RT-PCR 法を用いた環境試料の RNA 解析

ソース: ドクターペッパー イアン博士チャールズ Gerba - アリゾナ大学所
示す著者: ブラッドリー ・ シュミッツ

逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR) は、従来の PCR と同じプロセス-核酸を増幅するサイクリングの温度。しかし、従来の PCR は、デオキシリボ核酸 (DNA) を増幅するだけ中、RT-PCR は相補的 DNA (cDNA) の形成をリボ核酸 (RNA) の増幅をできます。これにより、RNA に基づく生物環境分析の利用法や DNA のために設計されている技術の内で見つかった。

環境は、多くのウイルスは、彼らの遺伝物質として RNA を使用します。いくつか RNA 型ウイルスの病原体、ノロウイルス、トウガラシマイルドモットル ウイルス (PMMoV) などの指標生物などには、定量化のため文化基づかせていた検出メソッドはありません。土壌、水、農業、等から環境試料中のこれらの RNA ウイルスの存在を検出するために分子アッセイは、RNA を DNA に変換する RT-PCR 法に依存します。RT-PCR 微生物学者ないなければ試金や健康や環境にリスクをもたらす多数の RNA ベースのウイルスを研究することができます。

RT-PCR は、環境における微生物の活性を測定するツールとしても使用できます。メッセンジャー RNA (mRNA) タンパク質翻訳の単一座礁させたテンプレートでありそこから微生物が環境の中で表現されているどの遺伝子を示す別の Mrna のレベルを測定します。遺伝子発現解析にどのような生物学的経路が異なる環境で生き残るために生物によって使用される手がかりを与えます。いくつかのケースでは、生物が生き残るため過酷な条件で最高と汚染された土壌や水の浄化のための機能を持っているを決定する遺伝子発現を利用できます。

PCR は生物からの RNA の検出でその使用が制限される DNA テンプレートの増幅に基づいています。ただし、RT-PCR は逆転写酵素 (RT) と呼ばれる特殊な酵素を使用して cDNA を生成する RNA を使用するための手段を提供します。この cDNA は、従来 PCR (図 1) にその後拡大のため開始のテンプレートとして使用できます。

逆のトランスクリプションを制御することができますテンプレート cDNA 合成のみ希望の製品または全体のコミュニティによっては、プライマーの環境試料内にある核酸の増幅に使用します。これは、土壌と水のサンプルの特定の分析の必要のない様々 な核酸と飽和頻繁に重要です。微生物の任意のタイプの RNA シーケンスにバインドできます、ランダムのプライマーに存在し、環境内の複数の生物の相対量サンプルを分析できますのでほとんどの RNA を検出する RT-PCR 法で使用できます。一方、配列特異プライマーは cDNA を合成するだけ 1 つまたは少数の有機体の正確なシーケンスを開始します。これはノロウイルス人間の胃腸の病気を引き起こす可能性が、水に存在するかどうかを決定するなど、特定の目的をテストする環境試料をことができます。

図 1。環境の RNA サンプルの RT-PCR 分析のステップバイ ステップのプロセスです。

1. サンプル コレクション: 土壌サンプル

1. GPS、座標、または視力でサンプルの場所を見つけます。
2. ランダム サンプリングは、微生物の生息地の一般的な人口調査を取得するエリア内にランダム ポイントを選択します。トランセクトに沿って直線、例えば河床に隣接するポイントからサンプリング収集。グリッド サンプルは体系的に、定期的にポイントから取られる、未知または可変領域のマッピング微生物群集に便利。
3. 3-6 インチ (7.5-15 cm) 内サンプリング深度は内ではなく、根 (植物の根とその関連付けられた微生物の影響を直接受ける土の狭い地域) が近く、最も豊富な微生物の活動へのアクセスを提供します。
4. 土のサンプルを収集するために押して所定の深さまで地面に手オーガーを回転します。
5. オーガーを持ち上げます。オーガーの中空の茎内土壌にあります。
6. 土壌回収袋にオーガーの底に土をこすり。タッチや土壌を汚染するにしないようにします。
7. 場所、名前、日付、および時間に正しく袋にラベルを付けます。
8. 所、砂利や岩を削除する 2 mm ふるい土を渡します。
9. 土壌水分のための土の部分を分析します。この手順の詳細については、土壌水分にゼウス科学教育ビデオを参照してください。

2. サンプル コレクション: 水サンプル

1. GPS、座標、または視力でサンプルの場所を見つけます。
2. ストレージ ボトルの中の水を収集します。水の量のレコードの収集;場合は、サンプル中の微生物は、検定定量的微生物濃度は収集量に基づいて決定できます。
3. (温度、pH、導電率、塩分、窒素、燐等) の実験に必要な任意のパラメーターのための水をすぐにテスト適切な電子プローブを用いたします。
4. 氷をクーラーに水のサンプルを含むボトルを置きます。研究室にクーラーを転送します。

