ピグの腰椎カテーテル挿入のための外科的技術により、ターミナルセットアップで髄腔嚢への継続的なアクセスが可能

最終研究プロトコルの一部として、生後3か月のデンマークランドレース豚にL4-L5レベルで腰椎カテーテルを挿入する技術を提示し、髄嚢からの継続的な注入またはCSFサンプリングを可能にします。

ブタは、ブタとヒトの中枢神経系(CNS)との間に解剖学的および生理学的類似性があるため、薬理学的CNS研究の大型動物モデルとしてますます使用されています。しかし、従来の腰椎穿刺技術による大型ブタ品種の脳脊髄液(CSF)へのアクセスは、脊髄突起の斜めの向きと限られた層間空間のために困難な場合があります。したがって、この研究では、ブタのL4 / L5レベルでの連続的なCSFサンプリングのために腰椎カテーテルを挿入するための開腹手術手順が詳細に説明されています。ブタを配置し、解剖学的ランドマークを特定した後、背側正中線の外科的切開を行い、棘突起を露出させます。イントロデューサーニードルを前進させることにより、脊椎の骨構造をそのままに、脊柱カテーテルを脊柱管の髄嚢内に挿入します。この方法では、ブタ髄腔嚢への連続注入またはブタ髄腔嚢からのサンプリングが可能で、出血やCSFの漏れが最小限に抑えられます。この手技は、シンプルで時間効率が良く、さまざまな実験セットアップで再現性があるため、薬物動態研究、外科トレーニング、脊髄損傷モデルなど、さまざまな前臨床試験に大きな可能性を秘めています。

動物モデルは、倫理的または実際的な制限により、人間を対象とする疾患を調査したり、外科的方法をテストしたりできない場合に不可欠です。げっ歯類は低コストであるために一般的に使用されますが、その翻訳関連性は人間との大きな違いによって制限されます¹。しかし、ブタはげっ歯類と比較して、特に中枢^{神経系研究の}文脈において、解剖学的および生理学的にヒトとの類似性など、いくつかの利点を提供します^1,2。イヌモデルは歴史的にCNS研究の実験モデルとして機能してきましたが、近年では倫理的な配慮によりイヌの使用が制約されています³。さらに、ブタの臓器のサイズが人間に匹敵するため、外科研究や手技訓練での使用が促進されます⁴。ブタの中枢神経系と脊椎は、脳と脊髄の構造と機能において類似性があり、人間のそれと密接に類似しています^1,5,6。重要なことに、ブタの脊柱と脊柱管の寸法は、ブタを外科的処置トレーニング^9,10、薬物浸透11,12,13、および脊髄損傷¹⁴を含むさまざまな前臨床試験^7,8に適したものにします。

ブタモデルにおけるCSFへのアクセスは、多くの実験設定において非常に重要です。腰椎穿刺は、単一のCSFサンプリングまたは髄腔内薬物投与の方法を提供しますが、繰り返しの腰椎穿刺は実用的ではありません。それらは、脊髄内血腫、神経損傷、および血液によるCSF汚染の潜在的なリスクをもたらします。人間の患者では、脊髄マイクロカテーテルは動脈瘤性くも膜下出血の連続腰椎CSFドレナージに一般的に使用され、サイズの類似性により、ブタの連続CSFサンプリングにも同様に適しているはずです。しかし、ブタの種特異的な解剖学的違いは、CSFへのアクセスに独自の課題を提示します。たとえば、重なり合う椎弓板、骨化した靭帯、および豊富な硬膜外脂肪組織の存在により、従来の経皮的腰椎穿刺技術の信頼性が低下します¹⁵。ゲッティンゲンのミニブタでは、低侵襲の経皮的方法が採用されており、これにより連続的なCSFサンプリングが可能になった¹⁶。この方法は、腰椎椎間腔の手動識別に依存しており、カテーテル挿入自体はイントロデューサーの視覚化なしに行われます。しかし、この技術は、脊椎サイズ、棘突起、および硬膜外脂肪組織の量の解剖学的変動により経皮的カテーテル法がより困難になるため、より大きなブタにはあまり適していません¹⁵。したがって、脊椎の露出を伴うより侵襲的な方法は、信頼性の高いカテーテル留置を確保するために、より大きなブタモデルで必要になる場合があります。

