Aislamiento y evaluación funcional de células madre de cáncer de mama humano a partir de muestras de células y tejidos

Este protocolo experimental describe el aislamiento de BCSC a partir de muestras de células y tejidos de cáncer de mama, así como los ensayos in vitro e in vivo que se pueden utilizar para evaluar el fenotipo y la función de BCSC.

Las células madre del cáncer de mama (BCSC) son células cancerosas con características similares a las células madre heredadas o adquiridas. A pesar de su baja frecuencia, son los principales contribuyentes al inicio del cáncer de mama, la recaída, la metástasis y la resistencia a la terapia. Es imperativo comprender la biología de las células madre del cáncer de mama para identificar nuevos objetivos terapéuticos para tratar el cáncer de mama. Las células madre del cáncer de mama se aíslan y caracterizan en función de la expresión de marcadores de superficie celular únicos como CD44, CD24 y la actividad enzimática de la aldehído deshidrogenasa (ALDH). Estas células ALDH^altasCD44 ⁺ CD24^- constituyen la población BCSC y pueden aislarse mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) para estudios funcionales posteriores. Dependiendo de la cuestión científica, se pueden utilizar diferentes métodos in vitro e in vivo para evaluar las características funcionales de las BCSC. Aquí, proporcionamos un protocolo experimental detallado para el aislamiento de BCSC humanas tanto de poblaciones heterogéneas de células de cáncer de mama como de tejido tumoral primario obtenido de pacientes con cáncer de mama. Además, destacamos los ensayos funcionales in vitro e in vivo posteriores, incluidos los ensayos de formación de colonias, los ensayos de mamosfera, los modelos de cultivo 3D y los ensayos de xenoinjerto tumoral que se pueden usar para evaluar la función de BCSC.

Comprender los mecanismos celulares y moleculares de las células madre del cáncer de mama humano (BCSC) es crucial para abordar los desafíos encontrados en el tratamiento del cáncer de mama. La aparición del concepto BCSC se remonta a principios^{del siglo} 21, donde se encontró que una pequeña población de CD44 ⁺ CD24 ^{/ células de} cáncer de mama bajo era capaz de generar tumores heterogéneos en ratones ^1,2. Posteriormente, se observó que las células de cáncer de mama humano con alta actividad enzimática de aldehído deshidrogenasa (^{ALDH alta}) también mostraron propiedades similares a las células madre³. Estas BCSC representan una pequeña población de células capaces de autorrenovarse y diferenciarse, contribuyendo a la naturaleza heterogénea de los tumores a granel ^1,2,3. La evidencia acumulada sugiere que las alteraciones en las vías de señalización conservadas evolutivamente impulsan la supervivencia y el mantenimiento de BCSC 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . Además, se ha demostrado que el microambiente extrínseco celular desempeña un papel fundamental en el dictado de diferentes funciones BCSC^15,16,17. Estas vías moleculares y los factores externos que regulan la función de BCSC contribuyen a la recaída del cáncer de mama, metástasis¹⁸ y desarrollo de resistencia a las terapias 19,20,21, siendo la existencia residual de BCSC después del tratamiento un gran desafío para la supervivencia global de pacientes con cáncer de mama^22,23 . Por lo tanto, la evaluación preclínica de estos factores es muy importante para identificar terapias dirigidas a BCSC que podrían ser beneficiosas para lograr mejores resultados de tratamiento y mejorar la supervivencia general en pacientes con cáncer de mama.

Se han utilizado varios modelos de líneas celulares de cáncer de mama humano in vitro y modelos de xenoinjertos humanos in vivo para caracterizar BCSC 24,25,26,27,28,29. La capacidad de las líneas celulares para repoblar continuamente después de cada paso sucesivo hace de estos un sistema modelo ideal para realizar estudios basados en ómicas y farmacogenómica. Sin embargo, las líneas celulares a menudo no logran recapitular la heterogeneidad observada en las muestras de pacientes. Por lo tanto, es importante complementar los datos de la línea celular con muestras derivadas de pacientes. El aislamiento de las BCSC en su forma más pura es importante para permitir la caracterización detallada de las BCSC. El logro de esta pureza depende de la selección de marcadores fenotípicos que son específicos de las BCSC. Actualmente, el fenotipo de células CD44⁺CD24^- altas de ALDH se usa más comúnmente para distinguir y aislar BCSC humanas de poblaciones de células de cáncer^demama a granel utilizando clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para una pureza máxima^{1, 3,26}. Además, las propiedades de las BCSC aisladas, como la autorrenovación, la proliferación y la diferenciación, se pueden evaluar utilizando técnicas in vitro e in vivo.

Por ejemplo, los ensayos in vitro de formación de colonias se pueden utilizar para evaluar la capacidad de una sola célula para autorrenovarse para formar una colonia de 50 células o más en presencia de diferentes condiciones de tratamiento³⁰. Los ensayos de mamosfera también se pueden utilizar para evaluar el potencial de autorrenovación de las células de cáncer de mama en condiciones independientes del anclaje. Este ensayo mide la capacidad de las células individuales para generar y crecer como esferas (mezcla de BCSC y no BCSC) en cada paso sucesivo en condiciones de cultivo no adherentes libres de suero³¹. Además, se pueden utilizar modelos de cultivo tridimensionales (3D) para evaluar la función de BCSC, incluidas las interacciones célula-célula y célula-matriz que recapitulan estrechamente el microambiente in vivo y permiten la investigación de la actividad de posibles terapias dirigidas a BCSC³². A pesar de las diversas aplicaciones de los modelos in vitro, es difícil modelar la complejidad de las condiciones in vivo utilizando solo ensayos in vitro. Este desafío puede superarse mediante el uso de modelos de xenoinjerto de ratón para evaluar el comportamiento de BCSC in vivo. En particular, tales modelos sirven como un sistema ideal para evaluar la metástasis del cáncer de mama 33, investigar las interacciones con el microambiente durante la progresión de la enfermedad 34, la imagen in vivo ³⁵, y para predecir la toxicidad específica del paciente y la eficacia de los agentes antitumorales ³⁴.

