細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

この実験プロトコルでは、乳がん細胞および組織サンプルからのBCSCの単離、ならびにBCSCの表現型と機能を評価するために使用できるin vitro および in vivo アッセイについて説明します。

乳がん幹細胞(BCSC)は、遺伝性または後天性の幹細胞のような特徴を持つがん細胞です。頻度が低いにもかかわらず、乳がんの開始、再発、転移、治療抵抗性の主な原因です。乳がんを治療するための新しい治療標的を特定するためには、乳がん幹細胞の生物学を理解することが不可欠です。乳がん幹細胞は、CD44、CD24などのユニークな細胞表面マーカーの発現およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)の酵素活性に基づいて単離および特徴付けられます。これらのALDH^高CD44⁺CD24^- 細胞はBCSC集団を構成し、下流の機能研究のために蛍光活性化セルソーティング(FACS)によって単離することができます。科学的問題に応じて、異なるインビ トロ および インビボ の方法を使用して、BCSCの機能的特性を評価することができます。ここでは、乳がん細胞の不均一な集団と乳がん患者から得られた原発腫瘍組織の両方からヒトBCSCを単離するための詳細な実験プロトコルを提供します。さらに、BCSC機能の評価に使用できるコロニー形成アッセイ、マンモスフェアアッセイ、3D培養モデル、腫瘍異種移植アッセイなど、下流のin vitro および in vivo 機能アッセイを強調しています。

ヒト乳がん幹細胞(BCSC)の細胞的および分子的メカニズムを理解することは、乳がん治療で直面する課題に取り組むために重要です。BCSCの概念の出現は21^世紀初頭にさかのぼり、CD44 ⁺ CD24^-/低乳がん細胞の小さな集団がマウスで不均一な腫瘍を生成できることが判明しました^1,2。その後、アルデヒドデヒドロゲナーゼの酵素活性が高い(ALDH^high)ヒト乳がん細胞も同様の幹細胞様特性を示すことが観察され^ました3。これらのBCSCは、自己複製および分化が可能な細胞の小さな集団を表し、バルク腫瘍の不均一な性質に寄与する¹、^2、3。進化的に保存されたシグナル伝達経路の変化がBCSCの生存と維持を促進することを示唆する^証拠の蓄積4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 .さらに、細胞外因性微小環境は、異なるBCSC機能を指示する上で極めて重要な役割を果たすことが示されている15^、16、17。これらの分子経路とBCSC機能を調節する外的要因は、乳がんの再発、転移¹⁸、および治療に対する耐性の発達に寄与しており19,20,21、治療後のBCSCの残存存在は、乳がん患者の全生存に大きな課題をもたらします^22,23。.したがって、これらの因子の前臨床評価は、乳がん患者のより良い治療結果と全生存期間の改善を達成するために有益である可能性のあるBCSC標的療法を特定するために非常に重要です。

いくつかのインビトロヒト乳癌細胞株モデルおよびインビボヒト異種移植片モデルが、BCSCを特徴付けるために使用されています²⁴、^25、26、^27、28、29。連続継代のたびに細胞株が継続的に再増殖する能力により、これらはオミクスベースおよび薬理ゲノム研究を実施するための理想的なモデルシステムになります。しかし、細胞株は、患者サンプルで観察された不均一性を再現できないことがよくあります。したがって、細胞株データを患者由来のサンプルで補完することが重要です。BCSCを最も純粋な形で単離することは、BCSCの詳細な特性評価を可能にするために重要です。 この純度を達成することは、BCSCに特異的な表現型マーカーの選択に依存します。 現在、ALDH^高CD44 ⁺ CD24^-細胞表現型は、最大純度の蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して、バルク乳がん細胞集団からヒトBCSCを区別および分離するために最も一般的に使用されています^1、3,26。さらに、自己複製、増殖、分化などの単離されたBCSCの特性は、in vitroおよびin vivo技術を使用して評価できます。

例えば、インビトロコロニー形成アッセイは、異なる処理条件^{30の存在下で50}個以上のコロニーを形成するために単一細胞が自己複製する能力を評価するために使用することができる。マンモスフェアアッセイは、足場非依存条件下での乳がん細胞の自己複製の可能性を評価するためにも使用できます。このアッセイは、無血清非接着培養条件における各連続継代において、単一細胞がスフェア(BCSCと非BCSCの混合物)として生成および増殖する能力を測定する³¹。さらに、3次元(3D)培養モデルを使用して、 in vivo 微小環境を厳密に再現し、潜在的なBCSC標的療法の活性の調査を可能にする細胞-細胞間および細胞-マトリックス相互作用を含むBCSC機能を評価できます³²。in vitroモデルの多様なアプリケーションにもかかわらず、in vitroアッセイのみを使用して in vivo 条件の複雑さをモデル化することは困難です。この課題は、マウス異種移植片モデルを使用して in vivoでのBCSC挙動を評価することで克服できます。特に、このようなモデルは、乳癌転移³³を評価し、疾患進行中の微小環境^{との相互作用を調査し34}、 in vivo イメージング³⁵、および抗腫瘍剤³⁴の患者特異的毒性および有効性を予測するための理想的なシステムとして役立つ。