この原稿の目的は、脊髄カテーテルをブタ髄嚢にL4/L5レベルで挿入する外科的手順を説明することです。この手順には、被験者の位置決め、解剖学的ランドマークに基づく外科的切開の計画、およびカテーテル挿入前の脊椎の後骨構造へのアクセスが含まれます。

被験者は、デンマーク動物実験検査官(ライセンス番号2020-15-0201-00401)の承認の下で、現地の規制に準拠して収容されました。対象情報:家畜豚、雌、約40kg、生後3ヶ月。

1.被験者の住居と術前絶食

1. 適切な順応を確保し、ストレスを軽減するために、手順の少なくとも 14 日前に、承認されたハウジング ペンで 12 時間の明暗サイクルでグループの被験者を収容します¹⁷。
2. 逆流のリスクを減らすために、被験者が計画された麻酔の 12 時間前に食物離脱レジームを行っていたことを確認してください。被験者の食事にアルファルファまたは他の種類の干し草が含まれている場合、これは胃内容排出時間をさらに遅らせる可能性があるため、手順の2〜3日前に食事から除外する必要があります¹⁸。

2.麻酔とモニタリング

1. ケタミン 6.25 mg/mL、ゾラゼパム 6.25 mg/mL、チレタミン 6.25 mg/mL、ブトルファノール 1.25 mg/mL、キシラジン 6.25 mg/mL (ゾレチル) の混合物を 2 mL/10 kg 体重の筋肉内注射で被験者に麻酔します。
2. 体温調節をサポートするために、被験者を加熱ブランケットの上に仰臥位に置きます。
3. サイズ 6.5 チューブ¹⁹ で被験者を挿管し、非加湿空気、8-10 mL/kg の潮汐量、および 6.0 kPa <の呼気終末 CO₂ 濃度に従って 16-22 呼吸/分の呼吸数で機械的に換気します。
   注:CO₂ の測定値は、チューブの正しい気管内位置を確認します。
4. 3%-4%の気化セボフルラン¹⁸を吸入して麻酔を維持します。
5. 麻酔中の乾燥を避けるために、眼科用軟膏を両側に注意深く塗布します。.
6. 10^分18分ごとに筋肉の弛緩と眼瞼の動きの欠如をチェックすることにより、十分な麻酔の程度を確保します。
7. 体温計付きの膀胱カテーテルを尿道¹⁹ を介して被験者の膀胱に挿入し、温度を監視し、尿を適切なカテーテルバッグに集めます。
8. 経皮的穿刺により、末梢静脈カテーテルを適切な表在性耳静脈に挿入し、研究終了時の持続生理食塩水 (NaCl、0.9%) 注入、薬物注入、および安楽死に使用します。
9. 大腿動脈カテーテル(6 Frシート)を経皮的穿刺を通じて右大腿動脈に挿入します。このアクセスは、継続的な侵襲的血圧モニタリングに使用します。
10. 手順全体を通して 5 分ごとに被験者のバイタル サインを監視します。
    注:バイタルサインには、脈拍、持続性侵襲性動脈血圧、膀胱内温度、および呼気終末_CO2 濃度が含まれます。

3.動物のポジショニング

1. 被験者を手術台の中央に腹臥位に置きます。脊柱側弯症を避けるために、被験者の背骨がまっすぐであることを確認してください。
2. 脊椎の腰椎面の下にサンドバッグを配置して、椎弓板間の角度を増やします。
3. トリマーで手術部位の毛を剃ります。
4. ヨウ素溶液を遠心パターンで手術部位に塗布します。手術部位全体が覆われるまで、このプロセスを繰り返します。
5. 被写体を少し傾けて直立させます。

