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絹フィブロイン膜を用いた脳にウイルス発現ベクターを配信する方法を紹介します。このメソッドは、シルク/AAV 被覆光ファイバー、光ファイバー、・頭蓋の windows を使用しての表現のベクトルのターゲットを絞った配信できます。
順番にドライブ行動出力のプロセス情報を大きく操作およびニューロンの生体内の活動を監視するための光学的手法の最近開発されたに助けられたがどのように神経回路を理解するクエスト。これらの種類の実験の 2 つの主要なコンポーネントに頼る: 脳に光アクセスを提供する 1) 植込み型デバイスと神経活動の読み出しを提供したり神経細胞の興奮を変更 2) 光感応蛋白質。光感応蛋白質を表現する方法の数がありますが、式は、遺伝的、解剖学的、および時間の精度で制御できるためウイルスのベクトルの脳定位固定装置の注入は現在最も柔軟なアプローチ。ウイルスのベクトルの偉大なユーティリティ、にもかかわらず光インプラント ポーズのサイトに多くの課題にウイルスを提供します。定位ウイルス注射手術手術時間を高め、研究のコストは増大し動物の健康に危険をもたらす要求しています。注射器、高力価ウイルスの塊の突然の配信によって引き起こされる免疫原性炎症、周囲の組織を物理的に損傷することができます。小地域をターゲットにする場合の光インプラントと注射の整列は特に難しい脳の深い。これらの課題を克服するために、絹フィブロインとアデノ随伴ウイルス (AAV) ベクターから成るフィルムと光学インプラントの複数種類をコーティングする方法をについて説明します。フィブロイン、カイコ、繭由来のポリマーをカプセル化でき、生体分子を保護、水溶性フィルムからセラミックスに至るまでの形態に処理することができます。脳に注入、シルク/AAV コーティングは運転式が必要な場所に正確に光学素子と周囲の脳との間のインターフェイスでウイルスをリリースします。このメソッドは、簡単に実装し、大きく生体内神経回路機能の研究を促進することを約束します。
過去 10 年間は、監視および神経活動1を操作するために設計された光に敏感な蛋白質の爆発を生産しています。ウイルスは、脳のこれらの光遺伝学的ツールを表現するための比類のない柔軟性を提供しています。トランスジェニック動物と比較して、ウイルスが生成し、輸送、保管、最新の光遺伝学的ツールの高速実装を許可するはるかに簡単。式は異なる神経細胞の集団を遺伝的対象とすることができます、逆行の輸送用に設計されたウイルスは神経接続2に基づいた式を対象にも使用できます。
ウイルスは通常時間がかかり、困難なことができる定位注射で紹介しています。小領域を正確にターゲットは、多くの注射が必要ですが幅広い分野に式を頻繁運転困難。また、光デバイス、光生体内で提供する脳に植えられたその後ウイルス注入で、インプラントを正しく配置する必要があります。ここでは、絹フィブロイン膜3を使用して注入デバイス周りの組織にウイルスのベクトルを提供するための簡単に実装手法について述べる。絹フィブロインは市販、神経組織をよく容認を様々 な特性を持つ素材を生成する使用ことができます。絹フィルム マイクロインジェクション ピペットのような一般的な検査機器を使用してインプラントに適用することができます。 またはピペットを手します。シルク/AAV フィルム 2 つの外科プロシージャのための要件を排除し、ウイルスによる発現は光のインプラントに正しく配置されていることを確認します。結果の式は、繊維と定位注射よりも繊維のトラックに沿って以下の不要な式の結果の先端に制限されます。
小さな繊維の先端に対象式に加え、シルク/AAV 映画を広範なドライブを使用できます (> 直径 3 mm) 頭蓋窓下に皮質表現。センサー蛍光活動 2 光子励起イメージング体内運転感覚と認知処理における神経活動の役割を評価するため不可欠なツールとなっています。しかし、制服を運転する多くの実験者の広範な皮質上式で複数の注射を実行します。これらの注射は非常に時間がかかることができ、ビューのフィールド間で一貫性のない表現につながることができます。対照的に、頭蓋 windows のシルク/AAV コーティングが製造し、手術に必要な時間を大幅に削減、最も著しくドライブ式数百ミクロン皮質表面の下の非常に簡単です。
次のガイドライン、米国 NIHのケアおよび実験動物の使用のためのガイドで説明されている動物のケアに関するハーバード大学常任委員会によって承認されたプロトコルに従い動物を含むすべての実験を行った。どちらの性別 (6-15 週齢) の大人の c57bl/6 マウスは、すべての実験に使用されました。