このプロトコルは、不均一な乳がん細胞のバルク集団から最大純度でヒトALDH^高CD44 ⁺ CD24-BCSCを単離するための詳細な説明を提供します。また、3つのin vitro技術(コロニー形成アッセイ、マンモスフェアアッセイ、および3D培養モデル)と、BCSCのさまざまな機能を評価するために使用できるin vivo腫瘍異種移植アッセイの詳細な説明も提供します。これらの方法は、BCSC生物学の理解および/または新規BCSC標的療法の調査を目的として、ヒト乳がん細胞株または初代患者由来の乳がん細胞および腫瘍組織からのBCSCの単離および特性評価に関心のある研究者による使用に適しています。

同意した乳がん患者から直接患者由来の外科的または生検サンプルを収集することは、施設倫理委員会によって承認された承認された人間の倫理プロトコルの下で実施されました。患者由来の異種移植片モデルを生成するために使用されたすべてのマウスは、施設が承認した動物施設で維持および収容された。マウスを用いた患者由来の異種移植片モデルからの腫瘍組織は、施設動物管理委員会によって承認された承認された倫理プロトコルに従って生成された。

1. 細胞株の作製

1. バイオセーフティキャビネット内の無菌条件下ですべての細胞培養および染色手順を実行します。滅菌済みの細胞培養皿/フラスコおよび試薬を使用してください。
2. ヒト乳がん細胞を37°Cに維持し、ウシ胎児血清(FBS)および各細胞株に特異的に必要な成長因子を添加した定義培地に5%_CO2 を入れます。
3. マウスNIH3T3線維芽細胞培養物(コロニー形成アッセイに使用)を、10%FBSを添加したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中の5%_CO2 を用いて37°Cに維持します。
4. すべての文化について、2〜3日ごとに古いメディアに新しいメディアを補充します。培養物が75〜80%のコンフルエントに達したら、複数の滅菌細胞培養フラスコに継代培養する。

2.乳がん腫瘍組織の作製

1. 施設倫理委員会によって承認された人間の倫理プロトコルの下で、同意した乳がん患者から直接患者由来の外科的または生検サンプルを収集します。
2. 続いて、施設動物管理委員会によって承認された動物倫理プロトコルの下で、マウスを使用して患者由来の異種移植片モデルから腫瘍組織を収集して生成します。
3. 30 mL DMEM:F12培地を含む50 mL滅菌コニカルチューブに無菌条件下ですべての腫瘍組織を採取し、氷上に保ち、収集から2時間以内に以下に説明するようにサンプルを処理します。

3. 乳癌細胞の単一細胞懸濁液の生成

1. 60〜80%コンフルエントである乳癌細胞の単層(選択細胞株)を含むフラスコからの吸引培地。1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄します。PBSを吸引し、適切な細胞解離溶液(例えば、トリプシン:EDTA;細胞の単層を覆うのにちょうど十分)を加え、室温(推奨)または37°Cで5分間インキュベートします。
2. 5 mLの培地を添加して、細胞解離溶液の活性を中和します。
3. 得られた解離した細胞溶液を50 mLのコニカルチューブに移し、1000 x g で5分間遠心分離します。
4. 上清を捨て、細胞ペレットを5 mLの1x PBSに再懸濁しました。血球計算盤と顕微鏡を使用して細胞を数えます。
   注:血球計算盤で細胞の凝集を観察します。単一細胞懸濁液が形成されていない場合は細胞解離工程を繰り返す。
5. 細胞計数後、細胞懸濁液を1000 x g で5分間再遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットを1 x 10⁶ 細胞/mLの濃度のALDH基質バッファーに再懸濁します。

4. 組織サンプルからのシングルセル懸濁液の生成

1. 十字法を使用して外科用ブレードで腫瘍組織を細かく刻み、サイズが約1mmの小さな断片を取得します。組織片を、10 mLの解離バッファー(DMEM:F12の1Xコラゲナーゼ)を含む新しい50 mLコニカルチューブに移します。コニカルチューブをパラフィルムで密封し、シェーカーインキュベーター内で37°Cで40分間インキュベートします。
   注意: シェーカーインキュベーターがない場合は、チューブを37°Cの水浴に入れ、5〜10分ごとにボルテックスしてチューブを混合します。
2. サンプルを530 x g で5分間遠心分離することにより、消化された組織をペレット化します。上清を捨て、5mLのトリプシンを加える。1 mLピペット(750 μLマークに設定)を使用してピペットを上下にピペットし、ペレットを破壊し、37°Cの水浴中で5分間インキュベートします。インキュベーション後、ピペットで上下に激しく動かして単一細胞を放出します。
3. DMEM:F12培地でチューブ内の全容量を25 mLに補充し、1000 x g で5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを1 mLのディスパーゼ-DNase溶液に再懸濁します。37°Cの水浴中で5分間インキュベートします。
4. チューブ内の総容量をPBSで10 mLまで補充します。上下にピペッティングして混合し、得られた細胞懸濁液を新しい50 mLコニカルチューブに取り付けられた40 μmセルストレーナーに通します。1000 x g で5分間遠心分離します。
5. 上清を捨て、細胞ペレットを5 mLの1x PBSに再懸濁します。細胞をカウントし、ステップ3.4および3.5に記載されるように細胞懸濁液の調製を完了する。