3. RNA の抽出

1. 収集し、環境試料からの微生物を集中、ゼウス科学教育コミュニティ核酸抽出に関するビデオを参照してください。
2. 製造元の指示に従って商業抽出キットを使用してウイルスから RNA を抽出します。
3. 簡単に言えば、最初エタノール添加の換散バッファーのサンプルをミックスし、スピンの列にサンプルを追加します。
4. 約 12,000 × g、破棄の流れる通路に列を遠心します。列に洗浄バッファーを追加し、再び遠心分離します。
5. 列および 30 の遠心分離機に RNase フリー水を加える s 滅菌 1.5 mL 低接着 microfuge の管に RNA を溶出します。

4. 逆転写 - PCR

1. -20 ° C のフリーザーから次の試薬を取得: dNTP、集中 (例えば、10 倍) を逆転写バッファー (この例では、ランダムなプライマー) のプライマー。氷の上やクリーン フード内室温でこれらを解凍し、一度融解したもの氷のそれらを保ちます。また逆転写酵素と RNase 阻害剤取得し、氷の上にそれらを保ちます。
2. すべての試薬を組み合わせた「マスター ミックス」をすべての反応の間で一定に必要な試薬体積を計算 (サンプル反応は表 1を参照)。(知られているトラン スクリプト テンプレートを使用して) 肯定的な制御と同様に、あらゆるサンプルのため十分なマスター ミックスを準備し、否定的な反応 (例えば逆転写酵素、テンプレート等と水だけでなく) を制御します。ボリュームに余分な 10% を含めます。
3. 1.5 mL 低接着 microfuge の管のマスター ミックスを組み立てます。これは、チューブのプラスチック壁に試薬の分子の結合を最小限に抑えます。
4. 試薬がフリーズ解除とき、および microfuge の管に計算されたボリュームを追加します。優しく渦、加算の前に各チューブを遠心力場します。汚染を防ぐために各試薬を追加間ピペット チップを変更することを確認します。
5. 後すべての試薬が追加されました、渦および遠心分離機の均一混合物を確保するためのマスターの組合せ。-20 ° C で貯蔵に戻って試薬を入れる
6. 準備、ラベルの 8 チューブ PCR ストリップ、各サンプルまたはコントロールの反作用のための 1 つの管を指定します。
7. 各チューブにマスター ミックスの等量の約数。RNA 抽出物などの反応に固有のコンポーネントを追加します。
8. PCR ストリップにしっかりとストリップ キャップを置きに各管 (図 2) の下部にすべての液体を収集するストリップ管アダプターと minicentrifuge の遠心分離機します。
9. たちでしっかり場所 PCR ストリップ。チューブを保護する押し。
10. 使用されている RT の適切なプログラムを実行するたちを設定 (サンプル プロトコルの表 2を参照)。プログラムが完了したら、チューブ PCR 増幅に受けることができますし、cDNA 等が含まれます。詳細については、PCR および量的な PCR のゼウス科学教育ビデオを参照してください。使用するまで-20 ° C で cDNA を格納します。

図 2。マスター ミックスとエキスを含む 8 チューブ ストリップを頂いた。

試薬	1 反応 (μ L) あたりのボリューム
RT バッファー x 10	2.0
25 x dNTPs	0.8
任意プライマー x 10	2.0
Multiscribe	1.0
リボヌクレアーゼ阻害剤	1.0
分子グレード H2O	3.2
総容積	10

表 1。RT マスター ミックスの成分。

ステップ 1	ステップ 2	ステップ 3	ステップ 4
25 ° C、10 分	37 ° C、120 分	85 ° C、5 分	4 ° C、∞

表 2。RT 反応たちプログラム。

RT-PCR が完了したら、PCR の製品のいくつかで区切られたおよび視覚化できる agarose のゲル (図 3)。この例では遺伝子特定のプライマーは、RNA ウイルスの存在を検出する使用されました。水試料の 2 つにこのウイルスの存在を示す負の制御からではなく、2 つのサンプルとポジティブ コントロール反応から予想されるサイズのバンドが得られます。

図 3。RT-PCR 産物の電気泳動。M: DNA サイズ マーカーP: 肯定的な制御;N: 陰性対照.4 つの水のサンプルから RNA を用いた反応は、レーン 1、2、3、および 5 の実行されました。

RT-PCR は RNA テンプレートから cDNA を作成するために必要です。これにより DNA の開発分析による分子アッセイする RNA に基づく微生物です。CDNA を合成すると、一度 PCR の試金は、環境試料中の RNA に基づく微生物の有無を確認できます。これによりさらに、微生物生態学、健康リスクと環境リスクを決定するダウン ストリーム分析です。

RT-PCR は、環境でどの遺伝子が表現されているかを観察する手段として mRNA を試金するためにも利用できます。これはの蛋白質と経路の微生物は、特に環境条件を生き残るために依存情報を提供します。遺伝子発現解析はその内訳に、炭化水素や塩素系溶剤など環境汚染物質、微生物の経路を識別できるし、バイオレメディエーションのこれらの経路で微生物が活きます。

リスク評価には、人間と環境の健康上のリスクを分析するために RT-PCR 法が組み込まれています。量的な PCR と RT を組み合わせると、人間と環境の露出は、定量的微生物リスク評価 (QMRA) 目的を計算できるように、サンプル内で列挙される RNA ウイルスができます。