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ここで、腫瘍担持マウスへの移植後の抗血管新腫腫瘍関連好中球の治療可能性を示す。このプロトコルは、好中球活性ex vivoを操作し、その後、腫瘍の発達における生体内でその機能性を評価するために使用することができる。これは、潜在的な好中球ベースの免疫療法を研究するための適切なモデルです。
腫瘍形成の調節に対する好中球の寄与が注目を集めている。これらの細胞は不均一であり、腫瘍に応じて、プロまたは抗腫瘍能力を有することができる。腫瘍コンテキストにおける好中球機能を調節する重要なサイトカインの1つは、I型インターフェロンである。インターフェロンの存在下では、好中球は、細胞毒性または免疫系の刺激を含む抗腫瘍特性を得る。逆に、インターフェロンシグナル伝達の欠如は顕著なプロ腫瘍活性をもたらす、腫瘍血管新生の強い刺激を特徴とする。最近、好中球の血管新生作用は、これらの細胞におけるニコチンアミドリンオリボシルトランスフェラーゼ(NAMPT)シグナル伝達経路の活性化に依存することを実証することができた。腫瘍関連好中球におけるこの経路の阻害は、それらの強力な抗血管新生表現型をもたらす。ここでは、新たに確立されたモデルを実証し、腫瘍関連好中球(TAN)の腫瘍性電位の生体内評価を可能にする。まもなく、腫瘍に関連する腫瘍関連好中球は、腫瘍担持性インターフェロン欠損マウスから単離し、NAMPTシグナル伝達の遮断によって抗血管新生表現型に再分極することができる。これらの細胞の血管新生活性は、その後、大動脈環アッセイを用いて評価することができる。抗血管新生TANは、腫瘍を有する野生型レシピエントに転移することができ、腫瘍の増殖を14日間監視する必要があります。14日目にマウスを屠殺し、腫瘍を除去し、血管を評価して切断する。全体として、我々のプロトコルは、人工好中球細胞株モデルを使用する必要なしに、腫瘍関連好中球などの一次細胞の血管新生容量を生体内で評価するための新しいツールを提供する。Vc
タイプIインターフェロン(IFN)は、新生物に対する宿主応答の刺激において重要な役割を果たし、タイプI IFNシグナル伝達の欠如は腫瘍増殖を有意に上昇させる1.このプロセスに関与するメカニズムの1つは、腫瘍関連好中球の腫瘍活性の調節であり、これはコロニー刺激因子3受容体(CSF3R)下流シグナル伝達2によって制御される。コロニー刺激因子3(CSF3)、または顆粒球コロニー刺激因子は、ニコチンアミドホスオリボシルトランスフェラーゼ(NAMPT)3、4を含むシグナル伝達を活性化することが示された。NAMPTは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド合成のためのレート制限酵素であり、これは糖分解を増強し、DNA修復、遺伝子発現、および癌細胞の生存および増殖を促進するストレス応答を調節する5。NAMPTは、大腸、卵巣、乳房、胃、前立腺癌および神経膠腫6を含む複数の癌タイプで過剰発現される。NAMPTは、腫瘍細胞だけでなく、骨髄細胞などの腫瘍に存在する他の多種多様な細胞型に不可欠であり、その分化を促進し、アポトーシスを阻害し、複数のサイトカインの発現を刺激するか、マクロファージ7におけるマトリックス分解酵素。
腫瘍関連好中球は、腫瘍増殖の重要な調節因子を表す。TAN機能は、これらのサイトカインが好中球の主要な抗腫瘍活性として、I型IFNの利用可能性に強く依存する。反対に、IFNの不在は、これらの細胞、特に血管新生作用の腫瘍性活性化を支持する。これに合致して、IFNに欠損したマウスは、腫瘍/陽間異性好中球1、2、8、および強く浸潤している有意に大きく、より良い血管腫瘍を発症する。9,10.重要なことに、このような血管新生TANはNAMPTの活性の上昇を示し、好中球の腫瘍偏光にその重要な役割を示唆している。
Ly6G抗体を用いた好中球の枯渇またはそれらの移行の阻害(CXCR2抗体)は、腫瘍血管新生、増殖、および転移1、8の減少をもたらす。それにもかかわらず、生成されたモノクローナル抗体は免疫原性であり、その投与は生命を脅かす副作用の範囲と関連している11。好中球腫瘍原性を調節するNAMPT阻害剤FK866などの低分子による治療は、そのような合併症を回避するのに役立つ可能性がある。残念ながら、NAMPTの薬理学的全身阻害は、腫瘍増殖に対するその治療効果の隣に、胃腸毒性および血小板減少症を含む重篤な副作用をもたらす。したがって、NAMPT阻害剤の全身的な適用は、12、13、14では実現可能ではない。
このため、ここでは、NAMPT アクティビティが分離された TAN で直接ブロックされるプロトコルを提案します。このような抗腫瘍好中球は、次に、腫瘍担持宿主に採用的に伝達される。このプロトコルは、化合物の全身毒性副作用を回避するのに役立ちます, 標的細胞への影響が持続しながら、.
