdNTP、200μMrNTPs、および15nmのSYTOXオレンジは、使用直前に加える。タンパク質は、追加として：30 nMのDnaB（量体）、180 nMのDnaC（モノマー）、30 nMのαεθ、15nmのτ2γ1δδ&#39;χψまたはτ3δδ&#39;χψ、30nmのβ（ダイマー）、300 nMのDnaG、250 nMのSSB（四量体）、20nMのPRIA、40 nMのPriB、320nmのPriC、480nmのDNAT 1,6

visualizing single-molecule dna replication with fluorescence microscopy

我々は、単一分子レベルでのDNA複製を観察するためのシンプルな蛍光顕微鏡ベースのリアルタイム方法を説明します。環状、分岐したDNAテンプレートは、官能ガラスのカバースリップに結合し、複製タンパク質とヌクレオチド（図1）の導入後に広範囲に複製されます。成長している製品の二本鎖DNA（dsDNAが）層流で拡張し、インターカレート色素を用いて可視化される。リアルタイムで成長しているDNAの端の位置を測定することにより、レプリケーションの速度（図2）を正確に決定することができます。さらに、完成したDNA産物の長さは複製のprocessivityに報告します。この実験は非常に容易かつ迅速に実施し、合理的に高感度カメラでのみ蛍光顕微鏡を必要とすることができます。

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Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

このプロトコルは、リアルタイムで個々のreplisomesによってDNA複製を視覚化するためのシンプルな単一分子蛍光顕微鏡の技法を示しています。

蛍光顕微鏡による可視化単分子のDNAの複製

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

visualizing-single-molecule-dna-replication-with-fluorescence

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

22.4K ビュー.  Harvard Medical School. このプロトコルは、リアルタイムで個々のreplisomesによってDNA複製を視覚化するためのシンプルな単一分子蛍光顕微鏡の技法を示しています。

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Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

光活性化単一分子追跡を使用してライブ細菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を可視化する

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

免疫・感染学

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

制限エンドヌクレアーゼ媒介性DNA切断の1分子滞留時間解析

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

生化学

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

アッセイをストレッチ単一分子のDNAを用いて酵素の複製DNAの直接観察

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

生物学

完全再構成されたCdc45/MCM2-7/GINS(CMG)の運動のイメージング

Hybrid Ensemble and Single-molecule Assay to Image the Motion of Fully Reconstituted CMG

Eukaryotes have one replicative helicase known as CMG, which centrally organizes and drives the replisome, and leads the way at the front of replication forks. Obtaining a deep mechanistic understanding of the dynamics of CMG is critical to elucidating how cells achieve the enormous task of efficiently and accurately replicating their entire genome once per cell cycle. Single-molecule techniques are uniquely suited to quantify the dynamics of CMG due to their unparalleled temporal and spatial resolution. Nevertheless, single-molecule studies of CMG motion have thus far relied on pre-formed CMG purified from cells as a complex, which precludes the study of the steps leading up to its activation. Here, we describe a hybrid ensemble and single-molecule assay that allowed imaging at the single-molecule level of the motion of fluorescently labeled CMG after fully reconstituting its assembly and activation from 36 different purified S. cerevisiae polypeptides. This assay relies on the double functionalization of the ends of a linear DNA substrate with two orthogonal attachment moieties, and can be adapted to study similarly complex DNA-processing mechanisms at the single-molecule level.

著者スポットライト:真核生物のレプリソーム成分の運動ダイナミクスを1分子レベルで調査

We report a hybrid ensemble and single-molecule assay to directly image and quantify the motion of fluorescently labeled, fully reconstituted Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) helicase on linear DNA molecules held in place in an optical trap.

完全に再構成されたCMGの動きを画像化するためのハイブリッドアンサンブルおよび単一分子アッセイ

Eukaryotes have one replicative helicase known as CMG, which centrally organizes and drives the replisome, and leads the way at the front of replication ...

<meta charset="utf8"></head><body>ssDNA-RPAトラクト成長によるCMG媒介DNA巻き戻しの観察

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:真核生物のDNA複製のダイナミクスを解明する:単一分子の可視化による

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

CMGヘリカーゼによるDNA巻き戻しの1分子リアルタイム可視化

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not only ensure faithful genome duplication in the face of endogenous and exogenous DNA damage but also prevent genomic instability, a recognized causative factor in tumor development.
Here, we describe a simple and cost-effective fluorescence microscopy-based method to visualize DNA replication in the avian B-cell line DT40. This cell line provides a powerful tool to investigate protein function in vivo by reverse genetics in vertebrate cells1. DNA fiber fluorography in DT40 cells lacking a specific gene allows one to elucidate the function of this gene product in DNA replication and genome stability. Traditional methods to analyze replication fork dynamics in vertebrate cells rely on measuring the overall rate of DNA synthesis in a population of pulse-labeled cells. This is a quantitative approach and does not allow for qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis. In contrast, the rate of movement of active forks can be followed directly when using the DNA fiber technique2-4. In this approach, nascent DNA is labeled in vivo by incorporation of halogenated nucleotides (Fig 1A). Subsequently, individual fibers are stretched onto a microscope slide, and the labeled DNA replication tracts are stained with specific antibodies and visualized by fluorescence microscopy (Fig 1B). Initiation of replication as well as fork directionality is determined by the consecutive use of two differently modified analogues. Furthermore, the dual-labeling approach allows for quantitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase, i.e. replication structures such as ongoing and stalled forks, replication origin density as well as fork terminations. Finally, the experimental procedure can be accomplished within a day, and requires only general laboratory equipment and a fluorescence microscope.

DT40, a model vertebrate genetic system, provides a powerful tool to analyze protein function. Here we describe a simple method that allows qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase in DT40 cells at the single molecule level.

DNAの繊維技術を用いた脊椎動物のモデルシステムのDT40のDNA複製の可視化

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

蛍光顕微鏡による可視化単分子のDNAの複製

要約

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完全に再構成されたCMGの動きを画像化するためのハイブリッドアンサンブルおよび単一分子アッセイ

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CMGヘリカーゼによるDNA巻き戻しの1分子リアルタイム可視化

CMGヘリカーゼによるDNA巻き戻しの1分子リアルタイム可視化

CMGヘリカーゼによるDNA巻き戻しの1分子リアルタイム可視化

DNAの繊維技術を用いた脊椎動物のモデルシステムのDT40のDNA複製の可視化