ウィノグラツキーカラムの作成:堆積物サンプル中の微生物種を濃縮する方法

ソース: エリザベス・スーター¹, クリストファー・コルボ¹, ジョナサン・ブレイズ^1
1ワーグナーカレッジ生物科学科、1キャンパスロード、スタテンアイランドニューヨーク、10301

ウィノグラツキーのコラムは、堆積物微生物群集、特に硫黄循環に関与する人々を豊かにするために使用される、小型で囲まれた生態系です。このカラムは1880年代にセルゲイ・ウィノグラツキーによって最初に使用され、以来、光合成器、硫黄酸化剤、硫酸還元剤、メタンゲン、鉄酸化剤、窒素などの生物地球化学に関与する多くの多様な微生物の研究に適用されています。サイクラー、およびより多く(1,2)。

地球上の微生物の大半は、試験管やペトリ皿(3)で単離できないことを意味し、培養不可能と考えられています。これは、微生物が特定の代謝産物のために他の人に依存することを含む多くの要因によるものです。ウィノグラツキーのカラムの条件は、他の生物との相互作用を含む微生物の自然生息地を密接に模倣し、実験室で成長することを可能にする。そのため、この技術は、科学者がこれらの生物を研究し、それらが単独で成長することなく、地球の生物地球化学サイクルにとってどのように重要であるかを理解することを可能にします。

地球の環境は、土壌、海水、雲、深海堆積物など、あらゆる種類の生息地で繁栄する微生物でいっぱいです。すべての生息地では、微生物はお互いに依存しています。微生物が成長するにつれて、糖などの炭素が豊富な燃料や栄養素、ビタミン、酸素などの気道ガスなど、特定の基質を消費します。これらの重要な資源がなくなったら、異なる代謝ニーズを持つ異なる微生物が咲き、繁栄することができます。たとえば、Winogradsky 列では、微生物はまずカラムの下層の酸素を枯渇させながら、追加された有機材料を消費します。酸素が使い切られると、嫌気性生物が引き継ぎ、異なる有機材料を消費することができます。時間の経過とともに異なる微生物群相のこの連続的な発達は、継承(4)と呼ばれる。微生物の継承は、微生物の活動が堆積物の化学を変化させ、他の微生物の活動などに影響を与えるウィノグラツキーカラムで重要です。土壌や堆積物の多くの微生物も、基板の濃度に基づいて2種類の生息地間の遷移ゾーンである勾配に沿って生息しています(5)。グラデーションの正しい場所で、微生物は異なる基板の最適な量を受け取ることができます。ウィノグラツキーカラムが発達するにつれて、特に酸素と硫化物において、これらの自然勾配を模倣し始める(図1)。

図 1:ウィノグラツキーカラムで発生する_酸素(O2)および硫化物(H2S)勾配の表現。

ウィノグラツキーのカラムでは、池や湿地の泥と水が透明な柱に混入し、通常は光の中でインキュベートすることができます。追加の基板は、通常、セルロース、および硫黄の形で、炭素のコミュニティソースを与えるために列に追加されます。フォトシンセサイザーは、通常、堆積物の最上層で成長し始めます。これらの光合成微生物は、酸素を産生し、緑または赤褐色の層として現れるシアノバクテリアからなる(図2、表1)。光合成は酸素を生成しますが、酸素は水にあまり溶け込んでおらず、この層の下に減少します(図1)。これは、最上層の高濃度の酸素から下層のゼロ酸素に至るまで、酸素の勾配を作成します。酸素化層は好気性層と呼ばれ、酸素のない層は嫌気性層と呼ばれています。

嫌気性層では、利用可能な基板の種類と量、初期微生物の供給源、および堆積物の多孔性に応じて、多くの異なる微生物群集が増殖する可能性があります。コラムの下部には、嫌気的に有機物を分解する生物が繁栄します。微生物発酵は、セルロースの分解から有機酸を生成します。これらの有機酸は、硫酸塩を使用してそれらの有機物を酸化し、副産物として硫化物を生成する硫酸塩還元剤によって使用することができます。硫酸塩還元器の活性は、鉄と硫化物が黒い硫化物鉱物を形成するために反応するため、堆積物が黒くなる場合に示される(図2、表1)。また、硫化物も上向きに拡散し、カラムの下部に硫化物濃度が高く、カラムの上部が低い別の勾配を作成します(図1)。

