Roche's Publication Grant covered the Free Access publication and production of this article. The author also thanks E. Premkumar Reddy, Richard V. Mettus, Stephen C. Cosenza, Sau Ying Yip and Sol D. Gloria for their support and critical reading of the manuscript.

1. الاستنساخ من نوع البرية الموسومة tdTomato وبلا محركات KIF5B البروتينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تضخيم cDNAs لالبرية من نوع البشري والبروتينات KIF5B بلا محركات باستخدام بادئات في الجدول رقم 1، طق الحمض النووي بوليميريز (5 وحدات لمدة 100 ميكرولتر)، مزيج dNTP (2 مم لكل deoxynucleotide) وعازلة 10X لها لمدة 30 دورات. وتتكون كل دورة من خطوة تمسخ (95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية)، خطوة الصلب (45 درجة مئوية لمدة 30 ثانية) وخطوة التمديد (72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج المنتج تضخيم الحمض النووي مع حجم مساو من الفينول / الكلوروفورم (1: 1). ملاحظة: الفينول هو قابل للاشتعال ويمكن أن يسبب حروقا. الكلوروفورم خطرة. تجنب الاتصال المباشر معهم واستخدامها تحت غطاء الدخان الكيميائية. بدلا من ذلك، منتجات PCR يمكن تنقيته من قبل مختلف مجموعات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 18000 x ج في microcentrifuge في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة. نقل محلول مائي لأنبوب جديد واستخراج مع حجم مساو من كلوروفورم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غزلفي 18000 x ج في microcentrifuge في درجة حرارة الغرفة لمدة 0.5 دقيقة. نقل محلول مائي لأنبوب جديد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج من محلول مائي مع المجلد العاشر واحدة من 3 M نا-خلات ومجلدين من الايثانول المطلق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في 18000 x ج في microcentrifuge في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. تجاهل محلول مائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل بيليه الحمض النووي مع مجلدين من 75٪ من الإيثانول. تجاهل محلول مائي والهواء الجاف بيليه الحمض النووي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. Resuspend بيليه في الحمض النووي في 34 ميكرولتر المياه. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هضم منتجات تضخيم في الحجم النهائي من 40 ميكرولتر مع تقييد الانزيمات سالي (10 وحدة) وBamHI (10 وحدة) و 4 ميكرولتر من العازلة 10X بهم عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة. حل المنتجات هضمها في agarose هلام (1.0٪ عند 100 V) التي تحتوي على إيثيديوم بروميد (0.2 ميكروغرام / مل). ملاحظة: بروميد إيثيديوم هو المغير قوية ويمكن استيعابها من خلال الجلد. وبالتالي، فمن المهم تجنب الاتصال المباشر أو غير المباشر ثإيث إيثيديوم بروميد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع العصابات الصحيحة لتنقية قبل الأعمدة. تزن agarose هلام يحتوي على جزء الحمض النووي. ثم حله في المخزن المؤقت الإذابة (300 ميكرولتر عن 0.1 غ) عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة محلول أدى إلى عمود وتدور في microcentrifuge في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 ثوان. تجاهل التدفق من خلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل العمود مع العازلة الإذابة 0.5 مل من تكرار الخطوة 1.5. غسل العمود مرة أخرى مع 0.75 مل العازلة غسل بتكرار الخطوة 1.5. تدور العمود لمدة 2 دقيقة للتخلص من غسل العازلة المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أزل جزء الحمض النووي مع 50 ميكرولتر المياه بتكرار الخطوة 1.5. تقدير تركيز جزء الحمض النووي عن طريق تشغيل قسامة منه ضد السلم حجم الحمض النووي في agarose هلام (1.0٪ عند 100 V) التي تحتوي على إيثيديوم بروميد (0.2 ميكروغرام / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ligate منتجات النقاء (حوالي 100 نانوغرام) مع ناقل ptdTomato-C1 17 (حوالي 100 نانوغرام) يهضم سابقا مع الالانزيمات ه التقييد نفسه في 10 ميكرولتر باستخدام T4 DNA يغاز (2000 وحدة) و 1 ميكرولتر العازلة 10X ربط في درجة حرارة الغرفة لمدة 16 ساعة. ملاحظة: من النوع البري ومتحولة بلا محركات يحتوي على الأحماض الأمينية 2-963 و584-963، على التوالي. سابقا، كانت تستخدم أكبر متحولة KIF5B بلا محركات لتحديد وظيفتها 9. تم استخدام KIF5B متحولة بلا محركات أصغر للدراسات الحالية لزيادة مستويات التعبير عنها. </li></ol> 2. المناعي المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحية خلية أو التصوير مضان غير المباشرة مع التكبير عند أو أقل من 40X، البذور 0،2-0٬300٬000 خلايا هيلا في 1 مل المتوسطة كاملة [Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)] في كل بئر من ل ستة جيدا لوحة. ينمو بمعدل 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للدراسات غير المباشرة المناعي مع تكبير 40X فوق، وغسل نظارات الغطاء (18 ملم × 18 ملم؛ 1.5 سمك) في فترة وجيزة الايثانول المطلق والهواء الجاف لهم فيآبار لوحة ستة جيدا، داخل مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية لتجنب التلوث. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البذور 0،2-0٬300٬000 الخلايا في 1 مل يكمل DMEM المتوسطة في كل بئر من لوحة ستة جيدا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مجمع ترنسفكأيشن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية، تمييع 0.6 ميكروغرام (الكل) من البلازميد التعبير عن الموسومة tdTomato من نوع البرية أو KIF5B بلا محركات في وجود أو عدم وجود التعبير البلازميد لبروتين مرشح البضائع (pTagCFP-ج-MYC 5 ) مع 0.1 مل المتوسطة ترنسفكأيشن في أنبوب 1.6 مل microcentrifuge ل. ملاحظة: ناقلات pTagCFP-ج-MYC تعبر عن الموسومة TagCFP-ج-MYC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1.8 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن إلى 0.1 مل ترنسفكأيشن المتوسطة في أنبوب 1.6 مل microcentrifuge لآخر. عادة، وإعداد مزيج الرئيسي المخفف كاشف ترنسفكأيشن يكفي لمدة 12 عينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 5 دقائق، في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة المخفف 0.1 مل كاشف ترنسفكأيشن إلى 0.1 مل مخففة السلطات الوطنية المعينة. ميلس محتويات كتبها قلب الأنابيب. تدور الأنابيب لمدة 5 ثانية في microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 45 دقيقة، في درجة حرارة الغرفة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا المصنفة ثلاث مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) خلال فترة الحضانة لتشكيل مجمع ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المتوسطة من الخلايا المصنفة في كل جيدا مع 0.8 مل قبل تحسنت ترنسفكأيشن