成体Xenopusにおける6つの重要な臓器を迅速にサンプリングする技術

この記事では、成人 のXenopus で迅速かつ簡単にアクセスできる6つの重要で多様な臓器(心室、肝葉、膵臓、脂肪体、対になった腎臓、皮膚)をサンプリングするためのガイドを提供します。

Xenopus は、100年以上にわたり、脊椎動物の発達と疾患を理解するための強力なモデル生物でした。胚の実験的分析および解剖技術は十分に文書化されていますが、成体の Xenopus の構造と器官の説明は、成体と協力するための技術とともに、定量的プロテオミクスやシングルセルトランスクリプトミクスなどの最新のアプローチの要件を考慮に入れて更新されていません。細胞型および遺伝子中心の視点では、胚期と成体組織での観察を対照的に行う必要があります。幼虫の臓器は、幼虫から成虫への移行全体にわたって、特に大規模な変態リモデリング中に、全体的な構造、形態、および解剖学的位置に大きな変化を遂げます。臓器の同定と解剖のための強固な基準を確立することは、異なる研究所で実施された研究から得られたデータセットの一貫性を確保するために重要です。現在のプロトコルでは、成人の Xenopusの6つの臓器を特定し、心臓の解剖とサンプリングの方法を実証しています 心臓室、肝臓、脂肪体、膵臓、対になった腎臓、および成人 のXenopusの皮膚。保存方法にもよりますが、解剖した臓器は、定量的プロテオミクス、単一細胞/核トランスクリプトミクス、 in situ ハイブリダイゼーション、免疫組織化学、組織学などに使用できます。このプロトコルは、組織サンプリングを標準化し、成体臓器系のマルチラボ調査を促進することを目的としています。

「成体のXenopusのデジタル解剖」^{は利用可能ですが}1、成体のXenopusの複製可能な臓器および組織サンプリングは、他の成体モデル(例:マウス^2,3,4)に利用可能な詳細な指示がなければ依然として困難です。この記事は、現在幼虫^に利用可能なものと同様に、成虫Xenopusの正確で複製可能な臓器サンプリングのための明確なガイダンスを提供することを目的としています5。完成のしやすさに重点が置かれ、最大限の鮮度を維持し、すべてのユーザーがプロトコルにアクセスできるようにします。

Rana ^sp.6の徹底的な解剖ガイドや、他の無尾類⁷の教室解剖ガイドは多数ありますが、Xenopusの解剖とサンプリングのガイドは現在利用できません。サンプリングの実践や両生類の解剖学に詳しくない人のために説明すると、Xenopusと他の無尾類とのわずかな違いにより、これらのリソースは複製可能な組織サンプリングには最適ではありません。

多くの貴重な組織は含まれておらず、現在のガイドには廃棄されています。これは、組織の鮮度を確保するためです。6つのサンプルは、ユーザーの経験やスキルレベルに関係なく、心臓が鼓動し始めてから1時間以内にこれらの組織を収集できることを保証するのに十分な制限があります。他の多くの組織を収集するためのより高度で詳細なガイドは、個別のコンパニオンペーパーとして準備中です。

経験の浅いユーザーの場合、このプロトコルは、交換が困難な動物(トランスジェニック、高齢の動物など)をサンプリングする前に、実験以外の理由で安楽死させられる動物で最初に試みることを常にお勧めします。理想的には、サンプリングされたすべての動物が健康であり、雌の場合は過去2週間に排卵していないことが望ましい。

すべての実験は、ハーバード大学医学部のIACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)(IS 00001365_3)の規則と規制に従って行われました。代表的な結果は、灌流された成熟したアルビノの雄と灌流されていない成熟アルビノの雄 Xenopus laevisの両方について示されています。