4. 手術器具の準備

1. 材料表に記載されている手術器具を準備します。

5. 解剖学的に重要なランドマークの特定

1. 被験者の腰椎の両側にある腸骨稜を特定し、仙骨が特定されるまで輪郭を内側にたどります(図1)。
2. 仙骨の頭蓋面とL6の棘突起との間の正中線の椎間空間を特定します。
3. L6、L5、およびL4の棘突起を特定します(図1、 図2)。

6. 棘突起の露出

1. メス番号24を使用して、棘突起L4-L6に沿って正中線を切開し、皮膚と皮下組織を切断します。
2. モノポーラを使用して、表在静脈や細動脈からの小さな出血を焼灼します。
3. 外科用沼で血液を拭き取り、活発な出血がないか確認します。それに応じてモノポーラを使用してください。
   注:血腫を避けるためには、軽度の出血でも止めることが重要です。
4. 外科用リトラクターを挿入し、開口部を広げます。
5. 棘突起の背側にある棘上靭帯を特定します。
6. 棘突起の外側側面に沿ってモノポーラで切開部を徐々に拡大し、約1cmの棘突起が見えるまで拡大します(図3)。
   注:手順を実行する人が右利きの場合は、後で紹介者の挿入を容易にするために、棘突起の被験者の右側側面に従うことを検討する必要があります。
7. L4/L5の間の棘間靭帯を特定します(図3)。
8. 活発な出血がないか確認し、それに応じてモノポーラを適用して焼灼します。

7.髄嚢へのアクセス

1. 手動触診により、棘突起の椎弓板間のL4/L5椎間腔を特定します。
2. イントロデューサーを、L4/L5層内腔に向けられた頭蓋方向に向け、ベベルとルーメンを配置します(図2、 図4、 図5)。
3. イントロデューサーが水平30°、頭蓋傾斜45°に保たれていることを確認してください(図5)。
   注:L4 / L5の間の層内空間を目指してください。
4. 穏やかな抵抗が感じられるまで、イントロデューサーを徐々に進めます。これは、亜板靭帯を表しています。
   注:鈍い抵抗の感覚は、イントロデューサーが棘突起によって停止していることを示しています。これが発生した場合は、イントロデューサーを1cm引っ込めて、少し異なる傾きで再度進めてください。
5. しっかりとした、しかし非常に注意深い圧力をかけ、突然抵抗がなくなるまで、イントロデューサーをフラバム靭帯を通してミリメートルごとに進めます。
   注:被験者が腰部の筋肉組織または後肢に運動反射を示す場合、それは神経根との直接接触によるものであり、不十分な麻酔によるものではありません。
6. トロカールを取り外してイントロデューサーの各進行を追跡し、目に見えるCSFの流れを確認します。
7. イントロデューサーが亜層靭帯を貫通し、続いて硬膜を貫通した後のイントロデューサーからのCSFの流れを視覚的に確認することにより、イントロデューサーが脊柱管内に正しく配置されていることを確認します。
   注:CSFの自発的な流れは遅くなる可能性があります。確認は、イントロデューサーに滅菌生理食塩水を充填し、脈動を観察することで迅速化できます。
8. カテーテルの準備中にCSFが過度に失われないように、トロカールをイントロデューサーに再挿入します。