Este protocolo proporciona una descripción detallada para el aislamiento de ALDH^{humana alta}CD44 ⁺ CD24^- BCSC con la máxima pureza de poblaciones a granel de células heterogéneas de cáncer de mama. También proporcionamos una descripción detallada de tres técnicas in vitro (ensayo de formación de colonias, ensayo de mamosfera y modelo de cultivo 3D) y un ensayo de xenoinjerto tumoral in vivo que se puede utilizar para evaluar diferentes funciones de BCSC. Estos métodos serían apropiados para su uso por investigadores interesados en aislar y caracterizar BCSC de líneas celulares de cáncer de mama humano o células de cáncer de mama derivadas de pacientes primarios y tejido tumoral con el fin de comprender la biología de BCSC y / o investigar nuevas terapias dirigidas a BCSC.

La recolección de muestras quirúrgicas o de biopsia derivadas de pacientes directamente de pacientes con cáncer de mama que consintieron se llevó a cabo bajo un protocolo de ética humana aprobado y aprobado por la junta de ética institucional. Todos los ratones utilizados para generar modelos de xenoinjertos derivados de pacientes se mantuvieron y alojaron en una instalación animal aprobada por la institución. El tejido tumoral de modelos de xenoinjertos derivados de pacientes utilizando ratones se generó según el protocolo ético aprobado por el comité institucional de cuidado animal.

1. Preparación de líneas celulares

1. Realizar todos los procedimientos de cultivo celular y tinción en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad. Use platos/frascos y reactivos de cultivo celular estéril.
2. Mantener las células de cáncer de mama humano a 37 °C con 5% de_CO2 en medios definidos suplementados con suero fetal bovino (FBS) y factores de crecimiento necesarios específicos para cada línea celular.
3. Mantener cultivos de células de fibroblastos NIH3T3 de ratón (para uso en ensayos de formación de colonias) a 37 °C con 5% de_CO2 en el Medio de Águila Modificada (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de FBS.
4. Para todas las culturas, reponga los medios antiguos cada 2-3 días con medios nuevos. Una vez que los cultivos alcanzan el 75-80% de confluencia, subcultivo en múltiples frascos de cultivo celular estéril.

2. Preparación del tejido tumoral del cáncer de mama

1. Recolectar las muestras quirúrgicas o de biopsia derivadas del paciente directamente de pacientes con cáncer de mama que consintieron bajo un protocolo de ética humana aprobado por la junta de ética institucional.
2. Posteriormente, recolectar y generar tejido tumoral a partir de modelos de xenoinjertos derivados de pacientes utilizando ratones bajo un protocolo de ética animal aprobado por el comité institucional de cuidado animal.
3. Recoja todos los tejidos tumorales en condiciones estériles en un tubo cónico estéril de 50 ml que contenga 30 ml de DMEM:F12, manténgalo en hielo y procese las muestras como se describe a continuación dentro de las 2 h posteriores a la recolección.

3. Generación de suspensiones unicelulares de células de cáncer de mama

1. Medios de aspiración del matraz que contienen una monocapa de células de cáncer de mama que es 60-80% confluente (líneas celulares de elección). Lave las células con 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS). Aspirar PBS y añadir una solución de disociación celular adecuada (por ejemplo, tripsina:EDTA; lo suficiente para cubrir la monocapa de células) e incubar durante 5 min a temperatura ambiente (recomendado) o a 37 °C.
2. Añadir 5 ml de medios de cultivo para neutralizar la actividad de la solución de disociación celular.
3. Transfiera la solución celular disociada resultante a un tubo cónico de 50 ml y centrifugar a 1000 x g durante 5 min.
4. Desechar sobrenadante y resuspender el pellet celular en 5 mL de 1x PBS. Cuente las células con un hemocitómetro y un microscopio.
   NOTA: Observe la aglutinación celular en el hemocitómetro. Repita el paso de disociación celular si no se ha formado una suspensión de una sola célula.
5. Después del recuento celular, vuelva a centrifugar la suspensión celular a 1000 x g durante 5 minutos, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en el tampón de sustrato ALDH a una concentración de 1 x 10⁶ células/ml.

4. Generación de suspensión unicelular a partir de muestras de tejido

1. Picar el tejido tumoral con cuchillas quirúrgicas utilizando una técnica entrecruzada para obtener piezas más pequeñas de aproximadamente 1 mm de tamaño. Transfiera las piezas de tejido a un tubo cónico fresco de 50 ml que contenga 10 ml de tampón de disociación (1X colagenasa en DMEM: F12). Sellar el tubo cónico con parafilm e incubar a 37 °C en una incubadora agitadora durante 40 min.
   NOTA: Si no hay una incubadora agitadora, coloque el tubo en un baño de agua a 37 ° C y mezcle el tubo con vórtice cada 5-10 minutos.
2. Granular el tejido digerido centrifugando la muestra a 530 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y agregue 5 ml de tripsina. Pipetear hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 1 ml (ajustada a la marca de 750 μL) para interrumpir el pellet e incubar en un baño maría a 37 °C durante 5 min. Después de la incubación, pipetear hacia arriba y hacia abajo vigorosamente para liberar células individuales.
3. Recargue el volumen total en el tubo a 25 ml con medios DMEM: F12 y centrífuga a 1000 x g durante 5 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de solución de dispasa-DNasa. Incubar en un baño maría a 37 °C durante 5 min.
4. Aumente el volumen total en el tubo a 10 ml con PBS. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo, pasar la suspensión celular resultante a través de un filtro celular de 40 μm conectado a un tubo cónico fresco de 50 ml. Centrifugar a 1000 x g durante 5 min.
5. Desechar sobrenadante y resuspender la célula en 5 mL de 1x PBS. Contar las células y completar la preparación de la suspensión celular como se describe en los pasos 3.4 y 3.5.

