Roche's Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.

1. La clonazione di wild-type tdTomato-tag e senza motore KIF5B Proteine <ol><li> Amplificazione del cDNA per la wild-type umana e proteine ​​KIF5B senza motore utilizzando i primers in Tabella 1, Taq DNA polimerasi (5 unità per 100 ml), dNTP mix (2 mM per ogni deossinucleotide) e il suo buffer 10X per 30 cicli. Ciascun ciclo consiste di una fase di denaturazione (95 ° C per 30 sec), una fase di ricottura (45 ° C per 30 sec) ed una fase di estensione (72 ° C per 3 min). </li><li> Estrarre il prodotto DNA amplificato a parità di volume di fenolo / cloroformio (1: 1). Nota: Il fenolo è infiammabile e può causare ustioni. Il cloroformio è pericoloso. Evitare il contatto diretto con loro e li usa sotto una cappa. In alternativa, i prodotti di PCR possono essere purificati mediante vari kit. <ol><li> Spin a 18.000 xg in una microcentrifuga a temperatura ambiente per 1 min. Trasferire la soluzione acquosa in una nuova provetta ed estrarre con un uguale volume di cloroformio. </li><li> rotazionea 18.000 xg in una microcentrifuga a temperatura ambiente per 0,5 min. Trasferire la soluzione acquosa in una nuova provetta. </li><li> Miscelare la soluzione acquosa con un decimo del volume di 3 M Na-acetato e due volumi di etanolo assoluto. </li><li> Spin a 18.000 xg in una microcentrifuga a temperatura ambiente per 5 min. Eliminare la soluzione acquosa. </li><li> Lavare il pellet di DNA con due volumi di etanolo al 75%. Scartare la soluzione acquosa e asciugare il pellet di DNA a temperatura ambiente per 5 min. Risospendere il pellet di DNA in 34 ml di acqua. </li></ol></li><li> Digest prodotti amplificati in un volume finale di 40 microlitri con enzimi di restrizione SalI (10 unità) e BamHI (10 unità) e 4 ml di tampone 10X loro a 37 ° C per due ore. Separare i prodotti digeriti in un gel di agarosio (1,0% a 100 V) contenente etidio bromuro (0,2 mcg / ml). Nota: il bromuro di etidio è un agente mutageno potente e può essere assorbito attraverso la pelle. Pertanto, è importante evitare il contatto diretto o indiretto wesimo bromuro di etidio. </li><li> Tagliare le bande corretti per la purificazione da colonne. Pesare il gel contenente il frammento di DNA. Sciogliere quindi nel buffer solubilizzazione (300 microlitri per 0,1 g) a 37 ° C per circa 20 min. </li><li> Aggiungere la soluzione portato ad una colonna e centrifuga in una microcentrifuga a temperatura ambiente per 5 sec. Gettare il flow-through. </li><li> Lavare la colonna con tampone di solubilizzazione 0,5 ml ripetendo il passo 1.5. Lavare la colonna di nuovo con 0,75 ml tampone di lavaggio ripetendo il passo 1.5. Gira la colonna per 2 minuti per sbarazzarsi del tampone di lavaggio residuo. </li><li> Eluire il frammento di DNA con 50 microlitri di acqua ripetendo il passaggio 1.5. Valutare la concentrazione del frammento di DNA eseguendo una aliquota di contro una scala dimensioni DNA in gel di agarosio (1,0% a 100 V) contenente etidio bromuro (0,2 mg / ml). </li><li> Legare i prodotti purificati (circa 100 ng) con il vettore ptdTomato-C1 17 (circa 100 ng) precedentemente digerito con °e stessa enzimi di restrizione in 10 microlitri utilizzando T4 DNA ligasi (2.000 unità) e 1 ml 10X tampone di ligasi a temperatura ambiente per 16 ore. Nota: La wild-type e mutanti senza motore contiene aminoacidi da 2 a 963 e 584-963, rispettivamente. In precedenza, una più grande mutante KIF5B senza motore è stato utilizzato per identificare la sua funzione 9. Una più piccola