1. 実験の準備

注:サンプリング前に灌流プロトコル⁸ に従っている場合は、ステップ2.2にスキップしてください。

1. 研究機関がこのプロトコルに記載されている安楽死技術を承認していることを確認してください。
2. 5 g / L MS-222(メタンスルホン酸トリカイン)と5 g / L重炭酸ナトリウム( 材料の表を参照)の溶液を準備します。.容積は、安楽死させる動物を完全に覆うために必要な容積よりも大きくなければなりません。pHをチェックして、≥7であることを確認します。
3. Xenopusを安楽死溶液に入れることにより、一次安楽死を実行します。動物は合計1時間水中に留まります。
4. サンプリングの直後に、すべての組織をチルドPBSまたは0.7x PBS⁹ (実験ニーズによる)ですすぎ、チェックし、5倍(またはそれ以上)の倍率ライトでトリミングできるように、解剖ステーションを設定します。このステーションは、ユーザーがすべての鉗子とはさみを交換するか、使用の合間にきれいに拭くこともできる必要があります。
5. カエルが溶液に1時間入ると、一次安楽死が完了します。カエルを取り除き、足をつまむことで痛みの反応の喪失を確認します。
6. 動物の種類、系統、性別、年齢、健康状態、灌流されたかどうかなど、動物の適切な詳細を記録します。 Xenopus の重量を量り、鼻の通気口の長さなどの追加の測定を行います。
7. カエルを仰向けに置き、手足を体に近位に固定します(図1)。
8. 解剖ハサミを使用して、皮膚を切り取り、正中線を上向きに切り、次に横方向に切り込み、2つのフラップを作ります。
9. 図2を参照して、linea albaを特定し、鉗子を使用してそれをつかみ、体腔から引き離します。ハサミを使って筋肉組織を丁寧に切り取ります。キャビティ壁から2つのフラップを作ります。すべてのフラップを邪魔にならないようにカットまたはピンで留めます。
10. まだ鼓動している心臓を特定します。解剖ハサミを使用して烏口骨を減らし(図2)、心臓へのアクセスを改善します。
    注:サンプリング前に心臓の鼓動が止まった場合は、サンプルの鮮度が損なわれていることに注意する必要があります。

2. サンプリング

注:動物が灌流されている場合は、手順2.2にスキップしてください。

1. 細い心膜を特定し、組織鉗子でぴんと張ってください(図3)。
2. 虹彩切除術のはさみの先端を使用して、下にある組織を切らないように注意しながら、心膜に優しく穴を開けます。心膜を心臓の3つの心室から離して剥がします。
3. 鉗子を使用して心室を頂点でつかみ、心室が耳介と動脈幹に付着する場所を特定し(図4)、これらのアタッチメントの下で切断します(図5)。必要に応じて、心室をトリミングして、耳介または動脈幹からの組織が見えないようにし、明るい色の弁組織が心室内に見えるようにします。
   注:灌流されていない動物では、心室の除去は二次安楽死と見なされる場合があります。
4. 肝臓の3つの葉が見えます(図6 および 図7)。左葉の唇(視聴者の右側)をつかみ、肝管と嚢胞管が見えるようにゆっくりと持ち上げます(図8)。これらのアタッチメントの下にあるローブの底部1/3をサンプリングします(図9)。