5. Aislamiento de células madre de cáncer de mama (BCSC)

1. Tubos de flujo de etiqueta para el control no teñido, controles de tinción unicelular (control DEAB, ALDH, CD44-PE, CD24-PE-Cy7, 7AAD), el tubo de control negativo (teñido con DEAB, CD44-PE, CD24-PE-Cy7 y 7AAD), control fluorescente menos uno (FMO) y el tubo "sort" (teñido con ALDH, CD44, CD24 y 7AAD).
2. Transfiera 500 μL (0,5 x 10⁶ células) de las suspensiones celulares desde el paso 3.5 o el paso 4.5 a cada tubo que esté marcado solo con células, CD44, CD24 y 7AAD. Coloque los tubos sobre hielo hasta que los use.
3. Transfiera 2 ml de muestra (2 x 10⁶ células) al tubo 'ALDH' respectivo. Añadir 5 μL de DEAB a los tubos de «control DEAB» y «control negativo» y taparlo herméticamente. Añadir 10 μL de sustrato de ALDH al tubo «ALDH», mezclar bien mediante vórtice y transferir inmediatamente 500 μL al tubo correspondiente de «control DEAB» y «control negativo». Recapitular los «tubos de control DEAB», «control negativo» y «tubos ALDH» e incubar a 37 °C durante 30-60 min (no superar los 60 min).
   NOTA: El tiempo óptimo de incubación puede requerir optimización dependiendo de la línea celular. Proteja siempre del sustrato ALDH y de la luz los tubos que contienen células teñidas.
4. Después de la incubación, centrifugar todas las muestras durante 5 min a 250 x g. Resuspender las células en 500 μL de tampón de sustrato ALDH. Añadir una concentración recomendada por el fabricante u optimizada para el usuario de cóctel de anticuerpos anti-CD44-PE y anti-CD24-PE-Cy7 e incubar a 4 °C durante 30 min. Añadir anticuerpos anti-CD44-PE y anti-CD24-PE-Cy7 a los respectivos tubos marcados con «CD44» y «CD24».
5. Después de la incubación, centrifugar todas las muestras a 250 x g durante 5 min. Resuspender las células en 500 μL de tampón de sustrato ALDH. Incubar el tubo de "control negativo", el tubo "Sort" y el tubo "7ADD" con 7AAD (concentración sugerida: 0,25 μg/1 x 10⁶ células) durante 10 min en hielo.
   NOTA: La actividad de ALDH se detecta en el canal fluorescente verde, por lo tanto, se debe utilizar un fluorocromo con un espectro de emisión compatible diferente. Cuando se observa superposición espectral durante la citometría de flujo multiparamétrica, se deben usar controles de un solo color y control FMO como guía para permitir la compensación entre fluorocromos para minimizar el derrame de la señal fluorescente en otros canales.
6. Establecer el protocolo de análisis en el instrumento FACS en preparación para el análisis de muestras. Cree gráficos de dispersión (dispersión hacia adelante vs lateral, dispersión hacia adelante vs canales fluorescentes).
7. Usando el control no teñido, ajuste el fotomultiplicador para separar los desechos de la población celular total y ajuste el voltaje fluorescente para mover toda la población celular alrededor de la primera escala logarítmica (10¹). Usando el control DEAB, mueva toda la población celular dentro de la segunda escala logarítmica (10²) ajustando el canal de voltaje fluorescente verde.
8. Analice primero todos los controles de tinción individuales (ALDH, CD44-PE, CD24-PE-Cy7) y el control de 7AAD y FMO, ajustando el voltaje para separar las células teñidas de las no teñidas y minimizar el derrame de señales fluorescentes en otros canales.
9. Puerta en la población positiva para cada muestra de células teñidas. Usando el tubo de control negativo, puerta para viabilidad (7AAD negativo), ALDH^baja y ALDH^alta poblaciones celulares (estrategia de compuerta representativa que se muestra en la Figura 1B).
10. Analizar muestras teñidas multiparamétricas de interés para aislar BCSC. Utilizando las puertas ALDH^baja y ALDH^alta viables, seleccione la población celular CD44⁺CD24- (BCSC) y CD44-CD24⁺ (no BCSC) respectivamente (Figura 1B).
11. Recolectar BCSC viables y no BCSC en medios de recolección en tubos de recolección estériles (poblaciones de dos líneas celulares representativas que se muestran en la Figura 2A y B). Utilice células clasificadas para ensayos in vitro e in vivo posteriores, como se describe a continuación.
    NOTA: Además de los ensayos in vitro e in vivo que se describen a continuación, las BCSC pueden validarse midiendo la expresión de marcadores pluripotentes como SOX2, OCT4 y NANOG mediante técnicas estándar de inmunotransferencia.

Figura 1: Estrategia de activación del sistema de control de los bienes sobre el terreno para el aislamiento de BCSC de líneas celulares de cáncer de mama y muestras de tejido. (A) Diagrama de flujo que describe el procedimiento de aislamiento de BCSC. B) Gráficos representativos del sistema de control del terreno que muestren la estrategia de clasificación utilizada para aislar las BCSC y las no BCSC viables de un conjunto heterogéneo de células. Las células de cáncer de mama humano MDA-MB-231 se marcan simultáneamente con 7-AAD, CD44-APC, CD24-PE y el sustrato ALDH. Los subconjuntos de células se aislaron utilizando un protocolo de cuatro colores en una máquina FACS. Las celdas se seleccionan en función de la dispersión de luz esperada, luego para los singletes y la viabilidad basada en la exclusión de 7-AAD. Luego se analizan las células para determinar la actividad de ALDH y el 20% superior más positivo se selecciona como la población^alta de ALDH, mientras que el 20% inferior de las células con la actividad de ALDH más baja se consideró^{que era ALDH baja}. Finalmente, el 50% de las células^bajas de ALDH se seleccionan en función de un fenotipo CD44^{bajo /} -CD24 +, y el 50% de las células^altas de ALDH se seleccionan en función del fenotipo CD44 ⁺ CD24^-. Esta figura ha sido adaptada de Chu et ^al.17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Las proporciones de BCSC son variables en diferentes líneas celulares de cáncer de mama. Imagen representativa que muestra la proporción diferencial de BCSC y no BCSC en (A) SUM159 y (B) MDA-MD-468 líneas celulares de cáncer de mama triple negativo después del etiquetado y la clasificación como se describe en la Figura 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Ensayo de formación de colonias