8. 髄嚢へのカテーテルの挿入

1. ガイドワイヤーをカテーテルに挿入します。
2. トロカールをイントロデューサーから取り外します。
3. ガイドワイヤーを含むカテーテルを、穏やかな抵抗が感じられるまでイントロデューサーに挿入します。
4. イントロデューサーから遠位5cmを測定し、サージカルマーカーでマークを付けます。
5. カテーテルが髄嚢に進入するときに、前に測定したマークがイントロデューサーに到達するまで、穏やかでありながらしっかりと圧力をかけます。
   注: 髄質反射のため、被験者は十分に麻酔されているにもかかわらず、けいれん/動く可能性があります。
6. カテーテルを所定の位置に保持しながら、イントロデューサーを慎重に引っ込めます。
   注意: イントロデューサーが取り除かれるときに誤って配置されないように、カテーテルが皮膚の上に見えるようになったらすぐにカテーテルをしっかりと握ります。
7. カテーテルを皮膚の高さでしっかりと握ったまま、ガイドワイヤーを取り外します(図6)。
8. 2 mLの使い捨てプラスチックシリンジをカテーテルに取り付けます。.
9. カテーテルからの吸引CSFにより、脊柱管内の位置を確認します。
10. シリンジにCSFが不足している場合は、カテーテルを数ミリメートルゆっくりと引っ込めて開存性を回復します。
11. 脊髄カテーテルを外科用リトラクターと皮膚にテープで固定し、誤装着を防ぎます。

9. リポ多糖類の投与

1. 400 μgの 大腸菌 リポ多糖(LPS)(OH:143)を中心静脈シートに投与します。
2. タイマーを開始します。

10. CSFサンプリング

1. 次の 24 時間ごとに CSF サンプルを採取して、総白血球数、CSF-アルブミン、および CSF IgG を測定します。各サンプル中に最大0.5 mLのCSFを採取します。

11.安楽死

1. 末 ?? 静脈カテーテルを介してペントバルビタール(50 mg / kg)のボーラスを投与します。.
2. 心停止の確認として、呼吸用保護具の脈拍、血圧、および呼気終末 CO₂ 濃度曲線をフラットラインで観察します。

ブタの腹臥位は、腰椎への外科的アクセスを最適化します。支持性の土嚢を使用すると、隣接する腰椎棘突起間の角度が増し、脊柱管へのアクセスが改善されます。

本研究は、 大腸菌 リポ多糖類の脳室内接種後のCSFコンパートメント内の炎症反応を調査することを目的としていました。合計10頭のブタが手術を受け、その後のCSF分析により、平均総CSF白血球が0時間で30 x 10⁶ / L(範囲17-39)から12時間で19,720 x 10⁶ / L(11,353-30,546)に増加し、CSFアルブミン0.05 g / L(0.03-0.07)が0時間で0.05 g / L(0.03-0.07)から12時間で0.15 g / L(0.14-0.17)に増加したことが明らかになりました。提示された手法(図7)。本研究では、主要な解剖学的ランドマーク、特に腸骨稜、仙骨、およびL4、L5、L6の棘突起を使用して、切開前の椎骨正中線を正確に特定しました(図1)。皮膚と皮下組織を切開した後、棘上靭帯とL4、L5、L6の棘突起が露出し、解剖学的正中線が確認されました(図2)。棘突起の椎弓板の継続的な解剖と露出により、手動触診によるL4 / L5、L5 / L6、およびL6 / S1の間の椎間空間の特定が可能になりました。これらのスペースは、下にある脊柱管に近接しているため、解剖学的なランドマークとして特に適していました(図3)。

30°の水平および45°の頭蓋傾斜でイントロデューサーを徐々に挿入すると、髄嚢への正常な侵入が成功裏に行われ、CSFの目に見える自発的な流れによって確認されました。イントロデューサーの斜角が頭蓋を向くようにすることで、カテーテル挿入後のカテーテル挿入がスムーズになりました。ガイドワイヤーを取り外すと、カテーテルの適切な配置がCSFの吸引によって検証されました。手順の全体的な成功は、次の基準によって決定されました:(a)切開中に大きな出血が発生しなかった、(b)イントロデューサーは脊柱管に入るときに血液がなかった、(c)手術野にCSFの漏出がなかった、および(d)CSFはカテーテルから繰り返し吸引できました。