5.乳がん幹細胞(BCSC)の分離

1. 非染色コントロール用のラベルフローチューブ、シングルセル染色コントロール(DEABコントロール、ALDH、CD44-PE、CD24-PE-Cy7、7AAD)、ネガティブコントロールチューブ(DEAB、CD44-PE、CD24-PE-Cy7および7AADで染色)、蛍光マイナス1(FMO)コントロール、および「ソート」チューブ(ALDH、CD44、CD24および7AADで染色)。
2. ステップ3.5またはステップ4.5の細胞懸濁液500 μL(0.5 x 10⁶ 細胞)を、細胞のみ、CD44、CD24、および7AADとラベル付けされた各チューブに移します。使用するまでチューブを氷の上に置きます。
3. 2 mLのサンプル(2 x 10⁶ セル)をそれぞれの「ALDH」チューブに移します。5 μLのDEABを「DEABコントロール」および「ネガティブコントロール」チューブに加え、しっかりと蓋をします。10 μLのALDH基質を「ALDH」チューブに加え、ボルテックスでよく混合し、すぐに500 μLを対応する「DEABコントロール」および「ネガティブコントロール」チューブに移します。「DEABコントロール」、「ネガティブコントロール」、および「ALDHチューブ」を要約し、37°Cで30〜60分間インキュベートします(60分を超えないでください)。
   注:最適なインキュベーション時間は、細胞株によっては最適化が必要な場合があります。ALDH基板と染色された細胞を含むチューブを常に光から保護してください。
4. インキュベーション後、すべてのサンプルを250 x gで5分間遠心分離します。細胞を500 μLのALDH基質バッファーに再懸濁します。メーカー推奨またはユーザー最適化濃度の抗CD44-PEおよび抗CD24-PE-Cy7抗体カクテルを加え、4°Cで30分間インキュベートします。抗CD44-PEおよび抗CD24-PE-Cy7抗体をそれぞれの「CD44」および「CD24」標識チューブに追加します。
5. インキュベーション後、すべてのサンプルを250 x g で5分間遠心分離します。細胞を500 μLのALDH基質バッファーに再懸濁します。「ネガティブコントロール」チューブ、「ソートチューブ」、および「7ADD」チューブを7AAD(推奨濃度:0.25 μg/1 x 10⁶ 細胞)で氷上で10分間インキュベートします。
   注:ALDH活性は緑色の蛍光チャネルで検出されるため、互換性のある発光スペクトルが異なる蛍光色素を使用する必要があります。マルチパラメーターフローサイトメトリー中にスペクトルのオーバーラップが観察される場合は、蛍光色素間の補正を可能にするためのガイドとして、蛍光シグナルの他のチャンネルへのこぼれを最小限に抑える必要があります。
6. サンプル分析の準備として、FACS機器の分析プロトコルを設定します。散布図を作成します(前方散乱対側散乱、前方散乱対蛍光チャネル)。
7. 無染色コントロールを使用して、光電子増倍管を調整して全細胞集団から破片を分離し、蛍光電圧を調整して、細胞集団全体を最初の対数スケール(10¹)の周りに移動します。DEABコントロールを使用して、緑色の蛍光電圧チャネルを調整することにより、細胞集団全体を第2の対数スケール(10²)内に移動します。
8. 最初にすべての単一染色コントロール(ALDH、CD44-PE、CD24-PE-Cy7)および7AADおよびFMOコントロールを分析し、電圧を調整して染色されていない細胞から染色細胞を分離し、他のチャネルへの蛍光シグナルのこぼれを最小限に抑えます。
9. 染色された各細胞サンプルの陽性集団のゲート。陰性対照管を用いて、生存率(7AAD陰性)のためのゲート、ALDH^低 およびALDH^高 細胞集団( 図1Bに示す代表的なゲーティング戦略)。
10. 目的のマルチパラメータ染色サンプルを分析して、BCSCを単離します。 生存可能なALDH^低ゲートおよびALDH^高ゲートを使用して、CD44⁺CD24-(BCSC)およびCD44-CD24⁺⁽非BCSC)細胞集団をそれぞれ選択します(図1B)。
11. 滅菌収集チューブ( 図2A&Bに示す2つの代表的な細胞株からの集団)の収集培地で生存可能なBCSCおよび非BCSCを収集する。以下に説明するように、下流のin vitro および in vivo アッセイに選別された細胞を使用してください。
    注:下記のインビ トロ および インビボ アッセイに加えて、BCSCは、標準的なイムノブロッティング技術を介してSOX2、OCT4、NANOGなどの多能性マーカーの発現を測定することによって検証できます。

図1:乳がん細胞株および組織サンプルからBCSCを単離するためのFACSゲーティング戦略。 (A)BCSC分離の手順を説明するフローチャート。(B)不均一な細胞プールから生存可能なBCSCおよび非BCSCを単離するために使用されるソート戦略を示す代表的なFACSプロット。MDA-MB-231ヒト乳癌細胞は、7-AAD、CD44-APC、CD24-PEおよびALDH基質と同時に標識される。細胞サブセットは、FACSマシン上で4色プロトコルを使用して分離されました。細胞は、予想される光散乱に基づいて選択され、次にシングレットについて、および生存率は7-AAD除外に基づいて選択されます。次に、細胞をALDH活性について分析し、最も陽性の高い上位20%をALDH^高集団として選択し、ALDH活性が最も低い下位20%の細胞をALDH^低集団と見なした。最後に、ALDH低細胞の50%がCD44^低/-CD24⁺表現型に基づいてさらに選択され、ALDH^高細胞の50%がCD44⁺CD24^-表現型に基づいて選択される。この図はChuら¹⁷から改作されたものである。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:BCSCの割合は、乳がん細胞株によって変動します。 図1に記載されるように標識および選別に続く(A)SUM159および(B)MDA−MD−468トリプルネガティブ乳癌細胞株におけるBCSCsおよび非BCSCsの差別割合を示す代表的な画像。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