1. Resuspenda las celdas de interés (celdas ordenadas del paso 5.11 o celdas sin ordenar de los pasos 3.5 o 4.5) en medios completos.
2. Etiquete tres tubos de flujo para 1 x 10 2, 2 x 10 2 y 5 x 10² celdas. Agregue 2 ml de medio completo y transfiera el número de celda apropiado (ordenado del paso 5.11 o celdas sin clasificar de los pasos 3.5 o 4.5) en los tubos respectivos. Mezcle bien las soluciones celulares pipeteándolas hacia arriba y hacia abajo 5 veces.
3. Coloque las células en una placa de 6 pocillos y distribuya la suspensión celular girando suavemente las placas para obtener una distribución uniforme de las células.
4. Incubar las placas en una incubadora de 37 °C, 5% de_CO2 hasta que aparezcan colonias (donde colonias = ≥50 células por colonia). Reponga cuidadosamente los medios dos veces por semana sin perturbar la formación de colonias.
5. Aspirar los medios y lavar una vez con 1 ml de PBS. Agregue 0.5 ml de solución de violeta cristalina al 0.05% en cada pocillo e incube la placa durante 30 minutos. Eliminar el exceso de manchas violetas cristalinas lavando con 2 mL de agua. Repita el paso de lavado hasta que se haya eliminado la tinción de fondo.
6. Usando un microscopio con un aumento de 4x y 10x, cuente y registre el número total de colonias generadas (imágenes representativas que se muestran en la Figura 3A).
7. Calcule la frecuencia de formación de colonias de la siguiente manera: Frecuencia (%) = (# de colonias formadas/número de células sembradas) x 100. Por ejemplo, si se generan 25 colonias a partir de 1 x 10² células, entonces la frecuencia de formación de colonias es, frecuencia = (25/100) x100 = 25%.
8. Alternativamente, reemplace los pasos 6.1 a 6.4 con un método alternativo que involucre el cocultivo con fibroblastos, que proporcionan un apoyo microambiental para las BCSC a través de la producción de los factores de crecimiento y supervivencia necesarios.
9. Placas de cultivo de células de precapa de 60 mm con colágeno bovino tipo I (dilución de 1 en 30 de 3 mg/ml de colágeno). Dejar que el colágeno polimerice durante 30 min en una incubadora a 37 °C. Aspirar el colágeno no polimerizado y lavar la placa dos veces con 1x PBS. Cubra la placa recubierta de colágeno con 1 ml de PBS y déjela a un lado a temperatura ambiente hasta que la use.
10. Etiquete tres tubos de flujo para 1 x 10 3, 5 x 10³ y 1 x 10⁴ celdas. Añadir 4 ml de medios de ensayo formadores de colonias y transferir el número adecuado de células (ordenadas del paso 5.11 o células no clasificadas de los pasos 3.5 o 4.5) a los tubos respectivos. Añadir fibroblastos NIH3T3 de ratón irradiados (4 x 10⁴ células/ml de medios). Mezcle bien las soluciones celulares pipeteándolas hacia arriba y hacia abajo 5 veces.
11. Aspirar el PBS de la placa de cultivo recubierta de colágeno del paso 6.1 y colocar la mezcla celular en cada una de las placas de cultivo celular como se describe en el paso 6.3.
12. Incubar las placas en una incubadora de 37 °C, 5% de_CO2 y dejarlas inalteradas durante 7-10 días o hasta que se formen colonias, sin reponer los medios. Cuente y registre el número total de colonias generadas como se describe en los pasos 6.6 y 6.7.

7. Ensayo de mamosfera

1. Resuspender las células de interés (células ordenadas del paso 5.11 o células no clasificadas de los pasos 3.5 o 4.5) en medios de mamosfera completos y células en placa a una densidad de siembra de 5 x 10^{2 células/} cm² área en una placa de cultivo celular de unión ultra baja de 96 pocillos.
   NOTA: La densidad de siembra celular debe optimizarse para diferentes líneas celulares.
2. Incubar las placas de cultivo durante 5-10 días en una incubadora a 37 °C con un 5% de_CO2. Reponga cuidadosamente los medios dos veces por semana sin perturbar la formación de la mamosfera.
3. Después de la incubación, contar el número de mamosferas generadas en cada pocillo usando un microscopio; donde las mamosferas se definen como grupos de células de cáncer de mama de más de 100 μm de diámetro (imágenes representativas que se muestran en la Figura 3B).
4. Calcule la eficiencia de formación de la mamosfera (MFE) de la siguiente manera: MFE (%) = (número de mamosferas por pozo)/ (número de células sembradas por pozo) x 100 (es decir, si 5 mamosferas son generadas por 1 x 10² células en un pozo, entonces MFE = (5/100) x 100 = 5%).
5. Para subcultivar mamosferas, transfiera cuidadosamente los medios que contienen contenido de mamosferas a un tubo cónico fresco de 50 ml y a un medio centrífugo a 1000 x g durante 5 min. Retire con cuidado el sobrenadante, resuspenda el pellet celular en 500 μL de tripsina e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente.
6. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de medio mamosphere completo. Contar las células con un hemocitómetro y volver a placar las células en una placa de cultivo celular de unión ultrabaja, como se describe en el paso 7.1.
   NOTA: Además del subcultivo, las células derivadas de la mamosfera también pueden ser analizadas más a fondo por FACS para evaluar el fenotipo BCSC y / u obtener poblaciones puras de BCSC para otros ensayos posteriores.
7. Para determinar el número de células iniciadoras de la mamosfera contenidas en sus poblaciones celulares, use un método alternativo que involucre el análisis de dilución limitante de esfera (SLDA). Células en placa en diluciones seriadas de números celulares altos a bajos en una placa de cultivo celular de unión ultra baja de 96 pocillos, con la dilución más alta que resulta en menos de una celda por pocillo.
8. Incubar la placa de cultivo durante 10-14 días en una incubadora a 37 °C con un 5% de_CO2 y dejarlos inalterados para evitar la agregación celular.
9. Después de la incubación, contar el número de mamosferas generadas en cada pocillo usando un microscopio; donde las mamosferas se definen como grupos de células de cáncer de mama de más de 100 μm de diámetro. Calcule la frecuencia y la importancia de iniciación de la esfera utilizando el software en línea Extreme Limiting Dilution Analysis (ELDA) (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/).