1. 水溶液の絹フィブロインを取得します。
2. 式の AAV のベクトルを持つ水性シルクをミックスします。
3. 作製とシルク/AAV コーティング デバイスのストレージの機器を準備します。
4. シルク/AAV フィルムをデバイスに適用します。
5. シルク/AAV コーティングのインプラント
6. 注入デバイス
7. 式の評価とトラブルシューティング
式の運転でシルク/AAV の映画の成功を評価するためには、動物に注入後 2-3 週間を灌流し、関心の領域から脳切片を作製しました。光の蛍光タグ付きタンパク質 (ChR2 YFP) の蛍光画像には、式 (図 1) の範囲のメジャーが用意されています。典型的な光ファイバー (230 μ m 径) は 200 を容易に収容することができますシルク/AAV の nL。練習では、実験者は注入された線維 (図 5) の先端周り信頼性の高い表現を実現できます。
シルク/AAV コーティング頭蓋 windows によって駆動式を評価するために注入後 7-10 日から始まるイメージングを開始します。可視化、2 光子イメージングを使用しているが、蛍光を CCD イメージングなど他の方法も使えます。コーティングされた頭蓋窓 2 つの可能な問題は不十分な表現と溶解し、フィールドのビューを隠してしまう失敗絹フィルム。式を増やすには、埋め込みウィンドウ、および/または映画の中のウイルスの量を増やす前に durectomy を実行することをお勧めします。シルクと株式価 AAV の 1:4 の混合物をそれぞれ使用して最高の表現を実現しました。これ、ウイルス粒子数定位注射で使用される通常よりも大幅に大きいが、手術時間が減少カウンター ウイルスの限界の追加費用です。一方、絹フィルムがウィンドウの下に溶解する場合は、ウィンドウを塗るに使用するシルクの量をさらに削減します。コーティングされた windows の絹の総量は 10-100 倍繊維インプラントよりも、映画は少ないが組織に埋め込まれ、従っていない可能性がありますプロテアーゼ活性レベルが同じ絹フィルム13を溶かすことができますよりも。ただし、いくつかのシルクの存在はウイルスだけで作られた映画は手術中に間質性の液体によって洗い流さので windows3、可能性があります下に式を達成するために不可欠です。
図 1: 絹/AAV 膜を光ファイバーに適用します。(A)慢性繊維インプラント配置ファイバー側ダウン ホルダー (インセット) に XYZ の訳者にマウントされています。繊維以下固定マイクロインジェクター分配シルク/AAV 繊維のヒントにするため。堅実では、プロセスの可視化をことができます。(B)は、少量 (10-20 nL) の光ファイバー先端にシルク/AAV を適用します。ボーラスを取り出し後、ピペットを撤回でき、〜 60 フラット フィルムを乾燥する液滴の s。必要なボリュームがファイバー先端に適用されるまで、プロセスを繰り返します。(C)検査シルク コーティングです。最適なコーティング繊維顔をそれらの繊維から取り除くになりやすい (右) からフロアタム不適切なコーティング中に (左) ファイバー先端に集中。(D)代表的な繊維膜 200 シルク/AAV の nL と結果 AAV 駆動の ChR2-YFP 式注入後 2 週間。左側のコンパクトなシルク/AAV コーティングを右側コーティング繊維の顔過去突出してシルク/AAV は、注入中に光ファイバーに付着しなかったのでほとんどない式、可能性が高い結果、堅牢な式になったスケール バー 0.2 mm (繊維) と 1.0 mm (脳スライス)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: インプラント テーパファイバーをコーティングするためのセットアップします。(A)ガラスシリンジ テーパファイバー ホルダーの上にマウントされて、テーパファイバーは取り出し注射器を直交に配置されます。最も広いの(B)の開始は (インセット) をポイントし、テーパのポイントに向かって放出注射器を移動させながら小さなボリュームを排出します。テーパの長さに沿って連続塗装でこの結果します。(C)代表的なテーパー繊維混合の可視化を支援する高速グリーン シルクでコーティングします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 頭蓋 windows を塗装します。シルク/AAV は手ピペットを使用して適用済みの頭蓋 windows をすることができます。標準 3 mm 径の] ウィンドウは、5 μ L の液滴は、フラット フィルムをゆっくりと乾燥でコーティングすることができます。