6. コロニー形成アッセイ

1. 目的の細胞(ステップ5.11のソート済みセル、またはステップ3.5または4.5のソートされていないセル)を完全な培地に再懸濁します。
2. 1 x 10 2、2 x 10 2、および5 x 10²セルの3つのフローチューブにラベルを付けます。2 mLの完全培地を加え、適切な細胞番号(ステップ5.11でソートされた細胞、またはステップ3.5または4.5でソートされていない細胞)をそれぞれのチューブに移します。細胞溶液を5回上下にピペッティングして完全に混合します。
3. 細胞を6ウェルプレートにプレートし、プレートを穏やかに回転させて細胞懸濁液を分配し、細胞の均一な分布を得ます。
4. コロニーが現れるまで、プレートを37°C、5%_CO2 インキュベーター内でインキュベートする(ここで、コロニー=コロニー当たり≥50細胞)。コロニー形成を妨げることなく、週に2回慎重に培地を補充してください。
5. 培地を吸引し、1 mL PBSで1回洗浄します。0.5 mLの0.05%クリスタルバイオレット溶液を各ウェルに加え、プレートを30分間インキュベートします。2mLの水で洗って余分なクリスタルバイオレットの汚れを取り除きます。背景の汚れが除去されるまで、洗浄手順を繰り返します。
6. 4倍および10倍の倍率で顕微鏡を用いて、生成されたコロニーの総数をカウントおよび記録する( 図3Aに示す代表的な画像)。
7. コロニー形成の頻度を次のように計算します:頻度(%)=(形成されたコロニーの#/播種された細胞数)x 100。たとえば、1 x 10² 個の細胞から25個のコロニーが生成される場合、コロニー形成の頻度は、頻度=(25/100)x100 = 25%です。
8. あるいは、ステップ6.1から6.4を、必要な成長因子と生存因子の産生を通じてBCSCの微小環境サポートを提供する線維芽細胞との共培養を含む代替方法に置き換えます。
9. I型ウシコラーゲン(3 mg/mLコラーゲンの30分の1希釈)を含むプレコート細胞60 mm培養皿。コラーゲンを37°Cのインキュベーターで30分間重合させます。未重合コラーゲンを吸引し、1x PBSでプレートを2回洗浄します。コラーゲンコーティングプレートを1 mLのPBSで覆い、使用するまで室温で放置します。
10. 1 x 10 3、5 x 10 3、および1 x 10⁴セルの³つのフローチューブにラベルを付けます。4 mLのコロニー形成アッセイ培地を加え、適切な数の細胞(ステップ5.11から選別された細胞、またはステップ3.5または4.5から選別されていない細胞)をそれぞれのチューブに移します。照射したマウスNIH3T3線維芽細胞(4 x 10⁴細胞/mL培地)を追加します。細胞溶液を5回上下にピペッティングして完全に混合します。
11. ステップ6.1のコラーゲンコーティング培養皿からPBSを吸引し、ステップ6.3に記載されているように、細胞混合物を各細胞培養プレートにプレートします。
12. プレートを37°C、5%_CO2 インキュベーターでインキュベートし、培地を補充せずに、7〜10日間、またはコロニーが形成されるまで放置します。ステップ6.6および6.7の説明に従って、生成されたコロニーの総数をカウントして記録します。

7.マンモスフェアアッセイ

1. 目的の細胞(ステップ5.11の選別された細胞またはステップ3.5または4.5の選別されていない細胞)を、96ウェル超低接着細胞培養プレートに5 x 10² 細胞/^cm2 の領域を播種密度で完全なマンモスフェア培地およびプレート細胞に再懸濁します。
   注:細胞播種密度は、異なる細胞株に対して最適化する必要があります。
2. 培養プレートを5%_CO2を含む37°Cのインキュベーター内で5〜10日間インキュベートします。マンモスフェアの形成を妨げることなく、週に2回慎重にメディアを補充してください。
3. インキュベーション後、顕微鏡を使用して各ウェルで生成されたマンモスフェアの数を数えます。ここで、マンモスフェアは、直径100μmを超える乳がん細胞クラスターとして定義されます( 図3Bに示す代表的な画像)。
4. マンモスフェア形成効率(MFE)を次のように計算します:MFE(%)=(ウェルあたりのマンモスフェアの数)/(ウェルあたりに播種された細胞数)x 100(つまり、ウェル内の1 x 10² 細胞によって5つのマンモスフェアが生成される場合、MFE =(5/100)x 100 = 5%)。
5. マンモスフィアを継代培養するには、マンモスフェアの内容物を含む培地を新しい50 mLコニカルチューブと遠心分離機培地に1000 x g で5分間慎重に移します。上清を注意深く除去し、細胞ペレットを500 μLのトリプシンに再懸濁し、室温で5分間インキュベートします。
6. 上清を廃棄し、ペレットを1 mLの完全なマンモスフェア培地に再懸濁します。血球計算盤を使用して細胞をカウントし、ステップ7.1に記載されているように、超低付着細胞培養プレートで細胞を再プレートします。
   注:継代培養に加えて、マンモスフェア由来の細胞をFACSによってさらに分析して、BCSC表現型を評価したり、他のダウンストリームアッセイ用のBCSCの純粋な集団を取得したりすることもできます。
7. 細胞集団に含まれるマンモスフェア開始細胞の数を決定するには、球体限界希釈分析(SLDA)を含む別の方法を使用します。プレート細胞は、96ウェル超低接着細胞培養プレートで高細胞数から低細胞数の段階希釈を行い、最も高い希釈率で1ウェルあたり1細胞未満になります。
8. 培養プレートを5%_CO2 を含む37°Cのインキュベーターで10〜14日間インキュベートし、細胞の凝集を避けるために邪魔しないように放置します。
9. インキュベーション後、顕微鏡を使用して各ウェルで生成されたマンモスフェアの数を数えます。ここで、マンモスフェアは、直径100μmを超える乳がん細胞クラスターとして定義されます。極限希釈分析(ELDA)オンラインソフトウェア(http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)を使用して、球開始頻度と有意性を計算します。