المتوسطة. العودة لوحات لالحاضنة عند 37 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترنسفكأيشن من الخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مرور فترة الحضانة من 45 دقيقة، إضافة 0.2 مل من مجمع كاشف الحمض النووي / ترنسفكأيشن (المعد في الخطوة 2.3) قطرة قطرة إلى كل بئر من لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موسيقى الروك لوحة 6 جيدا برفق لمدة 5 ثوان، قبل أن يتم إعادتها إلى حاضنة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 6-8 ساعة، استبدال المتوسطة مع المتوسط ​​DMEM كاملة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لخلية حية الإسفار التصوير 18 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 16 ساعة إضافية من الحضانة لر 37 درجة مئوية، إضافة صمة عار الحمض النووي الإقحام هويشت 33342 إلى وسيلة لتركيز النهائي من 1 ميكرومتر. ملاحظة: هويشت 33342 هو خلايا قابلة للاختراق، صبغ الحمض النووي الإقحام أن البقع نواة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان خلايا transfected لمدة 10 دقيقة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية قبل دراستها للتعبير عن البروتينات الفلورية بواسطة المجهر الفلورسنت باستخدام الهدف 40X. مجموعات تصفية دابي، CFP، FITC وو Cy3 هي (Ex350 نانومتر / Em460 نانومتر)، (Ex436 نانومتر / Em480 نانومتر)، (Ex470 نانومتر / Em525 نانومتر) و (Ex545 نانومتر / Em605 نانومتر)، على التوالي. ملاحظة: إذا كانت خلفية عالية نظرا لصناعة السيارات في مضان من المتوسط ​​DMEM كاملة، يتم استخدام وسيط وبدون أحمر الفينول. </li></ol></li></ol> 3. للدراسات المناعي غير المباشرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد امتصاص العرق الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن مسحوق امتصاص العرق (4 غ لكل 100 مل PBS) وإضافته إلى برنامج تلفزيوني. ملاحظة: لامتصاص العرق هو قابل للاشتعال الصلبة وهزار سرطان محتملد. يهيج العينين والجهاز التنفسي والجلد. وبالتالي، فمن المهم تجنب الاتصال مع أو استنشاق امتصاص العرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة هيدروكسيد الصوديوم إلى محلول (150 ميكرولتر 10 N هيدروكسيد الصوديوم / 100 مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إبقاء الحل في 37-42 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعة مع الهز في بعض الأحيان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.0 بإضافة حمض الخليك الجليدي إلى حل (حوالي 75 ميكرولتر / 100 مل) بعد مسحوق امتصاص العرق يذوب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الهدف البروتينات تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وبعد مزيد من الحضانة لمدة 16 ساعة على 37 درجة مئوية، وغسل الخلايا transfected في درجة حرارة الغرفة مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني من قبل يحوم لوحة ستة جيدا لمدة 5 ثوان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا مع 1 مل من الطازجة، و 4٪ حل لامتصاص العرق لكل بئر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة من قبل يحوم لمدة 5 ثانية لوحة ستة جيدا. تجاهل الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا مع 1 مل من 0.1٪ تريتون X-100 (في برنامج تلفزيوني) في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. وديتergent تريتون-X 100 سوف permeabilize غشاء الخلية للسماح بالوصول من الأجسام المضادة لأهدافها داخل الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني أربع مرات من قبل يحوم لوحة ستة جيدا لمدة 5 ثانية في كل مرة. تجاهل الحل بعد كل غسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا مع 1 مل من الأجسام المضادة الأولية (ج MYC أرنب الأجسام المضادة أو الأجسام المضادة البروتين p53 الماوس؛ 0.1 ميكروغرام / مل) في FBS 10٪ في حل برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة قبل هزاز لمدة 4 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع برنامج تلفزيوني أربع مرات من قبل يحوم لوحة ستة جيدا لمدة 5 ثانية في كل مرة. تجاهل الحل بعد كل غسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع 1 مل من الأجسام المضادة الثانوية صبغ مترافق فلوري (اليكسا فلور 488 مترافق المضادة للأرنب أو المضادة للماوس مفتش الأضداد؛ 0.5 ميكروغرام / مل) في 10٪ FBS في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة في الظلام بواسطة هزاز لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مع برنامج تلفزيوني أربع مرات من قبل يحوم لوحة ستة جيدا لمدة 5 ثانية في كل مرة. تجاهل الحل بعد كل غسل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تلطيخ النووية وتركيب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><lط&gt; احتضان الخلايا مع 1 مل من الحمض النووي الإقحام صبغ 4 &quot;، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي؛ 0.5 ميكروغرام / مل) في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة، في الظلام لمدة 10 دقيقة. انتقل إلى الخطوة 3.4 عندما يتم استخدام أي نظارات غطاء. ملاحظة: دابي هو الحمض النووي الإقحام الصبغة التي البقع نواة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 10 ميكرولتر من محلول متزايدة على كل شريحة المجهر. جبل كل غطاء زجاجي على حل متزايدة على شريحة المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحضن في درجة حرارة الغرفة في ليلة وضحاها الظلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم حواف من النظارات غطاء بطلاء الأظافر. ضع في الظلام داخل غطاء الدخان بين عشية وضحاها لإزالة مسمار البولندية الأبخرة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مضان المجهر 19 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفي اليوم التالي، فحص الخلايا بواسطة المجهر الفلورسنت باستخدام الهدف 40X. مجموعات تصفية دابي، CFP، FITC وو Cy3 هي (Ex350 نانومتر / Em460 نانومتر)، (Ex436 نانومتر / Em480 نانومتر)، (Ex470 نانومتر / Em525 نانومتر) و (Ex545 نانومتر / Em605 نانومتر)، على التوالي. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+motors+in+neurons:+transport+mechanisms+and+roles+in+brain+function,+development,+and+disease.">Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease.</a> Neuron. 68, 610-638 (2010).</li><li>Yu, Y., Feng, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+kinesin+family+proteins+in+tumorigenesis+and+progression:+potential+biomarkers+and+molecular+targets+for+cancer+therapy.">The role of kinesin family proteins in tumorigenesis and progression: potential biomarkers and molecular targets for cancer therapy.</a> Cancer. 116, 5150-5160 (2010).