動物の被験者を含むすべての手順は、規制当局によって承認されています:LANUV(ランデサムト・フュール・ナチュラル、ウムウェルト・ウンド・ヴェルブラウシュツNRW)とレジエルンスプラシジウム・テュービンゲン。すべての操作は、滅菌試薬と器具(注射器、はさみ、鉗子、使い捨てメス、ペトリ皿)を使用して、滅菌条件(層状流フードの下で)で行われるべきです。
注: プロトコルの全体的なスキームを図 1に示します。
1. B16F10黒色腫細胞株の調製
2. マウスの同原性腫瘍モデル
3. TAN 分離
4. インビトロでのTANにおけるNAMPT阻害
5. 大動脈環アッセイを用いてのTANの血管新生特性の推定
6. 同種腫瘍モデルにおける治療好中球の導入移植
7. 腫瘍増殖測定、組織学的検査
ここで説明する手順を用いて、Ifnar1-/-好中球を腫瘍から単離し、2時間のNAMPT阻害剤FK866で処理した未処理のIfnar1-/-好中球を対照として用いた。治療の効果は、血管新生に関与する主要なステップ(マトリックス分解、移行、増殖、再編成)を反映する大動脈環状アッセイを用いて評価した。FK866処理された好中球は、未処理細胞と比較して大動脈枝形成を刺激する能力が有意に低下していることを示すことができる(図3A,3B)。FK866処理された抗血管新生好中球は、腫瘍を有するマウスに皮下注射した(0日目および2日目i.v.)。未治療のIfnar1-/-好中球を注射したマウスと比較して、腫瘍増殖を有意に損なうことができた(図4A,4B)。抽出された腫瘍の組織学的検査は、未処置のIfnar1-/--好中球を注射したものと比較して、FK866処置TANで処置されたマウスから単離された腫瘍における血管新生の有意な抑制を証明した(図 5A,B)
図 1.プロトコルのスキーム.手順 1.B16F10黒色腫細胞株の調製;2. マウスの同数腫瘍モデル;3. 腫瘍からのTANの分離;4. インビトロでのTANにおけるNAMPTの阻害;5. 大動脈環アッセイにおけるTANの血管新生特性の推定;6. 同種腫瘍モデルにおける治療された好中球の導入移植;7.腫瘍成長モニタリング、組織学的検査。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.TAN 並べ替えのゲーティング戦略:CD11b+Ly6Gハイ生中気球は、純度≥95%の腫瘍からソートされる。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.FK866処理後のTANの血管新生特性の抑制選別されたIfnar1-/-TANをFK866または培地で処理した血管新生特性は、大器環アッセイを用いて推定した。分岐形成を14日間モニタリングし、14日目の代表的な結果を発表する(A)。FK866による治療は、内皮枝の数を有意に減少させた(B)。データは中央値、四分位範囲、最小値、*p<0.05として表示されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.FK866処置好中球の養子転移後の腫瘍増殖の遅滞.TANが腫瘍増殖に及ぼす影響を評価した。TANを単離し、FK866で処理し、上述したように腫瘍担持マウスに注射した。14匹のマウスを屠殺し、腫瘍を除去して分析した。Ifnar1-/- FK866対コントロールで処理されたTANを比較した。(A)腫瘍増殖を測定し、(B)腫瘍塊および(C)サイズを推定した。データは中央値、四分位範囲、最小値、*p<0.05として表示されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5.FK866処理好中球の養子転移後の腫瘍血管化を抑制した。腫瘍を上述したように単離した(図4)。血管成熟は、抗SMA抗体(成熟血管)および抗ガンマラミニン(内皮細胞)を用いて評価した。(A)腫瘍の代表的な染色が示されている:SMA(緑)、ラミニン(赤)。スケールバー:50 μm。(B) FK866(緑)または中(赤)で培養されたTANの採用転移後の腫瘍血管化の定量化データは、中央値、四分位範囲及び最小値、*p<0.05として示される。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
外科的および薬理学的癌治療の進歩にもかかわらず、成功した治療は挑戦のままである。免疫細胞は腫瘍増殖の調節に重要な役割を果たすることが知られているので、このような細胞の腫瘍原性を阻害する新しい方法を確立する必要があります。ここでは、抗血管新生腫瘍関連好中球の養子転移を介して腫瘍増殖を抑制する新しいアプローチを示す。TANにおける血管新生性NAMPTシグナル伝達の選択的ターゲティングは、FK866阻害剤を用いて、全身性FK866治療時に観察される副作用を防止する。
プロトコルの最も重要な部分は、新たに単離された一次好中球を使用する必要性です。好中球は短生細胞であり、アポトーシスを受けるか、単離の手順中に活性化される。マウス好中球は、細胞選別を含む分離のすべてのステップの間に4°C培中に保たれるべきである。好中球の単離はできるだけ早く行われるべきであり、実験は一時停止すべきではない。Fcブロックの使用は、NK細胞のような高いFc受容体発現を有する細胞の非特異的染色を減らすことができます。また、ゲーティング戦略を簡素化し、抗体結合による好中球の活性化を避けるために、蛍光共役抗体の数を最小限に抑えることをお勧めします。
プロトコルの制限ステップは、腫瘍中のこれらの細胞の比較的低い量(黒色腫における単一生細胞の1%以下)に起因する腫瘍からの生きている好中球の単離である。これは、フローサイトメトリーベースのソートを使用する場合にのみ可能です。同時に、このプロトコルの血液好中球の使用は、腫瘍組織到着時に変化するNAMPT発現およびその低機能性のわずかな調節のため避けるべきである16。おそらく、血液好中球を使用するためには、腫瘍由来の成長因子を用いて以前に活性化されるべきである。
好中球アポトーシスを避けるために、FK866(2-4 h)による短い治療は、TANの生存率に影響を与えないため、長期治療は好中球アポトーシス16を誘発する。要するに、このプロトコルは、マウス黒色腫腫瘍モデルにおける腫瘍増殖を機能的に抑制する外体外的操作抗血管新生好中球の可能性を示す。
著者は何も開示していない。
私たちの仕事は、ドイツのクレブシルフ、助成金番号:111647、ドイツ研究評議会(DFG)、助成番号:JA 2461/2-1からの助成金によって支えられました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
15 ml tubes | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 62,554,502 | |
50 ml tubes | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
5ml / 10ml / 25ml sterile tipps for the automatic pipette | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 6006180 / 607180 / 760180 | |
6 well flat-bottom cell culture plates | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,920 | |
96 well flat-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 655180 | |
96 well U-bottom cell culture plates | Cellstar, Greiner Bio One International GmbH, Frickenhausen, Germany | 65018 | |
AMG EVOS fl digital inverted microscope | AMG, Bothel, U.S. | ||
anti-mouse CD11b | BD Pharmigen, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553312 | clone M1/70, APC-conjugated, 0.2mg/mL |