Inset: GCaMP6f 式シルク/AAV コーティング頭蓋 windows durectomies と注入に起因。この図は、ジャックマンらから適応されています。(2018)3.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: インプラントをコーティングしたシルク/AAV を格納します。(A) 残留水分を除去し、ウイルスの有効性を保持するインプラントは 4 ° C まで使用、真空下で格納する必要があります。このように保存されているインプラントは、少なくとも 7 日間実行可能に残る。4 シルク/AAV の結果 (B) 式は貯蔵 7 日後注入繊維をコーティングしました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: シルク/AAV-GFP 被覆光ファイバー確実にドライブ式。24 連続線条体からのスライスの蛍光画像のインプラントします。各インプラントは 1:1 の 100-400 nL とシルク/AAV-GFP をコーティングしました。このコホートのインプラントは、インプラント サイト (この場合は背側線条体) で式を制限するシルクの機能を示します。GFP 蛍光は緑色で示されますDAPI 染色が青色で表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
シルク/AAV の optogentic 蛋白質の表現を対象とするは、現在使用しているアプローチの限界を克服します。多くの研究は、正常に光遺伝学的蛋白質を表現する AAV 注射を使用して、式光ファイバーの先端にテーパーの繊維の長さの周りの地域に、GRIN レンズの表示領域に合わせて挑戦です。光学部品、光式芯ズレ、ため定位注射が信頼性の高い、することができ、多くの実験は失敗します。ここで述べる方法をラベリング シルク/AAV は、この問題を解決します。2 番目の手術手順を排除することによって、場合によっては 2 回目の手術の必要性を排除することで、手順も簡単になります。それは困難な頭蓋窓下に広範な表現を取得するウイルスを使用することができ、実験者は通常、複数の場所でウイルスを注入する長い手術を実行します。シルク/AAV コーティング頭蓋窓単に大規模な皮質領域に広範な表現を取得する機能は、多くの侵襲的な注射の必要性を排除する簡素化です。
シルク/AAV メソッドのもう一つの潜在的な利点はそれがウイルス注射と比較して神経組織における以下の炎症を誘発する可能性があります。(ただし、このような潜在的な合併症は、通常、細胞、回路プロパティ14,15を変更する可能性のある反応性アストロサイトーシスなどの炎症反応を引き起こす可能性が高価 AAV を脳に注入無視)。絹フィルム独自の13にほとんど免疫反応を誘発する、シルク/AAV 映画が多く時間または数日間の16、周囲の組織にウイルスの負荷を下げるし、免疫原性応答を減らす可能性のあるコース上ウイルスを解放する予定です。デバイスの注入が AAV 注入による先行は、従来のアプローチと注入し注射から炎症反応が生じます。従来のアプローチとシルク/AAV 全体的なシルク/AAV 膜を低減するかどうかを決定する方法を体系的に比較することが望ましいことが将来的に炎症性応答。
いくつかの手順は、シルク/AAV フィルムの使用の成功にとって重要です。最も重要なは、光ファイバーのコーティングは前述の方法で慎重に行う必要があり。、正しい場所に映画がコンパクトであることを確認するには顕微鏡下で目視による乾燥のフィルムの場所を慎重に評価する必要があります。・光ファイバーの表面に付着します。光ファイバーの両側に任意のシルク/AAV は興味、地域外の表現につながるし、繊維の顔の外へはみ出て不格好のフィルムがない式や信頼性につながる注入中に離れる可能性があります。シルク/AAV を植込み型デバイスに適用することができる任意の材料の使用に適応について述べる方法は、すぐに利用できる、シルク/AAV の小さなボリュームの正確な成膜を可能です。