</li><li>Verhey, K. J., Hammond, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+control:+regulation+of+kinesin+motors.">Traffic control: regulation of kinesin motors.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 765-777 (2009).</li><li>Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+superfamily+motor+proteins+and+intracellular+transport.">Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 682-696 (2009).</li><li>Lee, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+c-MYC+by+Kinesin-1+for+proteasomal+degradation+in+the+cytoplasm.">Transport of c-MYC by Kinesin-1 for proteasomal degradation in the cytoplasm.</a> Biochim Biophys Acta. 1843, 2027-2036 (2014).</li><li>Bittins, C. M., Eichler, T. W., Hammer, J. A., Gerdes, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dominant-negative+myosin+Va+impairs+retrograde+but+not+anterograde+axonal+transport+of+large+dense+core+vesicles.">Dominant-negative myosin Va impairs retrograde but not anterograde axonal transport of large dense core vesicles.</a> Cell Mol Neurobiol. 30, 369-379 (2010).</li><li>Kimura, T., Watanabe, H., Iwamatsu, A., Kaibuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubulin+and+CRMP-2+complex+is+transported+via+Kinesin-1.">Tubulin and CRMP-2 complex is transported via Kinesin-1.</a> J Neurochem. 93, 1371-1382 (2005).</li><li>Lindsay, A. J., McCaffrey, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Va+is+required+for+the+transport+of+fragile+X+mental+retardation+protein+(FMRP)+granules.">Myosin Va is required for the transport of fragile X mental retardation protein (FMRP) granules.</a> Biol Cell. 106, 57-71 (2014).</li><li>Rivera, J., Chu, P. J., Lewis, T. L., Arnold, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+Kif5B+in+axonal+localization+of+Kv1+K(+)+channels.">The role of Kif5B in axonal localization of Kv1 K(+) channels.</a> Eur J Neurosci. 25, 136-146 (2007).</li><li>Roland, J. T., Kenworthy, A. K., Peranen, J., Caplan, S., Goldenring, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Vb+interacts+with+Rab8a+on+a+tubular+network+containing+EHD1+and+EHD3.">Myosin Vb interacts with Rab8a on a tubular network containing EHD1 and EHD3.</a> Mol Biol Cell. 18, 2828-2837 (2007).</li><li>Uchida, A., Alami, N. H., Brown, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tight+functional+coupling+of+kinesin-1A+and+dynein+motors+in+the+bidirectional+transport+of+neurofilaments.">Tight functional coupling of kinesin-1A and dynein motors in the bidirectional transport of neurofilaments.</a> Mol Biol Cell. 20, 4997-5006 (2009).</li><li>Zadeh, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kif5b+is+an+essential+forward+trafficking+motor+for+the+Kv1.5+cardiac+potassium+channel.">Kif5b is an essential forward trafficking motor for the Kv1.5 cardiac potassium channel.</a> J Physiol. 587, 4565-4574 (2009).</li><li>Su, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KIF5B+promotes+the+forward+transport+and+axonal+function+of+the+voltage-gated+sodium+channel+Nav1.8.">KIF5B promotes the forward transport and axonal function of the voltage-gated sodium channel Nav1.8.</a> J Neurosci. 33, 17884-17896 (2013).</li><li>Lalioti, V. S., Vergarajauregui, S., Tsuchiya, Y., Hernandez-Tiedra, S., Sandoval, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Daxx+functions+as+a+scaffold+of+a+protein+assembly+constituted+by+GLUT4,+JNK1+and+KIF5B.">Daxx functions as a scaffold of a protein assembly constituted by GLUT4, JNK1 and KIF5B.</a> . J Cell Physiol. 218, 416-426 (2009).</li><li>Cho, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+the+kinesin-binding+domain+of+RanBP2+to+KIF5B+and+KIF5C+determines+mitochondria+localization+and+function.">Association of the kinesin-binding domain of RanBP2 to KIF5B and KIF5C determines mitochondria localization and function.</a> Traffic. 8, 1722-1735 (2007).</li><li>Diefenbach, R. J., Diefenbach, E., Douglas, M. W., Cunningham, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+receptor,+p180,+interacts+with+kinesin+heavy+chain,+KIF5B.">The ribosome receptor, p180, interacts with kinesin heavy chain, KIF5B.</a> Biochem Biophys Res Commun. 319, 987-992 (2004).</li><li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+monomeric+red,+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein.">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+fluorescence+imaging.">Live-cell fluorescence imaging.</a> Methods Cell Biol. 114, 125-150 (2013).</li><li>Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy.">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014, (2014).</li><li>Hopkins, S. C., Vale, R. D., Kuntz, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitors+of+kinesin+activity+from+structure-based+computer+screening.">Inhibitors of kinesin activity from structure-based computer screening.</a> Biochemistry. 39, 2805-2814 (2000).</li><li>Zhang, Y., Xiong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+p53+ubiquitination+and+nuclear+export+by+MDM2+and+ARF.">Control of p53 ubiquitination and nuclear export by MDM2 and ARF.</a> Cell Growth Differ. 12, 175-186 (2001).</li><li>Michael, D., Oren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p53-Mdm2+module+and+the+ubiquitin+system.">The p53-Mdm2 module and the ubiquitin system.</a> Semin Cancer Biol. 13, 49-58 (2003).</li><li>Kneussel, M., Wagner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+motors+at+neuronal+synapses:+drivers+of+membrane+transport+and+actin+dynamics.">Myosin motors at neuronal synapses: drivers of membrane transport and actin dynamics.</a> Nat Rev Neurosci. 14, 233-247 (2013).</li><li>Maravillas-Montero, J. L., Santos-Argumedo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+family:+unconventional+roles+of+actin-dependent+molecular+motors+in+immune+cells.">The myosin family: unconventional roles of actin-dependent molecular motors in immune cells.</a> J Leukoc Biol. 91, 35-46 (2012).</li></ol>