8.3D培養モデル

1. 実験の質問に応じて、成長因子の有無にかかわらず基底膜抽出物(BME)を使用します(減少)。癌細胞に対する個々の成長因子の効果を評価するために、BMEを低下させた成長因子を使用する。また、BMEに存在する内因性成長因子の非特異的影響を最小限に抑えるのにも役立ちます。
   注:BMEは10°C以上で固化します。 解凍ステップの間でさえ、常にBMEを氷の上に置いてください。
2. 気泡を発生させずに96ウェルプレートにウェルあたり50 μLのBMEを慎重に添加し、37°Cで1時間重合させます。10分間のインキュベーション後、ゲル層の乾燥を避けるために100 μL PBSを追加します。
3. ステップ5.11の選別された細胞、またはステップ3.5または4.5の選別されていない細胞を、5 x 10³ 〜5 x 10⁴/200 μLの濃度で3D培地に再懸濁します。
4. BMEが重合したら、PBSを除去し、200 μLの細胞懸濁液を各ウェルに加え、5%_CO2を含む37°Cのインキュベーターでインキュベートします。培地の蒸発を防ぐために、周囲のウェルにPBSを追加します。
   注:実験の設定前に、めっきに最適な細胞数を決定する必要があります。実験の質問に応じて、BCSCは単独で、または他の細胞タイプ(線維芽細胞/内皮/免疫細胞など)と一緒に培養できます。
5. 週に2回、培養プレートに新鮮な培地を追加します。オルガノイドの形成を分析する前に、培養物を10〜14日間維持します( 図3Cに示す代表的な画像)。
6. 継代培養の場合は、培地を注意深く吸引し、細胞を含む各ウェルに200 μLのディスパーゼを加えます。プレートを37°Cのインキュベーターで1時間インキュベートします。インキュベーション期間の途中(30分)でプレートを取り出し、ディスパーゼ溶液を5回静かにピペットで上下させ、さらに30分間インキュベーターに戻します。
7. 1時間後、解離した細胞溶液をフローチューブに移す。2%FBS(fPBS)を含む1x PBSでウェルを洗浄し、フローチューブに移します。チューブを1000 x g で5分間遠心分離します。上清を注意深く吸引し、500 μLのトリプシンを加え、37°Cで5分間インキュベートします。等量のfPBSを添加してトリプシンを不活性化し、1000 x g で5分間遠心分離します。
8. 上清を廃棄し、ペレットを1 mLの3D培地に再懸濁します。細胞をカウントし、ステップ8.2〜8.4のようにBME内の必要な数のセルを再プレートします。
   注:複数のウェルをプールして、目的の細胞集団をさらに分析または分類することができます。

図3:BCSC細胞機能を評価するための インビトロ アッセイ。インビトロ アッセイは、プロトコルセクション6.1〜6.5(A)、7.1〜7.4(B)、または81に記載のとおりに実施した。を 8.4 + 8.6 (C) に設定します。(a)MDA-MB-231ヒト乳癌細胞により生成されたコロニーを示す代表的な画像;(B)MCF7、SUM159、またはMDA-MB-468ヒト細胞株および患者由来LRCP17乳癌細胞によるマンモスフェア形成を示す代表的な画像。(C)3D培養モデルにおけるMCF7およびMDA-MB-231乳癌細胞によって形成された3D構造を示す代表的な画像。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