8.3D Modelo de cultura

1. Dependiendo de la pregunta experimental, use extracto de membrana basal (BME) con o sin factores de crecimiento (reducido). Para evaluar el efecto del factor de crecimiento individual en las células cancerosas, utilice el factor de crecimiento reducido BME. También ayuda a minimizar los efectos no específicos de los factores de crecimiento endógenos presentes en BME.
   NOTA: BME se solidifica por encima de 10 °C. Mantenga siempre BME en hielo incluso durante el paso de descongelación.
2. Añadir con cuidado 50 μL de BME por pocillo en una placa de 96 pocillos sin crear burbujas de aire y dejar que polimerice a 37 °C durante 1 h. Después de 10 minutos de incubación, añadir 100 μL de PBS para evitar el secado de la capa de gel.
3. Resuspender las células ordenadas del paso 5.11 o las células no clasificadas de los pasos 3.5 o 4.5 a una concentración de 5 x 10³ a 5 x 10⁴/200 μL en medios de cultivo 3D.
4. Una vez que el BME se haya polimerizado, eliminar el PBS, añadir 200 μL de suspensión celular a cada pocillo e incubar en una incubadora a 37 °C con 5% de_CO2. Agregue PBS a los pozos circundantes para evitar la evaporación de los medios.
   NOTA: El número óptimo de celdas para el recubrimiento debe determinarse antes de configurar el experimento. Dependiendo de la pregunta experimental, las BCSC se pueden cultivar solas o con otros tipos de células (fibroblastos / células endoteliales / inmunes, etc.).
5. Agregue medios frescos a las placas de cultivo dos veces por semana. Mantener los cultivos durante 10-14 días antes de analizar la formación de organoides (imágenes representativas que se muestran en la Figura 3C).
6. Para el subcultivo, aspire cuidadosamente el medio y agregue 200 μL de dispasa a cada célula que contenga pocillos. Incubar la placa en una incubadora a 37 °C durante 1 h. A mitad del período de incubación (30 min), saque el plato, pipete suavemente la solución de dispase hacia arriba y hacia abajo 5 veces y vuelva a colocarla en la incubadora durante otros 30 minutos.
7. Después de 1 h, transfiera la solución celular disociada a un tubo de flujo. Lave el pozo con 1x PBS que contenga 2% de FBS (fPBS) y transfiéralo al tubo de flujo. Centrifugar el tubo a 1000 x g durante 5 min. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante y añadir 500 μL de tripsina, incubar a 37 °C durante 5 min. Inactivar la tripsina añadiendo la misma cantidad de fPBS y centrifugar a 1000 x g durante 5 min.
8. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 ml de medios de cultivo 3D. Cuente las celdas y vuelva a colocar el número necesario de celdas en el BME como en los pasos 8.2 a 8.4.
   NOTA: Se pueden agrupar varios pozos para analizar o clasificar más a fondo la población celular de interés.

Figura 3: Ensayos in vitro para evaluar la función de las células BCSC. Los ensayos in vitro se realizaron como se describe en las secciones del protocolo 6.1 a 6.5 (A), 7.1 a 7.4 (B) u 81. a 8.4 + 8.6 (C). (A) Imagen representativa que muestra las colonias generadas por células de cáncer de mama humano MDA-MB-231; (B) Imágenes representativas que muestran la formación de mamosfera por líneas celulares humanas MCF7, SUM159 o MDA-MB-468, así como células de cáncer de mama LRCP17 derivadas de pacientes. (C) Imágenes representativas que muestran las estructuras 3D formadas por células de cáncer de mama MCF7 y MDA-MB-231 en modelos de cultivos 3D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

NOTA: Realizar experimentos con animales bajo un protocolo de ética animal aprobado por el comité institucional de cuidado animal.