ويدفع مجانا نشر وصول وإنتاج هذه المادة لشركة روش.

وصف الأسلوب يستخدم خصائص متحولة KIF5B بلا محركات، التي تفتقر إلى القدرة على التحرك على طول الأنابيب الدقيقة، لكنه يحتفظ القدرة على تشكيل dimers مع من النوع البري KIF5B، وبالتالي السماح للبروتين رباعي القسيمات للتفاعل مع حمولة البروتينات نفسها كما البرية من نوع KIF5B. KIF5B بلا محركات، وبالتالي، بمثابة متحولة السلبي السائد وأشكال mislocalized المجاميع مع الشحنات لها. وقد ثبت هذا الأسلوب لتحديد كينيسين-1 البضائع ج-MYC (الشكل 1) 5. في هذه المقالة، تم استخدام نفس متحولة KIF5B بلا محركات لتحديد البروتين p53 كما البضائع أخرى محتملة من كينيسين-1 (الشكل 2). هذا يدل على أن المنهجية الممكنة لتحديد الشحنات الأخرى من كينيسين-1. وعلاوة على ذلك، يتم توفير خصوصية متحولة بسبب عدم وجود تأثير متحولة على البروتين تحكم سلبي ج-فو (الشكل 3). في هذا البروتوكول، وtdTomato الموسومة البرية تايالمؤسسة العامة أو coexpressed بلا محركات بروتين KIF5B مع الفلورسنت الموسومة البروتين البروتين البضائع مرشح آخر. في هذه الحالة، يتم تنفيذ الخلية الحية مضان المجهر والتصوير. تشكيل المجاميع يمكن تتبع من قبل الوقت الفاصل بين التصوير. بدلا من ذلك، يتم التعبير عن بروتين الموسومة tdTomato وحده، وهو تصور البروتين البضائع مرشح على المستويات الفسيولوجية بواسطة المجهر المناعي غير المباشر باستخدام أجسام مضادة محددة. يتم اختيار tdTomato البروتين الفلوري لمعانه وصمود 17. إذا كانت الخلفية عالية نظرا لصناعة السيارات في مضان من المتوسط ​​DMEM كاملة، يتم استخدام وسيط وبدون أحمر الفينول. وKIF5B متحولة بلا محركات يشكل dimers مع من النوع البري KIF5B stoichiometrically. لذا، فمن الأهمية بمكان للتعبير عن كمية كافية من المسخ KIF5B بلا محركات لتشكيل dimers مع البرية من نوع النظير لتثبيط وظيفة ولتشكيل المجاميع. لمعالجة هذه المسألة، والتحسين من EXPRession من متحولة بلا محركات أمر ضروري. ويتحقق ذلك عن طريق استخدام متحولة بلا محركات صغير يحتوي المجال dimerization. وبالإضافة إلى ذلك، والتحسين من كاشف ترنسفكأيشن المناسب وبروتوكول ضروري أيضا. وكان محسن مدة حضانة المرض من خلايا هيلا مع كاشف الحمض النووي / ترنسفكأيشن في خلايا هيلا للتعبير عن البروتينات الخارجية وبقاء الخلية. قد يكون من الضروري الأمثل لخطوط الخلايا الأخرى مدة الحضانة. لتكبير بين 4X إلى 40X، ليس هناك حاجة لنظارات غطاء. الخلايا يمكن فحص مباشرة في الآبار. لذلك، في هذه الحالة، بروتوكول غير مكلفة ومريحة. لتكبير فوق 40X، وتزرع الخلايا على نظارات غطاء في الآبار، وبعد التلوين، هي التي شنت على الشرائح المجهر لفحصها تحت الأهداف النفط الغمر. مراقبة مجاميع من البروتين KIF5B بلا محركات محدود بسبب حجم السيتوبلازم. فمن السهل للكشف عنالمجاميع في العديد من خلايا الثدييات. ومع ذلك، فإنه من الصعب نسبيا لمراقبة المجاميع في الخلايا العصبية عندما يكون حجم السيتوبلازم صغير حول النواة وفي neurites التي. يتم استخدام البروتوكول لإظهار العلاقة بين KIF5B والشحنات لها بالإضافة إلى المجراة الخميرة اثنين الهجين والكيمياء الحيوية المقايسات المنسدلة 13-16. كل هذه المقايسات تحدد الجمعية في ظل ظروف مادية مختلفة، ويمكن نتائجها يكمل كل منهما الآخر. وعلاوة على ذلك، والاستفادة من هذا الاختبار مضان خلال فحوصات أخرى هي أنه يمكن أن تظهر تنظيم توطين التحت خلوية من الشحنات التي كتبها KIF5B (الشكلان 1 و 2). البروتوكول لا يقتصر على KIF5B، ويمكن استخدامها لتحديد الشحنات من البروتينات السيارات الأخرى، مثل بعض المحركات كينيسين أخرى 3 و بعض المحركات الميوسين 23،24 المستخدمة في نقل الخلايا من الشحنات 3. تحتوي هذه البروتينات المحرك أيضا المجالات الحركية للحركة على طول الأنابيب الدقيقة لمحركات كينيسين وخيوط الأكتين للمحركات الميوسين، وشرائح ملفوف لفائف لoligomerization. معظمهم من تشكيل homodimers 3،23. لذلك، يمكن تطبيق استراتيجية مماثلة لهم من خلال خلق بلا محركات المسوخ السلبية المهيمنة لتحديد الشحنات الخاصة بهم.