senza motore KIF5B mutante è stato utilizzato per gli attuali studi per aumentare i propri livelli di espressione. </li></ol> 2. La microscopia ad immunofluorescenza <ol><li> Per live-cell imaging di fluorescenza o indiretto con un ingrandimento pari o inferiore a 40X, semi di 0,2-0,3 milioni di cellule HeLa in 1 ml di mezzo completo [Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS)] in ciascun pozzetto di una sei pozzetti. Crescere a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Per gli studi di immunofluorescenza indiretta con ingrandimenti superiori 40X, lavare bicchieri coperchio (18 mm x 18 mm; 1,5 di spessore) in breve tempo etanolo assoluto e aria asciugarei pozzetti di una piastra ben sei, all&#39;interno di un armadio biosicurezza per evitare la contaminazione. <ol><li> Seme 0,2-0,3 milioni di cellule in 1 ml completano terreno DMEM in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti. </li></ol></li><li> Preparazione di Transfection Complex <ol><li> Il giorno successivo, all&#39;interno di un armadio biosicurezza, diluire 0,6 mg (totale) del plasmide di espressione per tdTomato-tag wild-type o KIF5B senza motore in presenza o assenza di un plasmide di espressione per una proteina cargo candidato (pTagCFP-c-MYC 5 ) con 0,1 ml di mezzo di transfezione in una provetta 1,6 ml microcentrifuga. Nota: Il vettore pTagCFP-c-Myc esprime la TagCFP-tag c-myc. </li><li> Aggiungere 1,8 microlitri di reagente trasfezione a 0,1 ml di mezzo transfezione in un altro tubo di 1,6 ml microcentrifuga. In genere, preparare un master mix di reagente trasfezione diluito sufficiente per 12 campioni. </li><li> Incubare per 5 minuti, a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere il diluita di 0,1 ml di reagente di trasfezione alle diluiti 0,1 ml DNA. Mix il contenuto invertendo i tubi. Spin le provette per 5 secondi in una microcentrifuga. </li><li> Incubare per 45 minuti, a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Lavaggio delle cellule <ol><li> Lavare le cellule seminate tre volte con tampone fosfato isotonico (PBS) durante il periodo di incubazione per la formazione del complesso trasfezione. </li><li> Sostituire il medium delle cellule seminate in ogni pozzetto con 0,8 ml di media trasfezione pre-riscaldato. Riportare le piastre per l&#39;incubatore a 37 ° C. </li></ol></li><li> Trasfezione delle cellule <ol><li> Dopo incubazione di 45 min, aggiungere 0,2 ml del complesso reattivo DNA / trasfezione (preparato al punto 2.3) goccia a goccia in ciascun pozzetto della piastra. </li><li> Rock the piastra 6 bene delicatamente per 5 secondi, prima di essere restituiti al incubatore a 37 ° C. </li><li> Dopo 6-8 ore, sostituire il mezzo con il mezzo DMEM completo. </li></ol></li><li> Per Live-cell imaging di fluorescenza 18 <ol><li> Dopo un ulteriore 16 ore di incubazione at 37 ° C, aggiungere la macchia intercalante del DNA Hoechst 33342 al mezzo ad una concentrazione finale di 1 mM. Nota: Hoechst 33342 è un colorante intercalante del DNA delle cellule permeabili che macchia i nuclei delle cellule. </li><li> Incubare le cellule trasfettate per 10 min in incubatore a 37 ° C prima di esaminarli per l&#39;espressione di proteine ​​fluorescenti mediante microscopia a fluorescenza utilizzando un obiettivo 40X. I set di filtri per DAPI, CFP, FITC e Cy3 sono (Ex350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (EX470 nm / Em525 nm) e (Ex545 nm / Em605 nm), rispettivamente. Nota: Se lo sfondo è elevato a causa di auto-fluorescenza del mezzo DMEM