カラムの中央付近では、硫黄酸化剤は、上からの酸素の供給と下からの硫化物を利用します。光の適切な量で、光合成硫黄酸化剤は、これらの層で開発することができます。これらの生物は、緑と紫の硫黄細菌として知られており、しばしば緑色、紫色、または紫色のフィラメントやしみとして現れます(図2、表1)。緑色の硫黄細菌は硫化物に対する耐性が高く、通常は紫色の硫黄細菌のすぐ下の層で発症する。紫色の硫黄細菌の上に、紫色の非硫黄細菌も発症する可能性があります。これらの生物は、硫化物の代わりに電子ドナーとして有機酸を使用して光合成し、しばしば赤、紫、オレンジ、または茶色の層として現れます。非光合成硫黄酸化剤は紫色の非硫黄細菌の上に発症する可能性があり、これらは通常白いフィラメントとして現れます(図2、表1)。さらに、ウィノグラツキー列にも気泡が形成される場合があります。好気性層の気泡は、シアノバクテリアによる酸素の産生を示す。嫌気性層の気泡は、嫌気的に有機物を分解し、副産物としてメタンを形成するメタノゲンの活性に起因する可能性が高い。

表 1:古典的なウィノグラツキーの列に上から下に現れるかもしれない細菌の主なグループ。各グループの生物の例を示し、生物の各層の視覚的指標を列挙する。ペリーら(2002年)とローガンら(2005年)に基づく。

1. セットアップ

1. Winogradsky 列を設定するには、基本的な消耗品が必要です。
   • シャベル、バケツ、ボトルを使用して、現場でサンプルを収集
   • ●約1Lの等級シリンダーやプラスチック製水筒などの縦透明容器
   • プラスチックラップとゴムバンド
   • 大きなミキシングボウルと大きなスプーンをかき混ぜる
   • 硫黄源(卵黄または硫酸カルシウム)
   • 有機炭素の供給源(セルロース、細断された新聞の形で)
   • 光源(日当たりの良い窓またはデスクランプ)
   • 湿地、湿地、池、または河川から採取された土壌または泥
   • 同じ生息地からの水
   • オプション このプロトコルで説明するオプションの実験の一部には、次のことが必要です。
     • テーブルソルト
     • 異なる色のセロファン
     • 鉄の供給源(釘やスチールウールなど)
     • 光源付き冷蔵庫
     • 光源の近くのラジエーター
2. プラスチック製の水筒を使用する場合は、柱が円筒形になるように首の領域を切り取ります。光がプラスチックを貫通できるように、ラッパーを取り外します。
3. 生卵にはサルモネラ菌が含まれている可能性があり、注意して取り扱う必要があります。適切な手洗い技術に従う必要があります。また、ゆで卵を用いることができる。また、泥や土砂が下水やその他の有害物質で汚染されているかどうかを確認する方法はありません。泥を混ぜてカラムを設定する際には、手袋を使用する必要があります。

2. ウィノグラツキーコラムの組み立て

1. シャベルを使用して、掘り起こし、バケツに泥を収集します。堆積物は水の端の近くにあり、完全に水で飽和する必要があります。各ウィノグラツキーの列を埋めるのに十分な泥が必要です。同じソースからサンプルボトルに水を取り込みます(カラムあたり約3000mLが必要です)。
2. ラボでは、1リットルのボリュームカラムの約75%を充填するために、最初の混合ボウルに十分な泥を転送します。次に、スプーンを使用して塊を分解しながら、大きな岩、小枝、または葉を取り除くためにふるみます。
3. 攪拌しながら、ミキシングボウルに集めた水の一部を追加します。水泥混合物の一貫性がミルクセーキのようなものになるまで追加します。引き続き、束がないことを確認します。
4. 水泥ミルクセーキの約1/3を第2のボウルに移します。卵黄と細断された新聞の一握りを追加し、ミックス。
5. カラムが約1/4になるまで、泥、卵黄、新聞の混合物を列に追加します。
6. 列が約3/4がいっぱいになるまで、通常の水泥混合物を列に追加します。
7. 柱に水を追加し、上部に空気の小さなスペース(約1/2インチ)を残します。
8. カラムをラップで覆い、ゴムバンドで固定します。
9. カラムを室温で光の中でインキュベートします。
10. 次の4~8週間は、表1に示すように、異なる色の層の発達と気泡の形成のためにウィノグラツキー列の変化を監視します。さらに、異なるレイヤーの開発にかかる時間を記録する必要があります。