少し練習は、正確で再現性のある結果を達成するために必要です。繊維のトラックに沿って表現が見られる場合は、絹フィルム乾燥繊維顔ではなく、光ファイバーの側面にあることそうです。製造工程を繰り返し、膜は繊維の側面に乾燥症状の乾燥したインプラントを密接に検査します。シルク/AAV 薄膜は光学的に透明なので、シルク染料 (高速グリーンまたは同じような染料) より良い結果フィルム (図 2) の形状を視覚化すると混合を適用することの練習を助けるかもしれない。式がない場合、絹フィルムが注入の間にファイバー先端から剥がれと考えられます。インプラントの際株式高力価ウイルスの使用をお勧めします。光ファイバーのこれは細径ファイバーに適用する必要があります合計音量を下げます。コーティングのサイズが場合の懸念は、蒸着液滴の完全乾燥を許可する各 10 nL アプリケーション間より長く待っている検討してください。シルク/AAV 液滴は暖かいランプの下でより速く乾燥します。頭蓋の windows 用高力価ウイルスぴあまたは硬膜に適切なウイルス負荷を供給する必要があります。特定の種類のインプラントがシルクを溶解し、AAV を他よりもより容易にリリースします。我々 は、脳の表面に注入した頭蓋の windows がおそらくおかげで異なる脳脊髄流体またはプロテアーゼ活性の信頼性の高い表現を達成するためにシルク/ウイルスの割合を必要とすることを発見しました。水性シルクのボリュームを下げる式ことはできません効果的な AAV の濃度の増加によって増加する場合は説得力のある選択肢です。
最後に、それは重要な光学部品を適切に格納し、それらを非常にすぐにインプラント後、準備が整います。私たちを使用する多くの日前に真空下で冷蔵がコーティングされた繊維を格納できることを示しています。真空貯蔵装置は、残留水分17絹フィルムの溶解度を減らすとまたウイルス有効性を維持するためを削除します。理想的には、光ファイバーは、製造後 24 時間以内注入する必要があります。しかし、我々 はシルク/AAV 被覆繊維が作製 (図 4 b) 後 7 日を注入したときの式の真空ドライブと同様のレベルで格納されているを見つけます。対照的に、コーティングされた頭蓋 windows と GRIN レンズは、室温で乾燥され、準備の時間の内で使用されるとき最も信頼性の高い式を行なった。この格差の理由は不明します。さらなる研究は、保管期間をさらに延長するための準備・条件を絞り込む必要があります。
彼らは大幅に手術時間を短縮し、製造に非常に簡単ですが、現時点では、このメソッドは制限、シルク/AAV コーティング頭蓋 windows からかなりの可能性があります。コーティング頭蓋 windows は一様に皮質の広い領域にラベルを付けるし、GCaMP イメージング、ややより少ない表現のより深い層でのレイヤー 2/3 で十分な式をドライブします。定位注射より強力な式をドライブし、式のターゲット層をより細かく制御を提供します。信頼性の高い表現は、硬膜が削除されたときにのみ達成されました。硬膜は8イメージ品質を改善するために多くの 2 光子イメージング実験のため削除されます多くの場合、多くの実験だ低侵襲の方法でラベルを取得することが望ましい。そのため硬膜を削除せず皮質領域をラベルにシルク/AAV を使用する当社の能力について解説しました。いくつかの分類を行い、開頭手術の準備の過程で硬膜の損傷の結果今回も可能です。さらなる研究は、確実に硬膜を削除せず皮質をラベルに使用する被覆頭蓋 windows に必要です。
カイコの繭から水性絹フィブロインの準備は、ロックウッドらで詳しく説明します。(2011 年)18. 水性絹フィブロインは今市販 (5 %w/v)。我々 の実験のほとんどは、ラボ (5 7.5 %w/v) で作製した水溶性シルクフィブロイン株式を使用して行ったが商業水フィブロインを使用して同様の結果を得た。水溶性フィブロインは、最大 3 ヶ月, その後自発的に液体からに遷移ハイドロゲル184 ° C で安定です。フィブロイン株式が 〜 1 mL の約数に分けられ、-80 ° C で保存をお勧めします(コーティングのインプラントの何百もの十分な) 1 mL 作業因数は 4 ° C で保存し、ゲル化開始まで使用できます。気をつけて振る、渦、扇動またはせん断力は、ゲル化19,20につながる可能性として積極的に水溶性フィブロインをピペットします。
シルク/AAV の映画は、細径光ファイバーの先端に正確な皮質下式に頭蓋の windows の下で広範な皮質表現から表現パターンの広い範囲を許可します。これらの技術は、共通 AAV 発現ベクターの利点を取るために開発されましたが、脳にレンチや狂犬病ウイルスのような他の表現のベクトルを分散させるためにされる可能性が高い可能性があります。絹フィルムは、組織へのウイルスのリリースを改善するために三次元の形状に製造できます。たとえば、ドライブ、痛覚の使用なしにウィンドウを皮質下に強い表現するために、頭蓋 windows は深い皮質層21硬膜とリリースのウイルスを書き入れないシルク マイクロニードルの配列でコーティングする可能性があります。さらなる改良は、ウイルスのリリース、およびシルク/AAV フィルム用の新しいアプリケーションの改良されたプロパティに可能性があります。
著者が明らかに何もありません。
