エンリッチメント培養:選択的および差動媒体における好気性微生物と嫌気性微生物の培養

ソース: クリストファー・P・コル^ボ1, ジョナサン・F・ブレイズ¹, エリザベス・スーター^1
1ワーグナーカレッジ生物科学科、1キャンパスロード、スタテンアイランドニューヨーク、10301

原核細胞は、この惑星上のほぼすべての環境に生息することができる。王国として、彼らは大きな代謝多様性を持ち、エネルギー生成(1)のために多種多様な分子を使用することができます。したがって、研究室でこれらの生物を培養する際には、エネルギーを作るために必要なすべての分子と特定の分子を成長培養培養剤に提供する必要があります。代謝的に多様な生物もあれば、高温または低温、アルカリ性および酸性pH、還元または酸素欠乏環境、または高塩を含む環境(2,3,4)などの極端な環境で生き残ることができる生物もあります。「極端な好酸球」と呼ばれていますが、これらの生物はしばしば増殖するためにこれらの強烈な環境を必要とします。科学者がそのような生物を成長させようとするとき、メディア成分だけでなく、特定の環境条件は、関心のある生物を正常に栽培するために考慮する必要があります。

科学者たちは、これらの種が成長する必要がある特定の要件を理解しているので、研究室で培養可能な生物を成長させることができます。しかし、培養可能な生物は、地球上に生息すると推定される種の1%未満を占めている(5)。遺伝子シーケンシングで検出したが、研究室では増殖できない生物は、培養不能と考えられている(6)。現時点では、これらの生物の代謝と成長条件について十分に知られていない。

断固たる生物は前者の2人の間のどこかに横たわっている。これらの生物は培養可能であるが、特定の成長培養培養成分や特定の成長条件など、非常に特定の成長条件を必要とする。このような属の2つの例は、部分的に分解された赤血球(チョコレート寒天とも呼ばれる)、ならびに特定の成長因子および二酸化炭素が豊富な環境(7)を必要とするネイセリアsp.およびヘモフィラスsp.である。必要な特定の成分のすべてがなければ、これらの生物は全く成長しません。多くの場合、すべての要件を満たしていても、これらの生物は不十分に成長します。

好気性、または酸素を含む酸素でしか増殖できない真核細胞とは異なり、原核細胞は、いくつかの発酵経路を用いて嫌気的に増殖し、十分なエネルギーを生成することができる(8)。他の原核生物は、微好気性、または酸素環境の低下、あるいはカプノフィリック、または高い二酸化炭素環境を好む(9)。これらの生物は、大気を変えなければならないので、豊かにするのがより難しい。酸素化された環境に敏感な生物と頻繁に働く科学者は、通常、嫌気性チャンバーとインキュベーターで動作し、アルゴンなどの重い不活性ガスが酸素を置き換えるためにポンプで送り込まれる(10)。また、水を利用して水素や二酸化炭素を発生させる密閉ガスパケットシステムや、パラジウムのような触媒を使用して大気中の酸素をすべて除去するシステムもあります。これらの市販キットは、上記の大気条件(10)のいずれかを作成することができる。

潜在的な感染を決定するために病原体を培養するか、自然環境に存在する細菌の特定の種を同定しようとしているかどうか、1つの問題が存在する。1つの生息地に生息する細菌種は一つもない。バクテリアは、人間の皮膚から地球の海まで、あらゆる場所で多細胞共同体として生きています(11)。1種の細菌を単離しようとする際、科学者は、孤立した地域に生息する他の多数の生物を排除するために働かなければならない。このため、細菌に対する濃縮成長培分は、多くの場合、2つの機能を行う。1 つ目は、メディアを選択的にする方法です。選択的剤は、いくつかの種が成長するのを防ぎ、他の種を阻害せず、しばしば他の種の成長を促進する(12)。媒体成分の第2の機能は、差分剤として働くことであってもよい。このような薬剤は、単離された生物の特定の生化学的特徴の同定を可能にする。適切な成長条件と一緒にいくつかの異なる選択的および差分媒体を組み合わせることで、科学者および診断士は、特定の単離物から特定の細菌種の存在を識別することができる。

同定を支援する選択的および差分媒体の一例は、臨床的に有意な生物黄色ブドウ球菌の場合である。この生物は、典型的にはマンニトール塩寒天上で培養される。この媒体は、ブドウ球菌のようないくつかのグラム陽性を含む高塩環境に住むことができる生物だけを選択するだけでなく、塩に敏感な任意の生物を阻害します。マンニトール糖は、この媒体の差分成分である。臨床的に有意なブドウ球菌種の中で、マンニトールを発酵できるのはS.aureusのみである。この発酵反応は、媒体中の赤色の赤色指標が黄色に変わる副産物として酸を生成します。他のブドウ球菌種(表皮ブドウ球菌など)は成長することができるが、メディアを赤色のままにする。

このラボ演習では、適切な無菌技術と、スープからの成長培った培宿の適切な接種を示します。また、濃縮培養媒体上の一般的な汚染物質生物の成長、嫌気性細菌に対するガスパッケージ嫌気培養システムの使用、およびグラムの推定同定のための異なる選択的および差動媒体の使用を紹介します。陽性およびグラム陰性の細菌。