completo, viene utilizzato mezzo senza rosso fenolo. </li></ol></li></ol> 3. Per indiretti studi di immunofluorescenza <ol><li> Preparazione della soluzione Paraformaldeide <ol><li> Pesare in polvere paraformaldeide (4 g per 100 ml di PBS) e aggiungerlo al PBS. Nota: Paraformaldeide è un solido infiammabile e un potenziale Hazar cancrod. Si irrita gli occhi, le vie respiratorie e la pelle. Pertanto, è importante evitare il contatto con o inalazione di paraformaldeide. </li><li> Aggiungere NaOH alla soluzione (150 microlitri NaOH 10 N / 100 ml). </li><li> Mantenere la soluzione a 37 a 42 ° C per 2-3 ore con agitazione occasionale. </li><li> Regolare il pH a 7,0 mediante aggiunta di acido acetico glaciale alla soluzione (circa 75 microlitri / 100 ml) dopo la polvere paraformaldeide si scioglie. </li></ol></li><li> Proteine ​​bersaglio di colorazione <ol><li> Dopo ulteriore incubazione per 16 ore a 37 ° C, lavare le cellule trasfettate a temperatura ambiente una volta con PBS agitando la piastra sei pozzetti per 5 sec. </li><li> Fissare le cellule con 1 ml di appena preparata, 4% soluzione di paraformaldeide per pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Lavare le cellule con PBS tempo agitando per 5 secondi il piatto a sei bene. Scartare la soluzione. </li><li> Incubare le cellule con 1 ml di 0,1% Triton-X 100 (in PBS) a temperatura ambiente per 30 min. il detergent Triton-X 100 si permeabilize la membrana cellulare per consentire l&#39;accesso degli anticorpi ai loro bersagli intracellulari. </li><li> Lavare le cellule con PBS quattro volte agitando la piastra sei pozzetti per 5 secondi ogni volta. Scartare la soluzione dopo ogni lavaggio. </li><li> Incubare le cellule con 1 ml di anticorpi primari (c-MYC anticorpo di coniglio o dell&#39;anticorpo p53 del mouse; 0,1 mg / ml) in un FBS 10% in soluzione PBS a temperatura ambiente agitandola per 4 ore. </li><li> Lavare con PBS quattro volte agitando la piastra sei pozzetti per 5 secondi ogni volta. Scartare la soluzione dopo ogni lavaggio. </li><li> Incubare con 1 ml di anticorpi secondari colorante coniugato fluorescenti (Alexa Fluor 488 coniugato anti-coniglio o anticorpi IgG anti-topo; 0,5 mg / ml) in 10% FBS in PBS a temperatura ambiente al buio facendo oscillare per 2 ore. </li><li> Lavare con PBS quattro volte agitando la piastra sei pozzetti per 5 secondi ogni volta. Scartare la soluzione dopo ogni lavaggio. </li></ol></li><li> Colorazione nucleare e di montaggio <ol><li&gt; Incubare le cellule con 1 ml di DNA intercalante dye 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI; 0,5 mg / ml) in PBS a temperatura ambiente, al buio per 10 min. Passare al punto 3.4 quando non vetrini vengono utilizzati. Nota: DAPI è un colorante intercalante del DNA che macchia i nuclei delle cellule. </li><li> Applicare 10 ml di soluzione di montaggio su ogni vetrino da microscopio. Montare ciascun vetro di copertura sopra la soluzione di montaggio su un vetrino da microscopio. </li><li> Incubare a temperatura ambiente nella notte scura. </li><li> Sigillare i bordi dei vetrini con smalto. Mettere al buio all&#39;interno di una cappa aspirante durante la notte per rimuovere il chiodo fumi smalto. </li></ol></li><li> Microscopia a fluorescenza 19 <ol><li> Il giorno dopo, esaminare le cellule al microscopio a fluorescenza utilizzando un obiettivo 40X. I set di filtri per DAPI, CFP, FITC e Cy3 sono (Ex350 nm / Em460 nm), (Ex436 nm / Em480 nm), (EX470 nm / Em525 nm) e (Ex545 nm / Em605 nm), rispettivamente. </li></ol></li></ol>