注:施設動物管理委員会によって承認された動物倫理プロトコルに基づいて動物実験を実施してください。

9. 生体内 異種移植モデル

1. 乳がん幹細胞の腫瘍開始能力を決定するために、限界希釈アプローチを使用して細胞(ステップ5.7からの選別集団またはステップ3.5または4.5からの選別されていない集団)を調製する。1〜5つの異なる希釈グループを使用してPBSで細胞を連続希釈し、0.01〜0.2 x^{10 2} 細胞/ 100 μLから1 x 10⁶ 細胞/ 100 μLの用量で連続的に希釈します。
   注:ソートされていない/全体の母集団セルをコントロールとして使用できます。使用する希釈グループの数は、望ましい科学的結果によって異なります(たとえば、腫瘍原性のみを検査する場合は、より高い細胞数の1つのグループを使用できますが、腫瘍開始能を計算する場合は、5つの限界希釈用量をテストするのが最適です)。
2. ヒト乳がん細胞から異種移植片モデルを生成するには、免疫不全の雌マウス(胸腺ヌード[nu/nu]、非肥満糖尿病/重症複合免疫不全[NOD/SCID]またはNOD/SCID IL2γ[NGS]株)を使用します。
   注:グループごとに最低4匹の動物を使用できますが、特に限界希釈分析で堅牢な結果を得るには、グループあたり8〜12匹の動物をお勧めします。
3. バイオセーフティキャビネット内の無菌条件下で、各細胞調製物100 μL/マウスを使用して標準的な乳脂肪パッド(MFP)注射を実行します。
   注:最適な乳房腫瘍の成長と遠隔臓器への自発的転移のために、胸部MFPが推奨されます。あるいは、鼠径MFPも使用することができる。
4. 注射後、注射部位の一般的な健康状態と腫瘍の成長について、マウスを毎日監視します。触知可能な腫瘍が検出されたら、2つの垂直寸法のノギスによる腫瘍サイズの測定を開始し、エンドポイントまで毎週記録します。
   注:実験のエンドポイントは、制度的動物倫理プロトコルに定められた規制に基づいて決定されます。典型的には、安楽死によるエンドポイントは、通常、腫瘍体積が1500mm3に達すると必要とされる。BCSC集団および/またはより高い細胞用量(例:. >1 x 104細胞)、このエンドポイントはMFP注射から4〜8週間以内に到達する可能性があります。非常に低い細胞用量および/または非BCSC細胞集団の場合、腫瘍増殖は注射後最大8か月間進行させる必要があります。.
5. これらの測定値から、次の式を使用して腫瘍体積を計算します:mm³ 単位の体積= 0.52 x(幅)² x長さ。限界希釈アプローチを使用する場合は、ELDAオンラインソフトウェアを使用して腫瘍開始能力と有意性を計算します(http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/)。
6. あるいは、エンドポイントを人道的に延長するために、原発腫瘍を外科的に切除し、マウスの健康および/または遠隔臓器における自然転移の発症を監視し続けます。連続異種移植の生成のために切除された腫瘍組織を使用してください。
7. エンドポイントでは、原発腫瘍および遠隔臓器(リンパ節、肺、肝臓、脳、骨)から組織を採取し、組織病理学的および/または免疫組織化学的分析を実施するか、腫瘍組織を解離して、セクション6〜8に記載されているin vitroアッセイで使用します。

記載されたプロトコルは、細胞株または解離した腫瘍組織のいずれかからの乳癌細胞の不均一な集団からのヒトBCSCの単離を可能にする。特定の細胞株または組織サンプルについて、汚染された非BCSC集団が変動する可能性があるため、BCSCを最大純度で単離するための均一な単一細胞懸濁液を生成することが重要です。 厳格な選別戦略を適用すると、汚染された非BCSCの存在が最小限に抑えられ、乳がん細胞の割合を収集する能力が得られます。癌細胞のバルク集団と区別する細胞表現型を示す幹細胞のような特徴を持つ。ALDH酵素活性の増強、高レベルの細胞表面マーカーCD44を発現し、CD24の低/陰性発現を示すヒト乳癌細胞は、ALDH^高CD44⁺CD24^-表現型を有し、BCSCに分類することができる。バルク集団におけるBCSCの割合は、細胞株または患者によって異なる可能性があり(図2)、多くの場合、疾患の病期に依存し、より侵攻性の乳がんは通常、BCSCの割合が高くなります²⁶、^36、37。

単離されたBCSCは、異なるin vitro および in vivo アッセイを実行するために使用でき、その挙動および機能をバルクおよび/または非BCSC集団の挙動および機能と比較することができます。例えば、単一の乳癌細胞が自己複製し、50個の細胞のコロニーを生成する能力は、コロニー形成アッセイによって評価することができる(図3A)。足場に依存しない実験条件下でBCSCが自己複製する能力は、マンモスフェアアッセイによって評価でき、可変の球数、サイズ、および球開始能力を分析し、BCSCの存在と機能と相関させることができます(図3B)。最適な結果を得るには、さまざまな乳がん細胞株または乳がんサンプルの播種細胞密度を決定することが重要です。細胞密度が高いと細胞凝集につながり、細胞活性が誤って解釈される可能性があるため、これはSLDAを実行する場合に特に重要です。

BMEで乳がん細胞を培養することで、BCSCはin vivo条件を再現する3D構造を形成することができます(図3C)。線維芽細胞、内皮細胞、および/または免疫細胞などの他の微小環境細胞タイプの存在下での乳癌細胞の3D培養は、BCSCの3D増殖における微小環境の役割を調査するための追加の能力を有する^38,39。3Dオルガノイドの生成に必要な具体的な細胞数は、細胞株や患者の腫瘍源によって異なるため、大規模な実験の前に培養条件と細胞数を最適化することが重要です。