كينيسين-1 هو بروتين المحرك الذي يتوسط النقل تقدمي من الشحنات في 1،2. وهو heterotetramer اثنين من مفارز كينيسين ضوء سلسلة 1 (KLC1) واثنين من مفارز من سلاسل كينيسين الثقيلة (KHCs). KIF5B 1، شركة المملكة القابضة، ويحتوي على مجال السيارات في دورته N-المحطة، التي hydrolyzes اعبي التنس المحترفين وتحويل الطاقة الكيميائية إلى طاقة ميكانيكية لحركة على طول الأنابيب الدقيقة. تحتوي على منطقة C-محطة المجال dimerization التي تتفاعل مع KLC1، من شأنها أن تربط مع الشحنات. كينيسين-1 ينقل الشحنات مثل الحويصلات، العضيات ومن mRNAs 3،4. في الآونة الأخيرة، وقد تبين KIF5B لنقل عامل النسخ النووي ج-MYC لتدهور proteosomal في السيتوبلازم 5. استخدمت ثلاث منهجيات (المانع الكيميائية، سيرنا / shRNA ومتحولة السلبي المهيمن) لمنع كينيسين-1 وظيفة. أنهم جميعا الناجم عن تجميع ج-MYC في السيتوبلازم. لمنهجية الماضية، وج-MYC تتأثر فقط من قبل negat المهيمنإيف متحولة من KIF5B، ولكن ليس هذا البروتين KIF5A محرك آخر ذي صلة، مما يوحي بأن متحولة لا تمارس الآثار العامة على مكونات الخلايا (مثل اضطراب أنيبيب) أو على تجميع البروتين. متحولة السلبي السائد للKIF5B كما لم يؤثر عامل النسخ أخرى، مما يشير إلى أنها لا تمارس الآثار العامة على عوامل النسخ. بدلا من ذلك، فإنه يشير إلى أن متحولة السلبي السائد يمارس آثار محددة على الشحنات لها. استخدام المسوخ السلبية السائدة هو شائع في مجال البروتينات الحركية. استخدمت المسوخ بلا محركات مماثلة من kinesins وmyosins سابقا. كانت تستخدم أساسا لإثبات آثار المسوخ على تعريب التحت خلوية من الشحنات أو على الوظائف الخلوية 6-12. وقد وضع تركيز أقل على العلاقة المكانية بين المسوخ والشحنات المتضررين منها. ومع ذلك، في بعض حالات، لوحظت المسوخ للمشاركة في توطين مع كاليفورنيا الخاصةrgos 6،10. التفاعل بين KIF5B والبروتينات المرتبطة بها والتي سبق أن أكدتها في الجسم الحي الخميرة فحص هجين اثنين والكيمياء الحيوية المقايسات المنسدلة مثل شارك في مناعي وفحوصات في المختبر المنسدلة 13-16. في هذه المقالة، وصفت طريقة استخدام البصرية المجهر إضافية مضان لتحديد البروتينات البضائع KIF5B. الطريقة يجعل من استخدام متحولة KIF5B بلا محركات التي تعمل بمثابة متحولة السلبي السائد. أنه يجمع في السيتوبلازم ويؤدي تجميع الشحنات به. وضع علامات على النوع البري وبلا محركات متحولة KIF5B مع بروتين فلوري tdTomato 17 تمكن التصور من خلال الفحص المجهري مضان. البروتينات KIF5B الموسومة يمكن أن يشترك في التعبير عنها بروتين مرشح تنصهر لبروتين فلوري مختلف مع الخصائص الطيفية فصل مناسب من العلامة KIF5B. ويلاحظ البروتينات الموسومة مباشرة في الخلايا الحيةتحت المجهر مضان. سوف تحريض تجميع البروتين مرشح متحولة KIF5B بلا محركات تأكيد أن البروتين المرشح هو البضائع في الجسم الحي من KIF5B. وعلاوة على ذلك، فإن البروتينات KIF5B الموسومة tdTomato يمكن التعبير عن وحده في الخلايا لدراسة تأثيرها على البروتينات البضائع المحلية. وفي وقت لاحق، ويجري الفحص المجهري المناعي التي يتم إصلاحها الخلايا transfected وملطخة الأجسام المضادة المحددة ضد البروتين المرشح الذاتية، تليها الضد الثانوية المناسب مترافق مع صبغة الفلورسنت. في هذه الحالة، يتم دراسة البروتين المرشح الذاتية على مستوى الفسيولوجية. المسوخ بلا محركات مماثلة من البروتينات السيارات الأخرى يمكن أن تكون على استعداد لتحديد الشحنات الخاصة بهم.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="620">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">absolute ethanol (200 proof)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:113px;">BP2818</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Opti-MEM-I (transfection medium)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td align="right">51985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Diamond Antifade Mountant</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">formaldehyde, para</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>O4042-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton-X100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-tremeGENE 9 DNA Transfection Reagent</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">6365787001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Taq DNA polymerase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td align="right">10342020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR Grade Nucleotide Mix (dNTP Mix)</td>
			<td>Roche</td>
			<td align="right">12111424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope cover glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-541A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneRuler 1 kb Plus DNA ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>SM1333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PureLink Quick Gel Extraction kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K210012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BamHI</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>R0136</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SalI</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>R0138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T4 DNA ligase&#160;</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">17898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">c-MYC rabbit antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td align="right">5606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p53 mouse antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG antibody</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fluorescent microscope&#160;</td>
			<td colspan="2">Olympus IX71_Fluoview</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">computer software for imaging</td>
			<td>&#160;cellSens&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of kinesin-1 cargos using fluorescence microscopy

