環境試料中のバクテリオファージの検出

ソース: ドクターペッパー イアン博士チャールズ Gerba - アリゾナ大学所
示す著者: アレックス Wassimi

ウイルスは、真核生物と原核生物に感染する生物学的実体のユニークなグループです。代謝能力を持たず、宿主細胞の内部自己組み立てるウイルスの部品を生産する宿主の代謝に依存して、レプリケートするために義務づける寄生虫です。

ウイルスが極微、光学顕微鏡、電子顕微鏡のより高い解像度でのみ表示で閲覧するのには小さすぎます。ウイルスの粒子は DNA や RNA、蛋白質の亜単位または capsomers から成るキャプシドと呼ばれるタンパク質のコートに囲まれた核酸のゲノムから成っています。いくつかのより複雑なウイルスのキャプシドはさらに脂質エンベロープに囲まれた、スパイクのような表面の付属肢や尾があります。

人間や動物の腸管に感染するウイルスは、腸管系ウイルスと呼ばれます。彼らは、糞便中に排泄され、排水から分離することができます。細菌に感染するウイルス、バクテリオファージ、として知られている、大腸菌に感染するものは coliphages (図 1) をいいます。大腸菌の細菌のファージは、大腸菌が見つかったどこでも発見されています。

図 1。ファージ T2。

バクテリオファージは、生物学的システムの重要なコンポーネントであるために、環境科学で研究されています。地球上最も豊富な生物学的存在、物質循環、食物網のプロセス制御細菌集団を助けるだけで遺伝子の水平伝達を介して原核生物多様性を高めるためにであります。ファージがまた fecally-送信される試金するが病気の原因となる腸管系ウイルスの信頼できる代理指標であるという証拠もあります。バクテリオファージを列挙する比較的迅速かつ安価な方法の有効性は環境試料中の糞便汚染の評価のための魅力的なツールをさせます。

水の Coliphages は、成長のログの段階でソフトにサンプルまたはエシェリヒア属大腸菌の文化と一緒にオーバーレイを寒天培地の添加によって試金されます。ファージは細菌の細胞に接続し、細菌を溶解させます。細菌は、合流の芝生のエリア、バクテリオファージの成長し、細菌の分離を除いて成長を生成します。これらの結果の明確な領域は、プラークと呼ばれます。軟寒天培地のオーバーレイは、細菌の溶解、時に彼らは、隣接する細菌細胞に広がることができるように、ウイルスの物理的な拡散を制限する使用されます。

最適な歯垢の形成を取得するには、ホスト細菌が成長のログの段階であることが重要です。これにより、すべてのバクテリオファージ細菌を生活し、子孫を生成を添付します。これはホストの細菌の文化がアッセイを行う毎日を準備する必要があります。通常、文化は静止した段階になりますので、アッセイの前日を培養です。試金のためのログの段階に十分なホストの細菌を取得する孵ったスープを接種する試験の日、カルチャが使用されます (これは通常、35-37 ° C で揺れ水浴で 2-3 時間を必要です)。

1. 下水やファージを含む水のサンプルを取得します。
2. サンプル 1:10 と 1: 100 Tris バッファーを使用して希釈します。Tris バッファー 9 mL に文化の 1.0 mL を転送し、2 番目の十倍の希薄によってこれを行います。
3. スチームバスやオートクレーブにそれらを置くことによって軟寒天培地 (0.7% 寒天またはトリプチ豆乳寒天培地 3 mL チューブあたり) の 3 つの管を溶かします。
4. 45 ° c. に調整する寒天培地の温度を許可するように 15 分間 45-48 ° c の水浴の寒天を配置します。
5. 最初のチューブにエシェリヒア属大腸菌¹と原液のサンプル 1 mL のログ相スープ文化の 1 mL を追加します。
6. 水浴と軽く 2-3 s の懸濁液を混合する手の間ロックからチューブを削除します。
7. ペーパー タオルの管から水を拭くし、下の寒天 (通常寒天またはトリプチ豆乳寒天) を含む事前に準備されたペトリ皿に寒天を注ぐ。
8. すぐに上の寒天を広めるためプレートを回転させます。寒天は、全体の表面を覆うことを必ずください。
9. 軟寒天培地、細菌と各サンプル希釈 (図 2) 1 mL に 1 mL を使用しての他の 2 つの管で手順 5-8 を繰り返します。
10. 寒天が固化した後、シャーレを反転し、48 h. ノック、シャーレのふたを水分の 37 ° C で孵化させなさい。プラーク落ちる湿気の寒天培地の表面に広がるウイルスが発生します。
11. 、孵化後各希釈 (図 3) 上のプラークの数をカウントし、元のサンプルのバクテリオファージの集中を計算します。サイズや斑の外観の主要な相違点を記録します。

図 2。ファージ列挙体の上の寒天を使用して細菌の芝生の準備のための手順。

図 3。細菌の芝生のバクテリオファージのプラク。

¹大腸菌の菌株 ATCC 15597 通常下水試料からプラクの最大の番号が生成されます。栄養やトリプチ醤油スープ 100 mL を含む 250 mL 三角フラスコで一晩と 35 ° c. に条件を振って下培養それ成長する必要があります。3 h のファージ アッセイする前に 100 mL の栄養やトリプチ醤油スープと 35-37 ° C で揺れ水お風呂の場所を含む新鮮なフラスコにこの文化の 1 つの mL を接種します。これは成長のログの段階で細菌がいる保証されます。

下水試料の希釈 = 10^-1

得られるプラークの数 = 9

したがって、バクテリオファージ濃度下水サンプル
= 10 × 9 ÷ 1 mL
= 90 プラーク形成単位/mL

未処理下水が通常 10 を含む³ -10 の範囲で、mL 当たり 10⁴ファージ² -10 mL あたり⁸ 。

環境指標としての coliphages の多くの潜在的なアプリケーションがあります。下水の汚染、水や排水処理の効率と腸管系ウイルスおよび環境中の細菌の存続の指標としての使用が含まれます。検出の容易さのため魅力的なずっと存在の指標と腸内細菌と動物ウイルスの動作としてバクテリオファージの使用と低コストのバクテリオファージの試金に関連付けられています。さらに、彼らは数日あるいは数週間の腸内ウイルスと比較して 24 時間以内の環境試料中定量化することができます。

¹大腸菌の菌株 ATCC 15597 通常下水試料からプラクの最大の番号が生成されます。栄養やトリプチ醤油スープ 100 mL を含む 250 mL 三角フラスコで一晩と 35 ° c. に条件を振って下培養それ成長する必要があります。3 h のファージ アッセイする前に 100 mL の栄養やトリプチ醤油スープと 35-37 ° C で揺れ水お風呂の場所を含む新鮮なフラスコにこの文化の 1 つの mL を接種します。これは成長のログの段階で細菌がいる保証されます。