最後に、in vivoマウス異種移植片モデルを使用して、非BCSCまたはバルク細胞集団と比較したin vivoでのBCSCの成長(図4)の自己複製、分化、および/または腫瘍開始能力の違いを理解することができます。多くの場合、外因性因子または治療薬の存在下で観察されるin vitro細胞応答は、in vivo設定を代表するものではなく、in vitro観察は、可能な限りin vivo研究で補完されるべきであることを示唆しています。in vivo異種移植片モデルを使用すると、細胞の不均一性と腫瘍構造が保存されるため、これらのモデルは、ヒト患者の微小環境を厳密に模倣するシステムとして機能します。生体内LDAは、がん細胞の特定の混合集団(BCSCまたは非BCSC)における腫瘍開始細胞の割合を決定するために実行できます^40,41。使用される細胞希釈の範囲は最適化されるべきであり、目的の細胞集団における開始細胞の割合に依存する。理想的には、これらの希釈液には、腫瘍形成がなく、その間の妥当な範囲の細胞用量まで、100%の腫瘍形成をもたらす用量を含める必要があります。一次サンプル中の腫瘍開始細胞の頻度は変動する可能性があり、乳房腫瘍の数が非常に少ないか、腫瘍開始細胞の集団が非常に不均一である場合、LDAを実行することは特に困難な場合があります⁴²。このような場合、乳がんの生物学を理解するには、より多くの細胞を注入する方が適切です。

図4:BCSC機能を評価するためのin vivo異種移植アッセイ。MDA-MB-231乳癌細胞を、図1に記載されるようにFACSによって単離し、プロトコルセクション9.1〜9.8(5 x 10⁵細胞/マウス;4匹のマウス/細胞集団)に記載されているように、雌NSGマウスの右胸部乳腺脂肪パッドに注射した。原発性乳房腫瘍の成長動態は、ALDH^hiCD44 ⁺ CD24^-(■)集団とALDH低CD44^低/-CD24⁺⁽□)集団で示されています。データは平均±として表されるS.E.M. * =同じ時点でのそれぞれのALDH低CD44^低/-サブセットよりも有意に異なる腫瘍サイズ(P<0.05)。この図はクローカーら²⁶から改作された。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

乳がんの転移と治療に対する抵抗性は、世界中の女性の死亡の主な原因となっています。乳がん幹細胞(BCSC)の亜集団の存在は、転移の増強に寄与する26、^43、44、45、46および治療抵抗性²¹、^{47、48に寄与する}。したがって、将来の治療の焦点は、より良い治療結果を達成するためにBCSCを根絶することを目指すべきであり、これには、in vitroおよびin vivoの両方の方法を使用してBCSCの機能特性を単離および特徴付けるための正確な方法が必要です。

乳がんのさまざまなサブタイプに由来する不死化細胞株は、BCSC^26、49、50の単離と特性評価を含む乳がん生物学を研究するための実行可能なモデルであることが証明されています。細胞株の高い増殖能力と無制限の増殖能力は、再現性が高く、技術的に簡単な研究を行うための理想的なモデルシステムを提供します。しかし、細胞株のクローン起源のために、それらは異なる患者および/または腫瘍組織内の癌細胞によって示される不均一性を再現することができないかもしれない。さらに、遺伝子変異は、細胞株の連続継代中に獲得することができ、実験結果を混乱させる可能性のある遺伝子型または表現型の変化を誘発する可能性があります⁵¹。対照的に、初代患者由来細胞は、それらの限られた増殖および増殖能にもかかわらず、 インビボで観察されたものに対してより正確なモデルを提供し得る。ただし、このようなサンプルは、取得がより困難であり、技術的に扱いにくい場合があります。BCSCを分離して特性評価するための開始モデルシステムを選択する際には、これらすべての要素を考慮する必要があります。

FACSは、細胞表面マーカー発現に基づいて目的の細胞を単離するために一般的に使用される技術^です52,53。細胞表面抗原(CD44およびCD24)およびALDH酵素活性に基づいて、ヒトBCSCは乳がん細胞株および腫瘍組織の両方から高純度で単離することができる^1,2。選別効率は選別されたサンプルの純度を決定し、ユーザーは生存率色素とインキュベートされた選別されたサンプルのごく一部を分析して、選別の効率を確認することをお勧めします^53,54。選別効率は、細胞凝集塊の存在、多数の死細胞または死にかけている細胞、蛍光色素の不適切な補償、および/または事前選別解離ステップ中のトリプシンまたはコラゲナーゼに対する感受性による細胞表面抗原の損傷を含む多くの要因によって交絡する可能性があります^{53、54、55、56}.したがって、適切な単一細胞懸濁液の生成および適切な細胞解離技術の使用は、選別効率を高めるであろう。マルチパラメータセルソーティングを実行する際には、スペクトルのオーバーラップを最小限に抑える蛍光色素を選択することが重要です。スペクトルの重なりが避けられない場合、1つ(蛍光マイナス1、FMO)を除くすべての蛍光色素を含むコントロールを使用して、他のチャネル⁵⁴への蛍光シグナルのスピルオーバーを最小限に抑える必要があります。あるいは、スペクトルの重複は、目的の細胞の最終的なFACS単離の前に細胞集団を免疫磁気的に単離することによって減少させることができる⁵⁶。