1. 準備

1. 始め前に手をよく洗い、適切な大きさの手袋を着用してください。
2. 5%の次亜塩素酸ナトリウム(漂白剤)で作業面を殺菌し、完全に乾燥させます。
3. 作業中にベンチトップに触れないように、空の120 mLエルレンマイヤーフラスコに接種ループを配置します。

2. 成長メディアと文化

1. 冷蔵庫からマンニトールソル寒天(MSA)、エオシンメチレンブルー寒天(EMB)、8種類の大豆寒天(TSA)の4枚を冷蔵庫から集めます(これらは市販で購入できます)。
2. 洗浄された作業領域にプレートを置きます。
3. 次のブロス培養物を収集する:大腸菌、黄色ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、およびプロテウス・ブルガリス。注意:これらは好気性生物であるので、チューブのキャップはわずかに緩んでいる必要があります。
4. すべてのカルチャを、清掃された作業面の試験管ラックに置きます。

3. 文化の移転とインキュベーション

1. 手の届くところですべての材料を持ってベンチに立つか、座ります。
2. 無菌技術を使用して細菌をプレートに移すには、まずループをオレンジ色に光るまで炎上させ、次に空気中で冷却できるようにします。
3. ループが冷却される間、大腸菌のスープ培養を取り、その後、あなたの小指を使用してキャップを開きます。
4. チューブの開口部を素早く燃やします。これは汚染を防ぐ。
5. ループをチューブに浸し、生物をEMBプレートの最初の象限に取り付けます。
6. 最初のストリークが実行された後、ループを炎上し、最初のストリークを1回または2回だけ横切る2番目のストリークを実行します。これにより、単一のコロニーの分離が可能になり、汚染があるかどうかを判断できます。
7. プレートの 4 つの象限がすべて縞模様になるまで、この手順を繰り返します。
8. 次に、残りの 4 つの生物を同じストリーク メッキ方で転送し、最終製品が 1 つの MSA プレート、1 つの EMB プレート、および 2 つの別々の TSA プレートが生物ごとに 1 つずつあるようにします。
9. すべての生物が転送されたら、ループを最後に1回燃やし、それを片付けます。
10. 各生物を入れたTSAプレートをガスパケットに入れ、ガス袋を振ってからプレートと並んでチャンバーに入れます。しっかりとシールします。
11. すべてのプレートを一晩37°Cでインキュベートします。
12. 作業面を5%漂白剤で最後の1回殺菌します。

4. 結果の読み取りと記録

1. インキュベーターからプレートを取り出し、クリーンなラボベンチに置きます
2. ラボ ノートブックの各プレートの生物の成長に注意してください。特に、次の事項に関する詳細なメモを取ります。
   1. 各プレート上のコロニーの数とサイズ(存在する場合)、各めっきされた歪み
   2. MSAプレート上に成長するコロニーを取り巻く寒天の外観
   3. EMBプレート上で成長するコロニーの外観
   4. ガスパッケージ内と外側に成長したTSAプレート間の成長の違い

マンネトール塩寒天(MSA):この培地は、塩化ナトリウム6.5%で生き残ることができるグラム陽性生物に対して選択的である。グラム陰性生物エシェリヒア大腸菌とプロテウス・ブルガリスは、塩濃度が高いため、この媒体では成長できないはずです。S. 表皮ミディスとS. アウレウスは成長できるはずです。S.aureusはマンニトールを発酵することができるので、メディアは2つの間で差異です - 発酵副産物として酸の生産のために明るい黄色のメチル赤色指標を回します。S.表皮は、プレート上のピンク色を維持する必要があります。
注:コロニーが小さい場合、この媒体の成長は、最適な温度で合計48時間の追加インキュベーションを必要とする可能性があります - ここでは、37°C。

エオシンメチレンブルー寒天(EMB):この媒体はグラム陰性生物に対して選択的であり、エシェリヒア大腸菌およびプロテウス・ブルガリスプレートは成長を示す必要があります。エオシンとメチレン色素はグラム陽性細胞に有毒なので、ストレプトコッカス種はいずれも成長すべきではありません。グラム陰性細胞の外膜は、染料が細胞に入るのを防ぎます。この媒体は、生物がラクトースを発酵させる能力をテストすることを可能にするので、差異である。大腸菌は、メディアでラクトースの発酵のために明るい紫色(多くの場合、十分に長く栽培された場合は緑色の金属光沢を持つ)を回します。P.ブルガリスは、成長することはできるが、ラクトースを発酵させません(しかし、それは他の糖を発酵させることができる)。

トリプスティック大豆寒天(TSA):この媒体は非選択的なので、すべての研究種が成長する必要があります。しかし、好気性と嫌気性の条件を比較すると、ガスパッケージのプレートは、より少ない成長(およびより小さなコロニー)を表示する必要があります。これは、デモンストレーションで増殖した細菌のいずれもエアロベを義務付けないためであるが、その最適な成長条件には酸素が含まれるからである。

異なる細菌種は、異なる環境で成長することができ、エネルギーを生成する方法として異なる炭素源を使用することができる。ラボで培養物としてこれらを使用する場合、成長培養中の成分を知り、成長培養剤を細菌種に合わせて行う必要があります。科学者や診断士はまた、異なる種を他の種から分離する方法として、また混合環境で細菌を識別し、同定する方法として、様々な生化学反応を利用することができます。