切開の初期段階では、組織の血管新生が良好であるため、軽度の出血が予想されます。より小さな動脈に頻繁に遭遇し、焼灼の必要性が浮き彫りになりました。また、外科用リトラクターは、圧力をかけて止血を達成するためにも使用されました。より深い切開では、小さな椎間静脈に遭遇することがあり、その位置のために制御が難しい場合がありました。この領域では圧力をかけたり焼灼したりすることが難しいため、このような静脈出血を避けるためには慎重な外科的技術が重要です。カテーテルは長期留置を目的としているため、血腫の形成を避けるために出血を防ぐことが不可欠でした。このような静脈出血の場合、止血は局所的な直接圧力で適用される綿状体によって達成することができる。

脊柱管の硬膜外腔の完全性は、カテーテルの周囲の組織に CSF 漏出がないか検査することによって評価されました。漏れは、組織に水のような液体が蓄積しているように見えます。この場合、処置中または処置後にCSFの漏出が観察されなかったため、カテーテルを囲む硬膜は無傷であることが確認されました(図6)。最後に、カテーテルによる一貫したCSF吸引により、髄嚢の腰椎槽内の正しい配置がさらに検証されました。

図1:手動触診によって特定された解剖学的ランドマークを持つブタの腰椎の写真。 仙骨、腸骨稜、およびL4、L5、およびL6の棘突起。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:後方の視点から視覚化されたブタの背骨の腰椎の3次元コンピューター断層撮影スキャン。 解剖学的ランドマークは、青(棘突起)、赤(腸骨稜)、緑(仙骨)で強調表示され、それぞれの脊柱管との関係(黄色)が示されています。イントロデューサの挿入ルートは、赤点線で強調表示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:L5とL6の露出した棘突起と隣接する棘間靭帯を側面から見た写真。 これらの棘突起の存在は、外科的開口部の正しい解剖学的位置を確認する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:ブタの背骨の腰椎の3次元コンピュータ断層撮影スキャンを横方向の視点から視覚化 。解剖学的ランドマークは、青(棘突起)、赤(腸骨稜)、緑(仙骨)で強調表示され、それぞれの脊柱管との関係(黄色)が示されています。イントロデューサの挿入ルートは、赤点線で強調表示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:後側的な視点から見たL4/L5層間空間に角度をつけたイントロデューサーの正しい位置の写真。 イントロデューサーは、フラバム靭帯が貫通するまでミリメートルごとに徐々に進める必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:L4/L5層間腔を介して脊柱管に挿入されたカテーテルの写真。 脊柱管内でのカテーテルの配置は、CSFを繰り返し吸引できる場合に確認されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:0時間、12時間、および24時間で測定された脳室内LPS接種後の総CSF白血球数(オレンジ)およびCSFアルブミン(青)の時間濃度グラフ。 この 図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ブタの連続 CSF サンプリングのための腰椎カテーテル挿入の実証された手順には、いくつかの重要なステップが含まれます。まず、カテーテル挿入を成功させるための最適な条件を確保するために、正しい椎体レベルを露出させる必要があります。ブタの脊髄は、L1-L2レベル²⁰で終わるヒトの円錐髄とは対照的に、ヒトと比較してさらに尾側に伸び、S2-S3レベル¹⁵に達します。その結果、CSFサンプリングのための腰椎貯水槽へのアクセスは、ブタ、特に脊髄が髄腔内空間の多くを占める高い腰椎レベルではより困難になります。私たちの経験では、L4 / L5またはL5 / L6レベルは、脊髄がこれらのセグメント²¹で脊柱管のわずかに小さい部分を占めるため、カテーテル挿入に適したセクションです。