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pubblicazione accesso libero e la produzione di questo articolo è pagato da Roche.

Il metodo descritto utilizza le proprietà del mutante KIF5B senza motore, che non ha la capacità di muoversi lungo i microtubuli, ma mantiene la capacità di formare dimeri con wild-type KIF5B e, quindi, consentire la proteina tetramerica per interagire con le stesse proteine ​​cargo come wild-type KIF5B. KIF5B senza motore, di conseguenza, agisce come un mutante dominante negativo e forme mislocalized aggrega con i suoi carichi. Questo metodo è dimostrato di identificare il Kinesin-1 cargo c-MYC (Figura 1) 5. In questo articolo, lo stesso mutante KIF5B senza motore è stato utilizzato per identificare p53 come un altro potenziale carico di Kinesin-1 (Figura 2). Questo dimostra che la metodologia sia praticabile individuare altri carichi di Kinesin-1. Inoltre, la specificità del mutante è fornito dalla mancanza di effetto del mutante della proteina controllo negativo c-Fos (Figura 3). In questo protocollo, il tdTomato-tag wild-tyPE o proteina KIF5B senza motore è coespressi con un&#39;altra proteina carico candidato proteina-tag fluorescente. In questo caso, live-cell microscopia a fluorescenza e di imaging vengono eseguite. La formazione degli aggregati può essere fatta dal time-lapse imaging. In alternativa, la proteina tdTomato-tag si esprime da solo e il candidato del carico di proteine ​​ai suoi livelli fisiologici viene visualizzato al microscopio immunofluorescenza indiretta utilizzando anticorpi specifici. Il tdTomato proteina fluorescente viene scelto per la sua luminosità e fotostabilità 17. Se lo sfondo è elevato a causa di auto-fluorescenza del mezzo DMEM completo, viene utilizzato mezzo senza rosso fenolo. Il KIF5B mutante senza motore forma dimeri con wild-type KIF5B stechiometricamente. Pertanto, è fondamentale per esprimere quantità sufficiente di senza motore mutante KIF5B per formare dimeri con wild-type controparte di inibire la sua funzione e per formare aggregati. Per risolvere questo problema, l&#39;ottimizzazione di esprESSIONE del mutante senza motore è essenziale. Si è ottenuto utilizzando un piccolo mutante senza motore contenente il dominio di dimerizzazione. Inoltre, l&#39;ottimizzazione del reagente di trasfezione appropriato e protocollo è anche necessario. La durata dell&#39;incubazione delle cellule HeLa con il reagente DNA / trasfezione è stata ottimizzata in cellule HeLa per l&#39;espressione di proteine ​​esogene e vitalità cellulare. La durata di incubazione può essere ottimizzato per altre linee cellulari. Per ingrandimenti tra 4X a 40X, non sono necessari gli occhiali di copertura. Le celle possono essere esaminate direttamente nei pozzetti. Pertanto, in questo caso, il protocollo è economico e conveniente. Per ingrandimenti superiori 40X, le cellule sono coltivate su vetrini nei pozzi e, dopo la colorazione, sono montati su vetrini da microscopio per l&#39;esame al obiettivi ad immersione in olio. Osservazione aggregati della proteina KIF5B senza motore è limitata dalla dimensione del citoplasma. È facile rilevare laaggregati in molte cellule di mammifero. Tuttavia, è relativamente difficile osservare aggregati nelle cellule neuronali quando il volume del citoplasma è piccola attorno ai nuclei e neuriti. Il protocollo viene utilizzato per mostrare l&#39;associazione tra KIF5B ei suoi carichi oltre al in vivo lievito doppio ibrido e saggi di pull-down biochimici 13-16. Tutti questi test determinare l&#39;associazione in diverse condizioni fisiche e loro risultati possono completarsi a vicenda. Inoltre, il vantaggio di questo test fluorescenza nel altri test è che può mostrare la regolazione della localizzazione subcellulare dei carichi da KIF5B (Figure 1 e 2). Il protocollo non è limitato a KIF5B e può essere utilizzato per identificare carichi di altre proteine ​​motrici, come alcuni altri motori kinesin 3 e alcuni dei motori miosina 23,24 utilizzati nel trasporto intracellulare di carichi 3. Queste proteine ​​motore contengono anche i domini a motore per il movimento lungo i microtubuli per motori kinesin e microfilamenti per motori miosina, e segmenti a doppia spiralizzazione per oligomerizzazione. La maggior parte di essi sotto forma omodimeri 3,23. Pertanto, una strategia simile può essere applicata a loro creando loro senza motore mutanti dominanti negativi per identificare i loro carichi.