5. 雌のカエルの組織へのアクセスを改善するには、卵巣を切除することが役立ちます。胚上皮と呼ばれる内臓腹膜の層に包まれている卵巣を特定します。ローブをそれぞれの側面に来るまでゆっくりと動かして、アタッチメントの領域が見えるようにします(図10)。これらのアタッチメントは、対になった腎臓に直接腹側にあります。
6. はさみを使用して、卵巣を傷つけずに腎臓にできるだけ近づけて卵巣を取り出します(図11)。
7. 肝臓の内側葉(前葉とも呼ばれる)を検査し、腸間膜および肝膵管(総胆管とも呼ばれる)を介して胃および十二指腸にどのように接続しているかを確認します(図6、 図7、 および図8)。
8. 腸間膜、虹彩切除ハサミを使用して肝十二指腸靭帯を切断し、十二指腸と出会う肝膵管を切断します。膵臓と肝膵管と肝臓の内側葉との接続を切断して、暗い肝臓組織が付着しないようにします(図12)。
9. 歯付き鉗子で胃をつかみ、組織鉗子で膵臓の上端をつかみます。5倍の倍率で、膵臓を胃からそっとからかいます(図13)。
   注:きれいに剥がれない場合は、残りの膵臓組織が見え、断片的に摘み取ることができます。あるいは、虹彩切除術のハサミや組織鉗子を使用して、膵臓を系統的に剥離することもできます。
10. 図14Aを参照して、膀胱を特定し、それを取り外し、総排泄腔にできるだけ近づけます。このティッシュを捨ててください。
11. 図14Bを参照して、大腸を特定し、それをぴんと張って、大腸を総排泄腔にできるだけ近づけて切断します。消化管全体を取り除いて廃棄し、脾臓に付着している腹膜を切断します。太った体は完全にアクセス可能になります。
12. 脂肪体がそれぞれの側に来るように、脂肪体をからかいます。脂肪体が腹膜につながっている腎臓の上の領域が見えます。左の脂肪体の基部(視聴者の右側)をつかみ、はさみを使用して腹膜から切り取り、腎臓が損傷しないように小さなマージンを残します(図15)。
13. 残った脂肪体を取り出して捨てます。ペアになった腎臓が完全に見えるようになります。
14. 雌のカエルまたは明確な痕跡卵管を持つ雄では、卵管をつかんで腎臓と総排泄腔から引き離します(図16)。卵管が総排泄腔と出会う場所で卵管を切断し、腎臓から引き離し続け、明らかな腹膜の付着物が明らかになったら切断します。このティッシュを捨ててください。
15. 残りの卵管でこのプロセスを繰り返します。
16. 腎臓はまだ透明な腹膜(後腹膜)で覆われています¹⁰。鉗子を使用して腎臓をつかみ、腹膜の下端を切断します。
17. 腎臓を体腔から持ち上げ、はさみを使用して、腎臓に損傷を与えることなく、腎臓にできるだけ近い腹膜を切断します(図17)。
18. 5倍の拡大で、余分な腹膜と他の残りの組織(脂肪体、脾臓)を切り取ります。カエルが雌の場合は、残っている卵巣組織がすべて除去されていることを確認してください(図18)。カエルがオスの場合は、精巣を慎重に取り外し、拡大しないと見えない可能性のある痕跡卵管を確認します(図19)。
19. 動物からピンを取り外し、腹側にひっくり返して、動物の手足を再度ピンで固定します。
20. サンプリングする後肢を選択し、その肢の足を固定します。
21. 腓腹筋/脛骨腓骨の上からアーモンド型の皮膚のフラップを取り除きます(図20)。