ここで提示された外科的アプローチは、ゲッティンゲンのミニブタ¹⁶で経皮的腰椎穿刺を利用したBergadanoらによって開発された低侵襲CSF収集モデルのような低侵襲の方法とは対照的です。彼らの技術では、腰椎の椎間腔を手動触診によって特定し、水平方向に45°の傾斜でイントロデューサー挿入を目標としています。硬膜外腔内でのイントロデューサーの正しい配置の確認は、カテーテル挿入中の抵抗の喪失の認識に依存します。低侵襲技術は、組織の損傷を減らし、回復時間を短縮するという利点を提供しますが、デンマークのランドレースのような大型の豚種には潜在的な制限もあります。例えば、Pletichaらは、大型ブタにおける重なり合う椎弓板、骨化した靭帯、硬膜外脂肪の豊富さなど、いくつかの解剖学的特徴を特定しました。これにより、イメージングガイダンスなしでは腰椎穿刺の信頼性が低下します¹⁵。その結果、複数回の穿刺の試みが必要になる可能性があり、出血、CSF漏れ、およびCSFサンプルの血液汚染のリスクが高まります。

それに比べて、Pleticha et al. は、CT ガイド下側腰椎穿刺技術を成功裏に採用して、これらの解剖学的課題を克服し、より大きなブタで正確な髄腔内アクセスを達成しました¹⁵。イメージングガイダンスを利用する議論は、手動触診では必要な再現性を持つ解剖学的ランドマークを特定できないということです。したがって、正確な解剖学的同定のためには、画像ガイダンス(超音波や透視法など)が実際に必要である^15,22。Pleticha et al. によって提示されたこの横方向の方法は、イメージング機能を備えた施設で大きな利点を提供しますが、CT 機器が必要なため、すべての実験室環境で実現できるとは限りません。ここで説明する外科的方法は、より侵襲的ですが、CTイメージングにアクセスできない実験室で簡単に実施できる実用的な代替手段を提供します。このアプローチでは、棘突起と椎間腔を露出させることで、カテーテルが腰椎槽に入ることを直接視覚的に確認できるため、繰り返しの試行の必要性が減り、合併症が最小限に抑えられます。

もう一つの重要な考慮事項は、切開手術アプローチに関連する組織の損傷と術後合併症です。ここで説明する方法は、脊椎の優れた視覚化と信頼性の高いカテーテル留置を提供しますが、低侵襲技術と比較して、より多くの組織破壊を引き起こします。そのため、筋肉の完全性を維持し、感染リスクを減らすことが重要な生存研究への応用が制限される可能性があります。しかし、慎重な外科的技術と出血を制御するための単極性焼灼の使用により、術後合併症のリスクを最小限に抑えることができます。本手法は、ブタ10頭に 大腸菌 リポ多糖類を脳室内に接種した後の脳炎症の非生存研究で用いられたものですが、本手法は、配置したカテーテルの周囲に筋膜と皮膚を縫合することができるため、生存研究にも応用できると考えています。潜在的生存研究では、術後の段階で神経学的欠損または感染症の兆候がないか被験者を監視することが重要です。

全体として、ここで紹介する外科的方法は、低侵襲技術に比べていくつかの利点があります。このアプローチでは、脊椎の大部分を露出させることで、最初の試みでイントロデューサーとカテーテルを正確に配置できるため、血液によるCSF汚染のリスクが軽減され、一貫したCSFサンプリングが保証されます。私たちの経験では、この方法により、24時間にわたって約0.5 mL/hの速度でCSFを信頼性の高い収集が可能になります。CSFの流れが減少すると、カテーテルが数ミリメートルわずかに収縮すると、開存性が回復することがよくあります。さらに、術野を直接観察することで、CSFの漏出などの潜在的な合併症を検出することができます。この方法は、複数のカテーテルや追加の器具の埋め込みが必要になる可能性のある将来の研究にも柔軟性を提供します。

結論として、提示された方法はシンプルで再現性があり、ブタの脊髄に関連するさまざまな将来のブタモデル、特にブタの脊柱管の広範なCSFサンプリングまたは機器化を必要とするモデルに重要なアプリケーションがあると考えています。

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

著者は、デンマークのオールボー大学病院の生物医学研究所の職員が共有した経験に心から感謝したいと思います。