3. 古典的なウィノグラツキー列へのオプションの変更

1. 水を加えて攪拌する前に、収集した泥に1Lウィノグラツキーカラムあたり25-50gの塩を加えます(ステップ2.3)。塩の添加は、ハロフィリック(塩を愛する)細菌のために選択します。
2. 鉄などの代替基板は、爪またはスチールウールの形で、卵黄と細断された新聞と一緒にカラムに追加することができます(ステップ2.4)。これは、ガルニオレラなどの鉄酸化細菌を濃縮し、錆色の層として表示されます。
3. 室温(ステップ2.9)の代わりに、カラムをラジエーターの近くでインキュベートして、熱性(熱好き)細菌を選択したり、発光性(冷たい)細菌を選択する光源を持つ冷蔵庫で選択することができます。
4. カラムがインキュベートする時に受け取る光の量(ステップ2.9)は、高光、低光、または暗い中に異なる柱を配置することによっても変化させることができる。
5. 入ってくる光の波長は、異なる細菌群に対して選択する色を決定するために、異なるシェードセロファンでカラムを覆うことによって制限することができます(ステップ2.9)。

4. データ分析

1. 1-3週間後、古典的なウィノグラツキー列の泥層の上にいくつかの緑色の着色が表示されるはずです(図2A)。これらは、シアノバクテリア層の成長の最初の兆候です。
2. 時間が経つにつれて、異なる層の外観と進化を監視し続け、それぞれ異なる細菌タイプを示します。ヒント:異なる層に寄与する細菌を理解するには、概念と表 1 を参照してください。

図 2A:室温で21日間インキュベートした古典的なウィノグラツキーカラムの写真。カラムの上部にシアノバクテリアを示す緑色の堆積物に注意してください。

3. 従来の Winogradsky 列の変更も準備されている場合は、各列の結果を比較します。
   1. 変更された各ウィノグラツキー列のレイヤーを観察します。次の点に注意してください。
      • 列は同じ数のレイヤーを示しますか?
      • レイヤーの色と厚さは同じですか?
      • レイヤーは同じ深さで発生しますか?
      • 各列の開発にはどのくらいの時間がかかりましたか。
      • 1つの列は他の列よりもゆっくりと発展しましたか?

この実験では、淡水の生息地から水と堆積物を採取した。2つのウィノグラツキーカラムを構築し、開発することができました:室温で光の中でインキュベートされた古典的なウィノグラツキーカラム(図2A)と室温で暗闇の中でインキュベートされたウィノグラツキーカラム(図2B)。

図 2B:古典的なウィノグラツキーカラム(左)の写真、68日間の光で室温でインキュベートし、ウィノグラツキーカラムは68日間暗闇の中で室温でインキュベートした(右)。

カラムを7~9週間の発達させた後、古典的なカラムの層を暗闇でインキュベートしたカラムと比較することができる(図2B)。古典的なウィノグラツキーのコラムでは、緑色のシアノバクテリア層がチューブの上部付近で観察することができる。チューブの中心付近では、紫色の非硫黄細菌を示す赤紫色の層が観察されます。この層の下では、紫色の硫黄細菌を示す紫色の赤色の層が観察されます。この層の真下には、黒い沈土がカラムの嫌気性領域で観察され、硫酸塩還元菌を示す。

暗闇の中で成長した列(図2B)は、古典的なウィノグラツキーのコラムとは異なる開発を行いました。古典的なコラムと同様に、暗い柱は、硫酸塩還元細菌を示す、カラムの底付近に黒い堆積物を生み出しました。暗いカラムは、緑色のシアノバクテリア層、紫色の非硫黄、紫色の硫黄、緑色の硫黄細菌を示す赤、紫、または緑の層をそれぞれ得ませんでした。これらのグループは、成長のための光に依存しているので、暗闇の中で成長することができません。

各Winogradskyカラムの正確な結果は、インキュベーション条件とそのソース生息地によって大きく異なります。

淡水の生息地に由来する微生物群集は、高塩濃度に慣れておらず、塩の添加が遅くなったり、成長を阻害したりする可能性があります。逆に、塩を加えても塩を加えずにカラムと比較しても、塩を加えても特定の層の成長を高めないように、汽水や塩水の生息地に十分な好性細菌が存在する可能性があります。

砂の堆積物は泥だらけの堆積物よりも多孔質です。このような多孔質堆積物で十分な硫化物が生成された場合、硫化物はカラムの上部まで拡散し、好気性生物の増殖を阻害する可能性があります。この場合、カラムには嫌気性を示す層のみが含まれ、シアノバクテリアなどのエアロベを含まない場合があります。