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear transcription factor c-MYC for proteosomal degradation in the cytoplasm. The method described here involves the study of a motorless KIF5B mutant for fluorescence microscopy. The wild-type and motorless KIF5B proteins are tagged with the fluorescent protein tdTomato. The wild-type tdTomato-KIF5B appears homogenously in the cytoplasm, while the motorless tdTomato-KIF5B mutant forms aggregates in the cytoplasm. Aggregation of the motorless KIF5B mutant induces aggregation of its cargo c-MYC in the cytoplasm. Hence, this method provides a visual means to identify the cargos of Kinesin-1. A similar strategy can be utilized to identify cargos of other motor proteins.

وأعرب خارجيا من النوع البري KIF5B ظهر متجانس في السيتوبلازم، في حين بدا ج-MYC أساسا في النواة (الشكل 1A). ومع ذلك، شكلت KIF5B متحولة بلا محركات المجاميع في السيتوبلازم (الشكل 1A). تجميع للKIF5B بلا محركات يسببها تجميع ج-MYC. النسبة المئوية للخلايا معربا عن تجميع الكلمات الدلالية TagCFP-ج-MYC في الخلايا معربا عن النوع البري KIF5B كانت منخفضة. ومع ذلك، كان أعلى بكثير عندما كان يشارك في التعبير عن KIF5B بلا محركات (الشكل 1A). لاحظ شارك في توطين KIF5B متحولة مع ج-MYC (الشكل 1) تشير إلى أن KIF5B ينظم توطين التحت خلوية من ج-MYC وج-MYC هو شحنة من كينيسين-1. وشملت الضوابط السلبية التي أبديت يبني وحده في اللوحة السفلى من الشكل 1A. وأظهرت النتائج أنه لا يوجد كبير تنزف من خلال من emissio مضانن. كما أقنع KIF5B بلا محركات تجميع والذاتية ج-MYC (الشكل 1B) والبروتين p53 عامل النسخ (الشكل 2)، مشيرا إلى أن ج-MYC والبروتين p53 كلاهما الشحنات من كينيسين-1 وKIF5B ينظم توطين التحت خلوية من كل من البروتينات الذاتية. جنبا إلى جنب مع النتائج التي المانع كينيسين-1 ارتفع اكتون البنغال (ربل) تشكيل 20 الحث من الأنواع عالية الوزن الجزيئي لكلا ج-MYC والبروتين p53 5، من المرجح أن يكون البروتين p53 شحنة من كينيسين-1. ومن المثير للاهتمام أن نلاحظ أن النسخ عامل البروتين p53 النووي، مثل ج-MYC، ويتم تصدير أيضا من النواة إلى السيتوبلازم لتدهور proteasomal 21،22. تبدو الحركة من عوامل النسخ التي كتبها KIF5B أن تكون محددة لأن التعبير عن متحولة KIF5B بلا محركات لم تؤثر على توطين التحت خلوية ج-فو أو يؤدي إلى تجميع (الشكل 3). وتوضح البيانات الواردة أعلاه أن methoد المستخدمة في هذا المنشور يسمح لتحديد عالية التحديد من كينيسين-1 الشحنات. ويمكن تطبيق استراتيجية مماثلة لالبروتينات السيارات الأخرى كذلك. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig1.jpg" /> الشكل 1: التعبير عن متحولة KIF5B بلا محركات الحث تجميع ج-MYC في السيتوبلازم و transfected (A) خلايا هيلا مع المعلمة tdTomato من نوع البرية (WT) KIF5B (الأحمر) والموسومة TagCFP-ج-MYC (الأزرق). ظهر الموسومة tdTomato-WT KIF5B أساسا في السيتوبلازم، في حين TagCFP الموسومة ج-MYC ظهرت أساسا في النواة. ومع ذلك، فإن الكلمات الدلالية tdTomato-متحولة KIF5B بلا محركات (الحمراء) تشكيل المجاميع الخيطية أو منقط في السيتوبلازم. التعبير عن KIF5B بلا محركات يسببها تجميع ج-MYC. وKIF5B متحولة وج-MYC المشارك المحلية معا (الوردي). وتظهر النسب المئوية للخلايا (٪) مما يدل مجاميع من CFP-ج-MYC (٪). وتظهر النتائج على النحويعني ± SD (N = 3). وترد ضوابط السلبية مع التعبير عن البروتينات KIF5B الموسومة tdTomato أو المعلمة TagCFP-ج-MYC جنبا إلى جنب مع ناقلات فارغة (V) في اللوحة السفلى. تم الحصول على (ب) نتائج مماثلة مع الذاتية ج-MYC (الأخضر) عندما أبديت الموسومة tdTomato-WT أو البروتينات KIF5B بلا محركات (الحمراء). وKIF5B متحولة بلا محركات الموسومة tdTomato-تشكيل المجاميع في السيتوبلازم والتي يسببها تراكم من الذاتية ج-MYC. كلا النوعين من المجاميع شارك مترجمة معا في السيتوبلازم (برتقالي). كانت ملطخة النوى مع صبغة هويشت 33342 أو دابي. شريط الحجم؛ 20 ميكرون. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53632/53632fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig2.jpg" /> الشكل 2: التعبير عن متحولة KIF5B بلا محركات الحث تجميع البروتين p53 الذاتية في تيانه السيتوبلازم. وفي خلايا هيلا، خارجية المنشأ الموسومة tdTomato البرية من نوع (WT) KIF5B (الحمراء) ظهرت أساسا في السيتوبلازم، في حين أن البروتين p53 الذاتية (الأخضر) ظهرت أساسا في النواة. في المقابل، فإن الكلمات الدلالية tdTomato-متحولة KIF5B بلا محركات (الحمراء) تشكيل المجاميع في السيتوبلازم. التعبير عن KIF5B بلا محركات يسببها تجميع البروتين p53، مما أدى إلى شارك في توطين KIF5B والبروتين p53 في السيتوبلازم (الصفراء). وأجريت التجربة ثلاث مرات. كانت ملطخة النوى مع دابي صبغ. شريط الحجم؛ 20 ميكرون. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53632/53632fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/53632/53632fig3.jpg" /> الرقم 3: التعبير عن متحولة KIF5B بلا محركات لا يسبب تجميع ج-فو في السيتوبلازم tdTomato الموسومة البرية من نوع (WT) KIF5B (الحمراء) بدا<html> أساسا في سيتوبلازم خلايا هيلا، في حين EGFP-ج-فو (الأخضر) ظهرت أساسا في النواة. على العكس من ذلك، الموسومة tdTomato-متحولة KIF5B بلا محركات (الحمراء) تشكيل المجاميع في السيتوبلازم. لم تعبير عن KIF5B بلا محركات لا لحث على تجميع ج-فو. وأجريت التجربة أربع مرات. كانت ملطخة نوى الخلايا مع دابي صبغ. شريط الحجم؛ 20 ميكرون. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/53632/53632fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> التمهيدي عكس الشائع </td><td> 5&#39;-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3 &quot; </td></tr><tr><td> من النوع البري KIF5B التمهيدي إلى الأمام </td><td> 5&#39;- AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT-3 &quot; </td></tr><tr><td> KIF5B بلا محركات التمهيدي إلى الأمام </td><td> 5&#39;- AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC-3 &quot; </td></tr></tbody></table>: المحافظة على together.within الصفحات = &quot;1&quot;&gt; الجدول 1: تسلسل التمهيدي لاستنساخ البرية من نوع والبروتينات KIF5B بلا محركات.