anti-mouse Ly6G | BioLegend, California, U.S. | 127608 | clone 1A8, PE-conjugated, 0.2mg/mL |
BD FACS AriaII | BD Biosciences, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | cell sorter | |
Caliper | Vogel Germany, Kevelaer, Germany | ||
Casy cell counter | Innovatis, Roche Innovatis AG, Bielefeld, Germany | ||
Cell Trics 50µm / 100 µm sterile filters | Sysmex Partec GmbH, Goerlitz, Germany | 04-004-2327 / 04-004-2328 | |
Centrifuge Rotina 420 R | Andreas Hettich, Tuttlingen, Germany | 4706 | |
Collagenase D | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | 11088858001 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate) | BioLegend, California, U.S. | 422801 | Stock: 5mg/ml |
Dispase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | D4818-2MG | |
DMEM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 41966-029 | DMEM complete: DMEM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
DMSO (Dimethylsufoxide) | WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany | WAK-DMSO-10 | CryoSure-DMSO |
DNase I | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | DN25-100MG | |
DPBS | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 14190-094 | |
Endothelial cell growth medium | PromoCell, Heidelberg, Germany | c-22010 | |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Biochrom, Berlin, Germany | S0115 | |
Fc-block (Anti-mouse CD16/32) | BD Pharmingen, Becton Dickinson,Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 553142 | clone 2.4G2, Stock: 0.5mg/mL |
FK 866 hydrochloride | Axon Medchem, Groningen, Netherlands | Axon 1546 | Stock: 100 mM |
Goat Anti-Rabbit IgG H&L | Abcam, Cambridge, U.K. | ab97075 | Cy3-conjugated, Stock: 0.5 mg/mL |
Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, U.S. | 51026334 | |
IMDM | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 12440-053 | IMDM complete: IMDM + 10% FBS + 1% penicillin-streptomycin |
Isis GT420 shaver | B. Braun Asculap, Suhl, Germany | 90200714 | |
Matrigel Matrix basement membrane | Corning Life Sciences, Amsterdam, Netherlands | 7205011 | |
Microtome Cryostat Microm HM 505 N | Microm International GmbH, Walldorf, Germany | ||
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma-Aldrich/Merck, Darmstadt, Germany | F3777 | FITC-conjugated, no information about stock concentration |
Needles 0.4 mm x 16 mm | BD Microlance, Becton Dicson, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 302200 | |
Neomount | Merck, Darmstadt, Germany | HX67590916 | |
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, U.S. | 005-000-121 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | 15140-122 | |
Pipetus automatic pipette | Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Germany | 9907200 | |
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | P36935 | |
rabbit anti mouse Laminin gamma 1 chain | Immundiagnostik, Bensheim, Germany | AP1001.1 | No information about stock concentration |
StemPro Accutase | Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, U.S. | A1105-01 | |
Sterile disposal scalpel (no. 15) | MedWare, Naples, U.S. | 120920 | |
Syringes 1 ml | BD Plastipak, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 303172 | |
Syringes 10 ml | BD Discardit II, Becton Dickinson, Franklin Lakes, U.S. | 309110 | |
T75 sterile cell culture flasks | Sarstedt AG & Co., Nümbrecht, Germany | 833,911,302 | |
Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek, Torrance, U.S. | 4583 | |
Zeiss AxioObserver.Z1 Inverted Microscope with ApoTome Optical Sectioning | Carl Zeiss, Oberkochen, Germany |
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