9. Modelo de xenoinjerto in vivo

1. Para determinar la capacidad de iniciación tumoral de las células madre del cáncer de mama, prepare las células (población clasificada del paso 5.7 o poblaciones no clasificadas de los pasos 3.5 o 4.5) utilizando un enfoque de dilución limitante. Células diluidas en serie en PBS utilizando entre 1 y 5 grupos de dilución diferentes, con dosis tan bajas como 0.01-0.2 x 10² células/100 μL y tan altas como 1 x 10⁶ células/100 μL.
   NOTA: Las celdas de población sin ordenar/de toda la población se pueden utilizar como control. El número de grupos de dilución utilizados dependerá del resultado científico deseado (por ejemplo, si solo se prueba la tumorgenicidad, se puede usar 1 grupo con un número de células más alto, mientras que al calcular la capacidad de iniciación del tumor, es óptimo probar 5 dosis de dilución limitantes).
2. Para generar modelos de xenoinjerto a partir de células de cáncer de mama humano, utilice ratones hembra inmunocomprometidos (cepas athymic nude [nu/nu], diabetes no obesa/inmunodeficiencia combinada grave [NOD/SCID] o NOD/SCID IL2γ [NGS]).
   NOTA: Aunque se puede utilizar un mínimo de 4 animales por grupo, se recomienda 8-12 animales por grupo para obtener resultados sólidos, especialmente para limitar el análisis de dilución.
3. Realizar inyecciones estándar de almohadillas de grasa mamaria (MFP) utilizando 100 μL/ratón de cada preparación celular, en condiciones estériles en un gabinete de bioseguridad.
   NOTA: Para un crecimiento óptimo del tumor de mama y metástasis espontáneas a órganos distantes, se recomienda la MFP torácica. Alternativamente, también se puede utilizar la impresora multifunción inguinal.
4. Después de la inyección, controle a los ratones diariamente para determinar la salud general y el crecimiento tumoral en el sitio de la inyección. Tras la detección de un tumor palpable, comience a medir el tamaño del tumor con calibradores en dos dimensiones perpendiculares y registre semanalmente hasta el punto final.
   NOTA: El punto final experimental se determina con base en las regulaciones establecidas en el protocolo institucional de ética animal; Por lo general, el criterio de valoración por eutanasia generalmente se requiere una vez que los volúmenes tumorales alcanzan los 1500 mm³. Para poblaciones de BCSC y / o dosis celulares más altas (por ejemplo, >1 x 104 células), este punto final probablemente se alcanzará dentro de las 4-8 semanas posteriores a la inyección de MFP. Para dosis celulares muy bajas y/o poblaciones de células no BCSC, se debe permitir que el crecimiento tumoral progrese hasta 8 meses después de la inyección.
5. A partir de estas mediciones, calcule el volumen del tumor utilizando la siguiente fórmula: Volumen en mm³ = 0.52 x (ancho)² x largo. Si utiliza un enfoque de dilución limitante, calcule la capacidad y la importancia de iniciación del tumor utilizando el software en línea ELDA (http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/).
6. Alternativamente, para extender humanamente el punto final, extirpar quirúrgicamente los tumores primarios y continuar monitoreando la salud de los ratones y / o el desarrollo de metástasis espontáneas en órganos distantes. Utilizar tejido tumoral resecado para la generación de xenotrasplantes seriados.
7. Al finalización, extraer tejido de tumores primarios y órganos distantes (ganglios linfáticos, pulmón, hígado, cerebro, hueso) y realizar análisis histopatológicos y/o inmunohistoquímicos o disociar el tejido tumoral y utilizarlo en los ensayos in vitro descritos en las secciones 6-8.

El protocolo descrito permite el aislamiento de BCSC humanas de una población heterogénea de células de cáncer de mama, ya sea de líneas celulares o de tejido tumoral disociado. Para cualquier línea celular o muestra de tejido dado, es crucial generar una suspensión uniforme de una sola célula para aislar BCSC con la máxima pureza, ya que contaminar poblaciones no BCSC podría dar lugar a respuestas celulares variables, especialmente si el objetivo del estudio es evaluar la eficacia de los agentes terapéuticos dirigidos a BCSC. La aplicación de una estrategia de clasificación estricta minimizará la presencia de contaminantes que no son BCSC y dará como resultado la capacidad de recolectar la proporción de células de cáncer de mama con características similares a las células madre que muestran un fenotipo celular que las distingue de la población masiva de células cancerosas. Las células de cáncer de mama humano que exhiben una mayor actividad enzimática de ALDH, expresan altos niveles del marcador de superficie celular CD44 y expresión baja/negativa de CD24 tienen un fenotipo ALDH^altoCD44 ⁺ CD24^- y pueden clasificarse como BCSC. La proporción de BCSC dentro de la población a granel puede variar entre líneas celulares o pacientes (Figura 2), y a menudo depende de la etapa de la enfermedad, con cáncer de mama más agresivo que generalmente muestra una mayor proporción de BCSC^26,36,37.

Las BCSC aisladas se pueden usar para realizar diferentes ensayos in vitro e in vivo donde su comportamiento y función se pueden comparar con los de las poblaciones masivas y / o no BCSC. Por ejemplo, la capacidad de una sola célula de cáncer de mama para autorrenovarse y generar colonias de 50 células se puede evaluar mediante ensayos de formación de colonias (Figura 3A). La capacidad de las BCSC para autorrenovarse en condiciones experimentales independientes del anclaje puede evaluarse mediante ensayos de mamutosfera, donde el número variable de esferas, el tamaño y la capacidad de iniciación de la esfera se pueden analizar y correlacionar con la presencia y función de las BCSC (Figura 3B). Es importante determinar las densidades de células de siembra para diferentes líneas celulares de cáncer de mama o muestras de tumores de mama para obtener resultados óptimos. Esto es particularmente importante cuando se realiza SLDA, ya que las densidades celulares más altas podrían conducir a la agregación celular que resulta en una mala interpretación de la actividad celular.

El cultivo de células de cáncer de mama en BME permite a las BCSC formar estructuras 3D que recapitulan en condiciones in vivo (Figura 3C). El cultivo 3D de células de cáncer de mama en presencia de otros tipos de células microambientales como fibroblastos, células endoteliales y/o células inmunes tiene la capacidad adicional de investigar el papel del microambiente en el crecimiento 3D de BCSC^38,39. Los números de células específicos necesarios para generar organoides 3D pueden variar según la línea celular o la fuente del tumor del paciente, por lo que es importante optimizar las condiciones de cultivo y el número de células antes de cualquier experimento a gran escala.