Kinesin-1 è una proteina motore che media il trasporto anterogrado dei suoi carichi 1,2. Si tratta di un heterotetramer delle due subunità della catena Kinesin Luce 1 (KLC1) e due subunità di catene pesanti (Kinesin KHCs). KIF5B 1, un KHC, contiene un dominio motore al suo N-terminale, che idrolizza ATP e converte l&#39;energia chimica in energia meccanica per il movimento lungo i microtubuli. La regione C-terminale contiene il dominio di dimerizzazione che interagisce con KLC1, che associa con carichi. Kinesin-1 trasporta carichi, come vescicole, organelli e mRNA 3,4. Recentemente, KIF5B stato dimostrato per il trasporto del fattore di trascrizione nucleare c-MYC degradazione proteosomal nel citoplasma 5. Tre metodologie (inibitore chimico, siRNA / shRNA e dominante mutante negativo) sono stati usati per inibire Kinesin-1 funzione. Tutti indotto aggregazione di c-MYC nel citoplasma. Per l&#39;ultima metodologia, c-Myc è stato influenzato solo dal negat dominanteive mutante di KIF5B, ma non da quella di un altro relativo motore di proteine ​​KIF5A, suggerendo che il mutante non esercitare effetti generali sui componenti intracellulari (come microtubuli interruzione) o sull&#39;aggregazione proteica. Il mutante dominante negativo di KIF5B, inoltre, non ha influenzato un altro fattore di trascrizione, suggerendo che non esercita effetti generali sui fattori di trascrizione. Piuttosto, suggerisce che il mutante dominante negativo esercita effetti specifici sui suoi carichi. L&#39;uso di mutanti dominanti negativi è comune nel campo delle proteine ​​motrici. Simili mutanti prive di motore di kinesins e myosins sono stati utilizzati in precedenza. Essi sono stati utilizzati principalmente per dimostrare gli effetti dei mutanti sulle localizzazioni subcellulari dei loro carichi o sulle funzioni cellulari 6-12. Meno enfasi è stata posta sul rapporto spaziale tra i mutanti e i carichi da esse interessati. Tuttavia, in alcuni incidenze, sono stati osservati i mutanti di co-localizza con la cargos 6,10. L&#39;interazione tra KIF5B e le sue proteine ​​associate è stato già confermato dal lievito in vivo test doppio ibrido e saggi di pull-down biochimici come co-immunoprecipitazione e in saggi di pull-down in vitro 13-16. In questo articolo, un ulteriore metodo che utilizza la microscopia a fluorescenza visivo è descritto per identificare le proteine ​​cargo KIF5B. Il metodo fa uso di un mutante KIF5B senza motore che agisce come un mutante dominante negativo. Si aggrega nel citoplasma e induce l&#39;aggregazione dei suoi carichi. Il tagging delle wild-type e mutante senza motore KIF5B con la proteina fluorescente tdTomato 17 consente la loro visualizzazione al microscopio a fluorescenza. Le proteine ​​KIF5B marcati possono essere co-espresso con una proteina candidato fusa ad una proteina fluorescente differente con proprietà spettrali opportunamente separate dal tag KIF5B. Le proteine ​​taggati sono osservati direttamente in cellule viveal microscopio a fluorescenza. Induzione di aggregazione della proteina candidato da parte del mutante KIF5B senza motore confermerà che la proteina candidato è un carico in vivo di KIF5B. Inoltre, le proteine ​​KIF5B tdTomato-tag possono essere espressi solo nelle cellule per studiare gli effetti sulle proteine ​​endogene cargo. Successivamente, immunofluorescenza è condotto in cui le cellule transfettate vengono fissate e colorate con un anticorpo specifico contro la proteina endogena candidato, seguito da un anticorpo secondario coniugato adeguato con un colorante fluorescente. In questo caso, la proteina endogena candidato al livello fisiologico è studiato. Simili mutanti prive di motore delle altre proteine ​​motrici possono essere preparati per identificare i loro carichi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="620">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">absolute ethanol (200 proof)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:113px;">BP2818</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM-I (transfection medium)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td align="right">51985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">formaldehyde, para</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-X100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td align="right">10342020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix)</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">12111424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink Quick Gel Extraction kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K210012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BamHI</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>R0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SalI</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>R0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">17898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">c-MYC rabbit antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td align="right">5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p53 mouse antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluorescent microscope&#160;</td>
			<td colspan="2">Olympus IX71_Fluoview</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">computer software for imaging</td>
			<td>&#160;cellSens&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of kinesin-1 cargos using fluorescence microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