淡水は一般的に塩水よりも硫酸塩が少ない。硫酸塩は、硫酸塩還元細菌の増殖に重要です。硫酸塩還元器は、副産物として硫化物を作成し、カラムの下部に黒い層の開発によって示されます。硫酸塩が淡水群に補充されない場合、硫酸塩還元器は十分な硫化物を産生しない可能性がある。硫化物副産物の作成は、緑と紫の硫黄細菌と非光合成硫黄酸化剤の成長のために重要です。これらの場合、硫酸還元剤(黒層)が決して発達しない場合でも、硫黄の卵黄を硫黄の供給源として使用して成長することができます。

光の異なる波長は、異なる吸収顔料を持つ生物のために選択する必要があります。暗闇の中で保持されたカラムは、硫酸塩還元剤、鉄酸化剤、メタノゲンを含む非光合成生物の成長のみを可能にします。光合成器は、可視範囲内(〜400〜700nm)内の異なる波長で光を吸収する顔料を持っています。例えば青色セロファンでカラムを覆うことによって、青色光(〜450〜490nm)がカラムに入るのを妨げられている。カラム内のすべての光合成体は、青色波長(6)を必要とする顔料を有し、それらの成長を阻害する必要があります。一方、赤色セロファンは〜635-700nmの光を遮断する。これらの波長はシアノバクテリア(6)が使用する顔料にとって重要であり、紫色の硫黄、緑色硫黄、紫色の非硫黄菌は依然として増殖できる可能性があります。

異なる微生物群では、温度の変化に対処する適応能力が大きく異なる場合があります。高温は、十分な熱球が存在する場合、微生物活性の速度を高めることができます。一方、熱球がない場合、高温は全体的な微生物活性を低下させる可能性がある。同様に、低温は、微生物コミュニティが十分な心理球を含む場合を除き、全体的な微生物活性を減少させる可能性があります。

ウィノグラツキー列は、相互依存性の微生物生態系の一例です。泥、水、および追加の炭素および硫黄基板を垂直列に混合した後、層状生態系は数週間にわたって別々の安定したゾーンに安定する必要があります。これらのゾーンは、底部の硫化物が豊富な堆積物と上部の酸素が豊富な堆積物との間の勾配に沿って特定の場所で繁栄する異なる微生物によって占められている。ウィノグラツキーカラム内の条件と基板を操作することにより、ハロフィル、熱球、心理球、硫黄酸化剤、硫黄還元剤、鉄酸化剤、光合成剤などの異なる微生物の存在と活性が観察されます。

1. Zavarzin G. (2006). Winogradsky and modern microbiology. Microbiology 75(6): 501-511. doi: 10.1134/s0026261706050018
2. Esteban DJ, Hysa B, and Bartow-McKenney C (2015). Temporal and Spatial Distribution of the Microbial Community of Winogradsky Columns. PLoS ONE 10(8): e0134588. doi:10.1371/journal.pone.0134588
3. Lloyd KG, Steen AD, Ladau J, Yin J, and Crosby L. (2018). Phylogenetically novel uncultured microbial cells dominate Earth microbiomes. mSystems 3(5): e00055-18. doi:10.1128/mSystems.00055-18
4. Anderson DC, and Hairston RV (1999). The Winogradsky Column & Biofilms: Models for Teaching Nutrient Cycling & Succession in an Ecosystem. The American Biology Teacher, 61(6): 453-459. doi: 10.2307/4450728
5. Dang H, Klotz MG, Lovell CR and Sievert SM (2019) Editorial: The Responses of Marine Microorganisms, Communities and Ecofunctions to Environmental Gradients. Frontiers in Microbiology 10(115). doi: 10.3389/fmicb.2019.00115
6. Stomp M, Huisman J, Stal LJ, and Matthijs HCP. (2007) Colorful niches of phototrophic microorganisms shaped by vibrations of the water molecule. ISME Journal. 1(4): 271-282. doi:10.1038/ismej.2007.59
7. Perry JJ, Staley JT, and Lory S. (2002) Microbial Life, First Edition, published by Sinauer Associates
8. Rogan B, Lemke M, Levandowsky M, and Gorrel T. (2005) Exploring the Sulfur Nutrient Cycle Using the Winogradsky Column. The American Biology Teacher, 67(6): 348-356. doi: 10.2307/4451860