Finalmente, los modelos de xenoinjerto de ratón in vivo se pueden utilizar para comprender las diferencias en el crecimiento (Figura 4) de autorrenovación, diferenciación y / o capacidad de iniciación tumoral de BCSC in vivo en comparación con las poblaciones no BCSC o células a granel. A menudo, las respuestas celulares in vitro observadas en presencia de factores exógenos o agentes terapéuticos no son representativas del entorno in vivo, lo que sugiere que la observación in vitro debe complementarse con estudios in vivo siempre que sea posible. Utilizando modelos de xenoinjertos in vivo, se preserva la heterogeneidad celular y la arquitectura tumoral y, por lo tanto, estos modelos pueden servir como un sistema que imita de cerca el microambiente en pacientes humanos. In vivo La LDA se puede realizar para determinar la proporción de células iniciadoras de tumores en una población mixta dada de células cancerosas (BCSC o no BCSC)^40,41. El rango de diluciones celulares utilizadas debe optimizarse y dependerá de la frecuencia de las células iniciadoras en la población celular de interés. Idealmente, estas diluciones deben incluir dosis que resulten en una formación tumoral del 100%, hasta dosis celulares sin formación de tumores y un rango razonable en el medio. La frecuencia de células iniciadoras de tumores en muestras primarias puede ser variable, y en los casos en que los tumores de mama tienen números muy bajos o poblaciones heterogéneas de células iniciadoras de tumores, la realización de LDA puede ser particularmente difícil⁴². En estos casos, inyectar un mayor número de células sería más apropiado para comprender la biología del cáncer de mama.

Figura 4: Ensayos de xenoinjerto in vivo para evaluar la función de BCSC. Las células de cáncer de mama MDA-MB-231 se aislaron mediante FACS como se describe en la Figura 1 y se inyectaron en la almohadilla de grasa mamaria torácica derecha de ratones NSG hembra como se describe en las secciones 9.1 a 9.8 del protocolo (5 x 10^{5 células}/ratón; 4 ratones/población celular). Se muestra la cinética de crecimiento del tumor primario de mama para las poblaciones de ALDH^hiCD44⁺CD24- (■⁾ versus ALDH baja CD44^baja/-CD24⁺ (□). Los datos representados como la media ± S.E.M. * = tamaño tumoral significativamente diferente al de los respectivos subconjuntos^deCD44^{bajo CD44 bajo/-} en el mismo punto de tiempo (P < 0,05). Esta figura ha sido adaptada de Croker et ^al.26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La metástasis del cáncer de mama y la resistencia a la terapia se han convertido en la principal causa de mortalidad en las mujeres en todo el mundo. La existencia de una subpoblación de células madre de cáncer de mama (BCSC) contribuye a la metástasis mejorada 26,43,44,45,46 y la resistencia a la terapia^21,47,48. Por lo tanto, el enfoque de los tratamientos futuros debe apuntar a erradicar las BCSC para lograr mejores resultados de tratamiento, y esto requiere métodos precisos para aislar y caracterizar las características funcionales de las BCSC utilizando métodos in vitro e in vivo.

Las líneas celulares inmortalizadas derivadas de diferentes subtipos de cáncer de mama han demostrado ser modelos factibles para estudiar la biología del cáncer de mama, incluyendo el aislamiento y caracterización de BCSC 26,49,50. La alta capacidad proliferativa y la capacidad de expansión ilimitada de las líneas celulares proporcionan un sistema modelo ideal para realizar estudios que son altamente reproducibles y técnicamente sencillos. Sin embargo, debido al origen clonal de las líneas celulares, pueden no recapitular la heterogeneidad exhibida por diferentes pacientes y/o por las células cancerosas dentro del tejido tumoral. Además, las alteraciones genéticas pueden ser adquiridas durante el paso en serie de líneas celulares y pueden inducir cambios genotípicos o fenotípicos que pueden confundir los resultados experimentales⁵¹. En contraste, las células primarias derivadas del paciente, a pesar de su limitada capacidad proliferativa y de expansión, pueden proporcionar un modelo más preciso que el observado in vivo. Sin embargo, tales muestras pueden ser más difíciles de adquirir y ser más difíciles técnicamente para trabajar. Todos estos factores deben tenerse en cuenta al elegir un sistema modelo inicial con el que aislar y caracterizar las BCSC.

El FACS es una técnica comúnmente utilizada para aislar células de interés basada en la expresión del marcador de superficie celular^52,53. Basándose en antígenos de superficie celular (CD44 y CD24) y actividad enzimática de ALDH, las BCSC humanas pueden aislarse con alta pureza tanto de líneas celulares de cáncer de mama como de tejidos tumorales ^1,2. La eficiencia de clasificación determina la pureza de la muestra clasificada, y se recomienda que los usuarios analicen una pequeña porción de la muestra clasificada incubada con colorante de viabilidad para verificar la eficiencia de la clasificación^53,54. La eficiencia de clasificación puede confundirse por muchos factores, incluida la presencia de grupos celulares, un alto número de células muertas o moribundas, una compensación inadecuada de los fluorocromos y / o daño a los antígenos de la superficie celular debido a la sensibilidad a la tripsina o colagenasa durante los pasos de disociación previos a la clasificación^53,54,55,56 . Por lo tanto, la generación de una suspensión unicelular adecuada y el uso de técnicas apropiadas de disociación celular aumentarán la eficiencia de clasificación. Al realizar la clasificación celular multiparamétrica, es importante elegir fluorocromos que minimicen la superposición espectral. En algunos casos, donde no se puede evitar la superposición espectral, se debe usar un control que contenga todos los fluorocromos excepto uno (fluorescencia menos uno, FMO) para minimizar el derrame de señales fluorescentes en otros canales⁵⁴. Alternativamente, la superposición espectral puede reducirse aislando inmunomagnéticamente las poblaciones celulares antes del aislamiento final por FACS de células de interés⁵⁶.