Esogenamente espresso wild-type KIF5B apparso omogeneamente nel citoplasma, mentre c-MYC apparso prevalentemente nel nucleo (Figura 1A). Tuttavia, il KIF5B mutante privo di motore formata aggregati nel citoplasma (Figura 1A). Aggregazione del KIF5B senza motore ha indotto l&#39;aggregazione di c-myc. La percentuale di cellule che esprimono aggregato TagCFP-tag c-myc nelle cellule che esprimono wild-type KIF5B è stata bassa. Tuttavia, è stato significativamente più alto quando il KIF5B senza motore è stato co-espressa (Figura 1A). Il osservato co-localizzazione KIF5B mutante c-MYC (Figura 1) suggerisce che KIF5B regola la localizzazione subcellulare di c-myc e c-MYC è un carico di Kinesin-1. I controlli negativi in cui i costrutti sono stati espressi solo sono inclusi nel riquadro inferiore della figura 1A. I risultati mostrano che non vi era alcuna significativa sanguinare-through della fluorescenza emission. Il KIF5B senza motore anche indotto aggregazione della endogena c-MYC (Figura 1B) e il fattore di trascrizione p53 (Figura 2), indicando che c-Myc e p53 sono entrambi i carichi di Kinesin-1 e KIF5B regola la localizzazione subcellulare di entrambe le proteine ​​endogene. Insieme con i risultati che la Kinesin-1 inibitore rosa bengala lattone (RBL) formazione 20 induce di specie ad alto peso molecolare sia per c-myc e p53 5, p53 è probabile un carico di Kinesin-1. È interessante notare che il fattore di trascrizione nucleare p53, come c-MYC, viene esportato anche dal nucleo al citoplasma per proteasoma degradazione 21,22. Il movimento dei fattori di trascrizione da KIF5B sembra essere specifico perché l&#39;espressione del mutante KIF5B senza motore non ha influenzato la localizzazione subcellulare c-Fos o farla aggregare (Figura 3). I dati sopra riportati dimostrano che il metod impiegato in questa pubblicazione consente l&#39;identificazione ad alta specificità della Kinesin-1 carichi. Una strategia simile può essere applicata ad altre proteine ​​motrici pure. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig1.jpg" /> Figura 1: Espressione del mutante KIF5B senza motore induce c-Myc aggregazione nel citoplasma (A) cellule HeLa sono state trasfettate con tdTomato-tag wild-type (WT) KIF5B (rosso) e TagCFP-tag c-Myc (blu).. tdTomato-tag WT KIF5B apparso principalmente nel citoplasma, mentre TagCFP-etichettato c-MYC apparso prevalentemente nel nucleo. Tuttavia, il mutante KIF5B senza motore tdTomato-tag (rosso) formata aggregati filamentosi o puntiformi nel citoplasma. Espressione dei KIF5B senza motore indotta l&#39;aggregazione di c-MYC. Il KIF5B mutante e c-Myc co-localizzate insieme (rosa). Sono mostrati Percentuali di cellule (%) indicanti aggregati di CFP-c-MYC (%). I risultati sono mostrati comemedia ± SD (n = 3). I controlli negativi con l&#39;espressione di proteine ​​KIF5B tdTomato-tag o TagCFP-tag c-Myc con vettori vuoti (V) sono mostrati nel pannello inferiore. (B) Risultati simili sono stati ottenuti con il endogena c-MYC (verde) quando sono stati espressi tdTomato-tag WT o proteine ​​KIF5B senza motore (rossa). Il KIF5B mutante senza motore tdTomato-tag formata aggregati nel citoplasma e l&#39;aggregazione del endogena c-Myc indotta. Entrambi i tipi di aggregati co-localizzate insieme nel citoplasma (arancione). I nuclei sono stati colorati con il colorante Hoechst 33342 o DAPI. Barra di scala; 20 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53632/53632fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig2.jpg" /> Figura 2: Espressione del mutante KIF5B senza motore produce aggregazione p53 endogena in tha citoplasma. Nelle cellule HeLa, esogeno tdTomato-tag wild-type (WT) KIF5B (rosso) apparso principalmente nel citoplasma, mentre il p53 endogena (verde) apparso principalmente nel nucleo. Al contrario, il mutante KIF5B senza motore tdTomato-tag (rosso) aggregati nel citoplasma formata. Espressione dei KIF5B senza motore indotta l&#39;aggregazione di p53, causando la co-localizzazione KIF5B e p53 nel citoplasma (giallo). L&#39;esperimento è stato eseguito per tre volte. I nuclei sono stati colorati con il DAPI colorante. Barra di scala; 20 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53632/53632fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig3.jpg" /> Figura 3:. L&#39;espressione del mutante KIF5B senza motore non induce l&#39;aggregazione di c-Fos nel citoplasma tdTomato-tagged wild-type (WT) KIF5B (rosso) è apparsoprincipalmente nel citoplasma delle cellule HeLa, mentre EGFP-c-Fos (verde) apparso principalmente nel nucleo. Al contrario, il mutante KIF5B senza motore tdTomato-tag (rosso) aggregati nel citoplasma formata. L&#39;espressione della KIF5B senza motore non ha indotto l&#39;aggregazione di c-Fos. L&#39;esperimento è stato eseguito quattro volte. I nuclei delle cellule sono state colorate con DAPI colorante. Barra di scala; 20 micron. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53632/53632fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> primer reverse comune </td><td> 5&#39;-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 &#39; </td></tr><tr><td> wild-type KIF5B primer forward </td><td> 5&#39;-AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT-3 &#39; </td></tr><tr><td> KIF5B senza motore primer forward </td><td> 5&#39;-AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC-3 &#39; </td></tr></tbody></table>Tabella 1: sequenze primer per la clonazione del wild-type e le proteine ​​KIF5B senza motore.