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

هنا، ويرد على بروتوكول لتحديد كينيسين-1 الشحنات. ومتحولة بلا محركات من السلسلة الثقيلة كينيسين-1 (KIF5B) المجاميع في السيتوبلازم ويدفع تجميع الشحنات به. تم الكشف عن كل من المجاميع تحت المجهر مضان. يمكن استخدام استراتيجية مماثلة لتحديد الشحنات من البروتينات السيارات الأخرى.

تحديد كينيسين-1 الشحنات عن طريق الميكروسكوب الإسفار

Fluorescence microscopy is employed to identify Kinesin-1 cargos. Recently, the heavy chain of Kinesin-1 (KIF5B) was shown to transport the nuclear ...

identification-of-kinesin-1-cargos-using-fluorescence-microscopy

Microsoft Bing

Research

JoVE Journal

Biology

7.8K Views.  Icahn School of Medicine at Mount Sinai.  هنا، ويرد على بروتوكول لتحديد كينيسين-1 الشحنات. ومتحولة بلا محركات من السلسلة الثقيلة كينيسين-1 (KIF5B) المجاميع في السيتوبلازم ويدفع تجميع الشحنات به. تم الكشف عن كل من المجاميع تحت المجهر مضان. يمكن استخدام استراتيجية مماثلة لتحديد الشحنات ...

Video: Identification of Kinesin-1 Cargos Using Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

تصور المجمعات الجزيئية واحدة في فيفو استخدام الميكروسكوب الإسفار متقدم

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

تصور تكرار الحمض النووي جزيء واحدة مع مضان المجهري

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

متصور الكهربائي زنزانة مع مضان المجهري

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Quantitative Live Cell Fluorescence-microscopy Analysis of Fission Yeast

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using fluorochromes like Green Fluorescent Protein (GFP) directly attached to the protein of interest has become increasingly popular 1. Using GFP and similar fluorochromes the subcellular localisations and movements of proteins can be detected in a fluorescent microscope. Moreover, also the subnuclear localisation of a certain region of a chromosome can be studied using this technique. GFP is fused to the Lac Repressor protein (LacR) and ectopically expressed in the cell where tandem repeats of the lacO sequence has been inserted into the region of interest on the chromosome2. The LacR-GFP will bind to the lacO repeats and that area of the genome will be visible as a green dot in the fluorescence microscope. Yeast is especially suited for this type of manipulation since homologous recombination is very efficient and thereby enables targeted integration of the lacO repeats and engineered fusion proteins with GFP 3. Here we describe a quantitative method for live cell analysis of fission yeast. Additional protocols for live cell analysis of fission yeast can be found, for example on how to make a movie of the meiotic chromosomal behaviour 4. In this particular experiment we focus on subnuclear organisation and how it is affected during gene induction. We have labelled a gene cluster, named Chr1, by the introduction of lacO binding sites in the vicinity of the genes. The gene cluster is enriched for genes that are induced early during nitrogen starvation of fission yeast 5. In the strain the nuclear membrane (NM) is labelled by the attachment of mCherry to the NM protein Cut11 giving rise to a red fluorescent signal. The Spindle Pole body (SPB) compound Sid4 is fused to Red Fluorescent Protein (Sid4-mRFP) 6. In vegetatively growing yeast cells the centromeres are always attached to the SPB that is embedded in the NM 7. The SPB is identified as a large round structure in the NM. By imaging before and 20 minutes after depletion of the nitrogen source we can determine the distance between the gene cluster (GFP) and the NM/SPB. The mean or median distances before and after nitrogen depletion are compared and we can thus quantify whether or not there is a shift in subcellular localisation of the gene cluster after nitrogen depletion.

The fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, is a good model system to study basic cellular processes. Here we describe a method to perform quantitative live cell analysis of fission yeast. In this particular experiment we focus on organisation of the genome within the cell nucleus, but the method can also be used to study cytosolic factors.

الكمية خلية حية الإسفار - المجهري تحليل الخميرة الانشطار

Several microscopy techniques are available today that can detect a specific protein within the cell. During the last decade live cell imaging using ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the subcellular distribution of a specific tagged fluorescent marker in the secretory pathway. Arabidopsis is a powerful biological model for genetic studies because of its genome size, generation time, and conservation of molecular mechanisms among kingdoms. The array genotyping as an approach to map the mutation in alternative to the traditional method based on molecular markers is advantageous because it is relatively faster and may allow the mapping of several mutants in a really short time frame. This method allows the identification of proteins that can influence the integrity of any organelle in plants. Here, as an example, we propose a screen to map genes important for the integrity of the endoplasmic reticulum (ER). Our approach, however, can be easily extended to other plant cell organelles (for example see1,2), and thus represents an important step toward understanding the molecular basis governing other subcellular structures.

A fundamental quest in cell biology is to define the mechanisms that underlie the identity of the organelles that make eukaryotic cells. Here we propose a method to identify the genes responsible for the morphological and functional integrity of plant organelles using fluorescence microscopy and next-generation sequencing tools.

مضان-المجهري الفحص والجيل القادم التسلسل الجيني: أدوات مفيدة لتحديد الجينات المسؤولة عن النزاهة العضيم

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, traditional chemotherapeutic approaches have been largely unsuccessful. Hormone therapy is effective at early stage, but often fails with the eventual development of hormone-refractory tumors. We have been interested in developing therapeutics targeting specific metabolic deficiency of tumor cells. We recently showed that prostate tumor cells specifically lack an enzyme (argininosuccinate synthase, or ASS) involved in the synthesis of the amino acid arginine1. This condition causes the tumor cells to become dependent on exogenous arginine, and they undergo metabolic stress when free arginine is depleted by arginine deiminase (ADI)1,10. Indeed, we have shown that human prostate cancer cells CWR22Rv1 are effectively killed by ADI with caspase-independent apoptosis and aggressive autophagy (or macroautophagy)1,2,3. Autophagy is an evolutionarily-conserved process that allows cells to metabolize unwanted proteins by lysosomal breakdown during nutritional starvation4,5. Although the essential components of this pathway are well-characterized6,7,8,9, many aspects of the molecular mechanism are still unclear - in particular, what is the role of autophagy in the death-response of prostate cancer cells after ADI treatment? In order to address this question, we required an experimental method to measure the level and extent of autophagic response in cells - and since there are no known molecular markers that can accurately track this process, we chose to develop an imaging-based approach, using quantitative 3D fluorescence microscopy11,12.
Using CWR22Rv1 cells specifically-labeled with fluorescent probes for autophagosomes and lysosomes, we show that 3D image stacks acquired with either widefield deconvolution microscopy (and later, with super-resolution, structured-illumination microscopy) can clearly capture the early stages of autophagy induction. With commercially available digital image analysis applications, we can readily obtain statistical information about autophagosome and lysosome number, size, distribution, and degree of colocalization from any imaged cell. This information allows us to precisely track the progress of autophagy in living cells and enables our continued investigation into the role of autophagy in cancer chemotherapy.

Autophagy is a ubiquitous process that enables cells to degrade and recycle proteins and organelles. We apply advanced fluorescence microscopy to visualize and quantify the small, but essential, physical changes associated with the induction of autophagy, including the formation and distribution of autophagosomes and lysosomes, and their fusion into autolysosomes.

التحليل الكمي الالتهام الذاتي باستخدام المجهر مضان المتقدم 3D

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

التحليل السريع واستكشاف الإسفار الميكروسكوب الصور

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells possess several lines of defense against damage to biologically relevant molecules like nucleic acids, lipids and proteins. In addition to organelle dynamics (fusion/fission/motility/inheritance) and tightly controlled protease activity, the degradation of surplus, damaged or compromised organelles by autophagy (cellular &#8216;self-eating&#8217;) has received much attention from the scientific community. The regulation of autophagy is quite complex and depends on genetic and environmental factors, many of which have so far not been elucidated. Here a novel method is presented that allows the convenient study of autophagy in the filamentous fungus Penicillium chrysogenum. It is based on growth of the fungus on so-called &#8216;starvation pads&#8217; for stimulation of autophagy in a reproducible manner. Samples are directly assayed by microscopy and evaluated for autophagy induction / progress. The protocol presented here is not limited for use with P. chrysogenum and can be easily adapted for use in other filamentous fungi.

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

A convenient and powerful method for studying autophagy in Penicillium chrysogenum by using starvation pads (mixtures of agarose and tap water in a microscope slide containing a central cavity) is presented here.

تحليل الالتهام الذاتي في<em&gt; البنسليوم العسجدية</em&gt; باستخدام التجويع وسادات في تركيبة مع المجهر مضان

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

تصور التردد Stromule مع مضان المجهر

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...