このプロトコルに記載されているコロニー形成アッセイおよびマンモスフェアアッセイなどのインビトロアッセイは、BCSCの自己複製および増殖能力を研究するために広く使用されています^57、58、59、^60、61、62。さらに、これらのアッセイは、BCSC機能に対するさまざまな治療薬の活性を評価するために使用できます。いくつかの進化的に保存されたシグナル伝達経路がBCSC維持63に実装されており、コロニー形成64,65,66およびマンモスフェアアッセイ^64,67の両方が、BCSC内因性シグナル伝達を遮断し、BCSC活性および疾患進行を減少させるための介入として、これらの経路の治療的破壊の価値を評価するために使用されている。初代細胞を用いたコロニー形成アッセイは、細胞密度が低く、サンプル間のばらつきがあり、単離されたin vitro条件への適応性がないため、困難な場合があります。これらの課題は、BCSCを軟寒天層上で培養するか、コラーゲンコーティングされた細胞培養皿上で線維芽細胞と共培養することによって克服することができる^68,69,70。さらに、増殖因子を培地(FGF7⁷¹など)に添加することで、組織サンプルから単離した細胞のコロニー形成能力を向上させることもできます。加えて、単一細胞懸濁液生成ステップ中にコラゲナーゼまたはトリプシンを使用する組織の過剰消化は、コロニー形成能力を低くないしゼロにし、マンモスフェア形成効率を低下させる可能性がある³¹。どちらのアッセイでも、アッセイプレートが形成されているときにコロニーまたはスフェア構造が破壊されないように、アッセイプレートを乱さずにインキュベートするように注意する必要があります。また、初代細胞(細胞株と比較して)の培養期間を延長することは、これらの細胞がコロニーまたはスフェアを形成するのに時間がかかる可能性があるため、ユーザーが推奨します。

複数の証拠により、細胞外マトリックス(ECM)15、17、⁷²および線維芽細胞、免疫細胞、内皮細胞^、脂肪細胞などの間質成分がBCSC機能に影響を与える重要な役割が実証されています¹⁵。したがって、このプロトコルで説明する3D培養モデルは、in vitro設定でin vivo腫瘍微小環境を再現するのに役立つ有用な実験システムを提供できます。3D培養システムはがん患者の腫瘍微小環境によく似ていますが、オルガノイドとしての細胞の長期的な維持は困難な場合があります。さらに、3D培養条件の最適化と、BCSCの自己複製および分化能力を正確に調査する能力は挑戦的です⁷³。3D培養系で形成されたオルガノイドの効率は、培養培地⁷⁴に補充された成長因子に依存する。重要な成分(例えば、ROCK阻害剤)の不在は、オルガノイド形成の減少または無につながる可能性がある⁷⁴。培地は、最適な細胞機能と培養の持続可能性を維持するために、3〜4日ごとに補充する必要があります。in vivoの状態および応答を再現するためには、あらゆる種類の外因性処理の前に細胞がオルガノイドを形成できるようにすることが常に重要である⁷⁵。患者サンプルに由来する細胞は、特に目的が薬物応答の評価である場合、オルガノイドを形成するのに十分な時間を与えるべきである⁷⁵。

これらのin vitro法は、BCSC機能を特徴付けるための魅力的でアクセス可能な実験ツールですが、腫瘍の不均一性とBCSC行動に対する腫瘍微小環境の影響を完全に効果的に研究することはできません。したがって、これらのin vitroアッセイは、BSCS生物学および/または新規治療法への反応に関連する実験所見をさらに検証するために、可能な限りin vivo異種移植片モデルで補完する必要があります。異なるインビボモデルがBCSC造腫瘍性および転移の研究に使用されている。異所性(皮下生着)および同所性(MFP生着)マウスモデルは、乳房腫瘍を生成し、経時的な腫瘍増殖の縦断的変化を評価するために使用されています⁵⁰。両方のインビボ注射アプローチを使用してBCSC生物学を研究することができるが、MFPの天然間質および血管系関連成分は、患者で観察される原発性乳房腫瘍進行のより正確な再現を可能にするため、MFP注射が好ましい^76,77,78。最後に、免疫不全マウスの使用は、ヒトBCSCの生着および腫瘍増殖に必要であり、これは腫瘍形成および転移研究における免疫細胞の役割を組み込むことを妨げる⁷⁹。最近では、この制限は、異種移植片研究の開始前に骨髄移植によってヒト免疫系が再構成されるヒト化マウスの使用によって対処されている^80,81,82。ただし、これらのモデルは高価で技術的に困難であるため、まだ一般的に使用されていません⁸³。

要約すると、ここでは、乳がん細胞株と患者由来の腫瘍組織サンプルの両方からヒトBCSCを単離するためのプロトコルを提供しました。また、BCSCの機能を研究するために使用できるダウンストリームアッセイのin vitro および in vivo プロトコルについても説明し、さまざまな乳がん細胞ソースに最適化でき、さまざまな実験条件下で実行できる柔軟性を備えています。これらのプロトコルは、将来の患者の転帰を改善することを最終目標として、がん幹細胞、乳がん生物学、および治療法開発に関心のある研究者に役立ちます。

著者は開示するものは何もありません。

研究室のメンバーの有益な議論とサポートに感謝します。乳がん幹細胞と腫瘍微小環境に関する私たちの研究は、カナダがん研究協会研究所および米国陸軍国防総省乳がんプログラム(Grant # BC160912)からの助成金によって資金提供されています。V.B.はウエスタン・ポスドク・フェローシップ(ウエスタン大学)の支援を受けており、A.L.A.とV.B.はどちらもカナダ乳がん協会の支援を受けています。CLは、カナダ政府からのバニエカナダ大学院奨学金によってサポートされています。