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Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Qui, un protocollo è presentato per identificare Kinesin-1 carichi. Un mutante senza motore della Kinesin-1 catena pesante (KIF5B) aggrega nel citoplasma e induce l&#39;aggregazione dei suoi carichi. Entrambi gli aggregati vengono rilevate al microscopio a fluorescenza. Una strategia simile può essere impiegato per identificare carichi di altre proteine ​​motrici.

Identificazione Kinesin-1 Cargos Utilizzando la microscopia a fluorescenza

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

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Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

7.8K Views.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  Qui, un protocollo è presentato per identificare Kinesin-1 carichi. Un mutante senza motore della Kinesin-1 catena pesante (KIF5B) aggrega nel citoplasma e induce l'aggregazione dei suoi carichi. Entrambi gli aggregati vengono rilevate al microscopio a fluorescenza. Una strategia simile può essere impiegato per identificare carichi di altre proteine ​​motrici. 

Video: Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizzazione singola complessi molecolari In Vivo Utilizzo avanzato microscopia a fluorescenza

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

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Biologia

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualizzazione singola molecola di DNA replica con microscopia a fluorescenza

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse imaging di mitosi dopo la trasfezione di siRNA

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Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

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Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

Quantitativa vivo cellulare-microscopio a fluorescenza Analisi di lievito Fission

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

Microscopia a fluorescenza-Screening e sequenziamento di prossima generazione: Strumenti utili per l&#39;identificazione di geni coinvolti in organelli Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

Analisi quantitativa di autofagia usando 3D avanzato microscopia a fluorescenza

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Analisi rapida ed esplorazione di microscopia a fluorescenza Immagini

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

Analisi di autofagia in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Utilizzando Starvation Pads in combinazione con microscopia a fluorescenza

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizzazione Frequenza Stromule con microscopia a fluorescenza

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...