Los ensayos in vitro, como los ensayos de formación de colonias y mamosfera descritos en este protocolo, se han utilizado ampliamente para estudiar la auto-renovación y la capacidad proliferativa de las BCSC 57,58,59,60,61,62. Además, estos ensayos se pueden utilizar para evaluar la actividad de diferentes fármacos terapéuticos sobre la función de BCSC. Se han implementado varias vías de señalización conservadas evolutivamente en el mantenimiento de BCSC 63, y tanto los ensayos de formación de colonias 64,65,66 como los de mamosfera ^64,67 se han utilizado para evaluar el valor de la interrupción terapéutica de estas vías como una intervención para bloquear la señalización intrínseca de BCSC y reducir la actividad de BCSC y la progresión de la enfermedad. El ensayo de formación de colonias utilizando células primarias puede ser un desafío debido a la baja densidad celular, la variación entre muestras y la falta de adaptabilidad a condiciones aisladas in vitro. Estos desafíos pueden superarse cultivando BCSC en una capa de agar blando o cocultivándolos con fibroblastos en una placa de cultivo celular recubierta de colágeno^68,69,70. Además, complementar los factores de crecimiento en los medios de cultivo (como FGF7⁷¹) también podría mejorar la capacidad de formación de colonias de células aisladas de muestras de tejido. Además, la digestión excesiva del tejido utilizando colagenasa o tripsina durante el paso de generación de suspensión unicelular puede resultar en una capacidad de formación de colonias baja a cero y reducir la eficiencia de formación de mamosfera³¹. En ambos ensayos, se debe tener cuidado de incubar las placas de ensayo sin ser perturbadas para evitar la interrupción de las estructuras de colonias o esferas a medida que se están formando. También se recomienda que los usuarios extiendan el período de incubación de las células primarias (en relación con las líneas celulares), ya que estas células pueden tardar más en formar colonias o esferas.

Múltiples líneas de evidencia han demostrado el papel crítico de la matriz extracelular (MEC)15,17,72 y los componentes del estroma, como fibroblastos, células inmunes^, células endoteliales y adipocitos en la influencia de las funciones de BCSC ¹⁵. Por lo tanto, el modelo de cultivo 3D que describimos en este protocolo puede proporcionar un sistema experimental útil para ayudar a recapitular el microambiente tumoral in vivo en un entorno in vitro. Aunque el sistema de cultivo 3D se parece mucho al microambiente tumoral en pacientes con cáncer, el mantenimiento a largo plazo de las células como organoides puede ser difícil. Además, la optimización de las condiciones de cultivo 3D y la capacidad de investigar con precisión la auto-renovación y la capacidad de diferenciación de las BCSC es un desafío⁷³. La eficiencia de los organoides formados en el sistema de cultivo 3D depende de los factores de crecimiento suplementados en los medios de cultivo⁷⁴. La ausencia de componentes clave (por ejemplo, inhibidor de ROCK) podría conducir a una formación de organoides reducida o nula⁷⁴. Los medios deben reponerse cada 3-4 días para mantener una función celular óptima y la sostenibilidad del cultivo. Para recapitular las condiciones y la respuesta in vivo, siempre es importante permitir que las células formen organoides antes de cualquier tipo de tratamiento exógeno⁷⁵. Las células derivadas de muestras de pacientes deben estar dando tiempo suficiente para formar organoides, particularmente si el objetivo es evaluar la respuesta al fármaco⁷⁵.

Si bien estos métodos in vitro son herramientas experimentales atractivas y accesibles para caracterizar la función de BCSC, la heterogeneidad tumoral y el efecto del microambiente tumoral en el comportamiento de BCSC no se pueden estudiar con total efectividad. Por lo tanto, estos ensayos in vitro deben complementarse con modelos de xenoinjertos in vivo siempre que sea posible para validar aún más los hallazgos experimentales relacionados con la biología del BSCS y / o la respuesta a nuevas terapias. Se han utilizado diferentes modelos in vivo para estudiar la tumorigenicidad y metástasis de BCSC. Se han utilizado modelos de ratón ectópicos (injerto subcutáneo) y ortotópicos (injerto MFP) para generar tumores de mama y evaluar los cambios longitudinales en el crecimiento tumoral a lo largo del tiempo⁵⁰. Aunque ambos enfoques de inyección in vivo se pueden utilizar para estudiar la biología de BCSC, los componentes nativos relacionados con el estroma y la vasculatura de la MFP permiten una recapitulación más precisa de la progresión del tumor primario de mama como se observa en las pacientes, y por lo tanto se prefiere la inyección de MFP^76,77,78. Finalmente, el uso de ratones inmunocomprometidos es necesario para el injerto de BCSC humanas y el crecimiento tumoral, lo que impide incorporar el papel de las células inmunes en los estudios de tumorigénesis y metástasis⁷⁹. Más recientemente, esta limitación ha sido abordada mediante el uso de ratones humanizados en los que un sistema inmune humano se reconstituye mediante trasplante de médula ósea antes del inicio de estudios de xenoinjertos^80,81,82. Sin embargo, estos modelos son caros y técnicamente desafiantes, y por lo tanto todavía no se usan comúnmente⁸³.

En resumen, aquí hemos proporcionado un protocolo para el aislamiento de BCSC humanas tanto de líneas celulares de cáncer de mama como de muestras de tejido tumoral derivadas de pacientes. También hemos descrito protocolos in vitro e in vivo para ensayos posteriores que se pueden utilizar para estudiar la función de BCSC, con la capacidad de optimizarse para diferentes fuentes de células de cáncer de mama y la flexibilidad para realizarse en diferentes condiciones experimentales. Estos protocolos serán útiles para los investigadores interesados en las células madre del cáncer, la biología del cáncer de mama y el desarrollo terapéutico, con el objetivo final de mejorar los resultados de los pacientes en el futuro.

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecemos a los miembros de nuestro laboratorio por sus útiles discusiones y apoyo. Nuestra investigación sobre las células madre del cáncer de mama y el microambiente tumoral está financiada por subvenciones del Instituto de Investigación de la Sociedad Canadiense de Investigación del Cáncer y el Programa de Cáncer de Mama del Departamento de Defensa del Ejército de los Estados Unidos (Subvención # BC160912). V.B. cuenta con el apoyo de una beca postdoctoral occidental (Western University), y tanto A.L.A. como V.B. cuentan con el apoyo de la Sociedad de Cáncer de Mama de Canadá. C.L. cuenta con el apoyo de una beca de posgrado Vanier Canada del Gobierno de Canadá.