図1から図20を利用し、このプロトコルのすべてのステップに従うことにより、心室、肝臓の左葉、膵臓、左脂肪体、対になった腎臓、および皮膚のフラップを安楽死から1時間以内にきれいに切除しました。この時間内に、図21に示すように、サンプルが現れるようにサンプルをすすぎ、トリミングします。

図1:ピン留めされたXenopus。 成熟したメスのX.tropicalisが各手足に固定されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:腹壁。X. tropicalisの雌の腹側皮膚はフラップに切断され、白杖線と烏口骨が見えるようにします。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:心膜に囲まれた心臓。 心室の頂点は心膜を通してつかまれます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:心室と動脈幹。灌流されたX悶骨の心室がつかまれ、動脈幹への付着を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:ハート図。 心臓の関連する構造の図で、心室をサンプリングする場所を示す破線が付いています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図6:肝膵臓図。 肝臓、膵臓、および関連臓器の3つの葉の図。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図7:肝膵臓器官。 灌流されたアルビノのX.laevisオスで、肝臓、膵臓、および関連臓器の3つの葉がラベル付けされています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図8:嚢胞管と肝管。肝臓の左葉が持ち上げられ、灌流されたX.laevisの嚢胞管と肝管が見えます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図9:肝臓のサンプリング。灌流されていないX.tropicalisの左肝葉は、肝管の付着物の下で切断されています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図10:卵巣の付着。卵巣葉がそれぞれの側にあるため、胚上皮から腹膜壁(腎臓の上)までの連続性が見えます。2 本の白い破線は、これらのアタッチメントを切断する場所を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図11:卵巣の除去。灌流されていないX.laevisの卵巣は、対になった腎臓から引き離されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図12:間膜切開。灌流されていないX. laevisの体腔内、心臓室と肝臓の左葉のサンプリング、および卵巣の摘出後。白い破線は肝膵靭帯と管を切断する場所を示し、緑の破線は肝臓の内側葉から膵臓を切断する場所を示します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図13:膵臓のサンプリング。 灌流されていないX.laevisの膵臓が胃から摘み取られています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図14:臓器摘出。 (A)灌流されていないX.laevisの膀胱は、それを切る場所を示す破線で総排泄腔から引き離されます。(B)灌流されていないX.laevisの大腸は、総排泄腔から引き離されており、どこで切断するかを示す破線が付いています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図15:脂肪体サンプリング。 対になった腎臓の上端にある腹膜に付着した脂肪体は、体腔から引き出され、それらを切断する場所を示す破線で引き出されます。このアタッチメントに隣接して、このオスのX.tropicalisは1つの精巣と一対の明確な痕跡卵管を持っていることに注意してください。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図16:卵管の取り外し。 灌流されたX. laevisの卵管は、対になった腎臓から引き離され、透明な腹膜が見えるようになります。破線は腹膜を切開する場所を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図17:腎臓のサンプリング。 灌流されていないX. laevisの対になった腎臓は、体腔から持ち上げられています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図18:腎臓 のトリミング。 (A)灌流されていない雌の X. laevisの対になった腎臓と関連する腹膜器官の腹側図。(B)関連する臓器が切除されたが、腹膜組織が残っている同じ腎臓。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図19:精巣の除去。 灌流されていないX. tropicalisの対になった腎臓と1つの精巣を切除します。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図20:スキンサンプリング。 (A)X.tropicalisの右脚で、サンプリングする皮膚の領域を示す破線が付いています。(B)脛骨腓骨の上に皮膚サンプルを切除したX.tropicalisの右脚。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図21:臓器サンプリングの代表的な結果。灌流および灌流されていないアルビノX.laevisから採取した心室、肝臓、膵臓、脂肪体、対腎臓、および皮膚のサンプル。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

このプロトコルは鮮度を最大限に高めることを目的としているため、サンプルによっては望ましくない組織が含まれている場合があります。たとえば、肝膵管と一部の腸間膜は膵臓でサンプリングされ、一部の腹膜組織、副腎、および尿管は常に対になった腎臓でサンプリングされます。 鮮度が問題にならない場合は、修正された技術を使用してより正確なサンプリングを実現できます。

臓器の外観と位置は、 Xenopusの性別と種間で同等です。ただし、組織の色は、動物が灌流されているかどうかによって大きく異なります。このため、灌流された動物と灌流されていない動物の両方の画像が含まれています。

このプロトコルの制約は、目的の組織の全体を最もよく表すサンプルの収集よりも、速度と再現性が優先されることです。たとえば、ここでサンプリングされた肝臓の左葉のセクションは、肝臓組織の 3 つの葉すべてを適切に表すことはできません。サンプリングにエラーがある場合、トラブルシューティングのオプションは、組織の異なるセクション間で変動する可能性の影響を受けます。例えば、肝臓の右葉、右脂肪体、または皮膚の異なる部分が、所望の組織の機能的な代替手段となるかどうかは不明である。このような場合、組織の切片を置き換える前に、研究のニーズに基づいて裁量権を行使する必要があります。

このプロトコルの別の制限は、サンプリングされる動物が重大な解剖学的欠陥または臨床的に重大な健康上の問題を抱えている場合、体腔内の臓器がここで説明したように表示されない可能性があることです。Mycobacterium spp.11,12に感染したカエルの組織に肉芽腫が見つかっており^、卵巣過剰刺激症候群の以前の症例では、臓器の異常な提示につながるようです¹³。

この方法は実験室の Xenopusのために開発されましたが、多くの非盲腸両生類と四肢の爬虫類のこれらの器官の外観には大きな類似点があります¹⁴。このプロトコルのサンプリング部分は、ウーパールーパーやグリーンアノールなどの他のモデルに簡単に変更できます。

著者は、競合する利益を宣言しません。

この研究は、NIHのODグラントR24OD031956によって支援されました。Samantha Jalbert、Jill Ralston、Cora Andersonの支援とサポート、および有益なフィードバックを提供してくださった編集者と匿名の査読者に感謝します