著者試薬と有用なガイダンス、および生体内イメージングのサバティーニ B. と c. ハーヴェイのラボ イラスト j. バスケス、d. カプラン、C. オイゲンプレダを感謝したいです。M. Ocana ・一部、国立研究所の神経疾患として神経イメージング研究センター部分で支え神経イメージング センターによって可能になった顕微鏡とストローク (NINDS) P30 コア センター (NS072030) を与えます。この仕事を受けました GVR 帰れない家族財団、ナンシー Lurie マーク財団と NIH の補助金、NINDS R21NS093498、U01NS108177、W.G.R に組織プラスミノーゲンアクテベータ R35NS097284、F32NS101889 C.H.C. に NIH ポスドク研究員プログラム
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Aqueous silk fibroin | Sigma | 5154-20ML | Aqueous Silk Fibroin (5% w/v) for making films |
Microinjector to deposit silk/AAV | Drummond | 3-000-207 | Nanoject III nanoliter injector |
Manipulator to hold implants | Narashige | MM-33 | Micromanipulator |
Stereoscope to visualize silk deposits | AmScope | SM-6TX-FRL | 3.5X-45X Trinocular articulating zoom microscope with ring light |
Vacuum chamber to store implants | Ablaze | N/A | 3.5 Quart Vacuum Vac Degassing Chamber |
Optional, implant holder for storage | N/A | N/A | To store premade optical fibers, drill a grid of ~4 mm-deep holes with a diameter just larger than the ferrule diameter into a plastic block. |
Optical fiber | Thorlabs | FT200EMT | Ø200 µm Core Multimode Optical Fiber for fiber implants |
Ferrules | Kientec | FZI-LC-230 | LC Zirconia Ferrule for fiber implants |
Various materials for manufacturing chronic fiber implants | Various | N/A | For detailed procedure, see Ung K, Arenkiel BR. Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue. Journal of visualized experiments: JoVE. 2012(68). |
Tapered fiber implants | Optogenix | Lambda-B | Tapered fiber implants |
GRIN lenses | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | GRIN lenses |
Small glass cranial windows | Warner | 64-0726 (CS-3R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
Large glass cranial windows | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Small round cover glass, #0 thickness |
Various materials for manufacturing cranial windows | Various | N/A | For detailed procedure, see Goldey GJ et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature protocols. 2014 Nov;9(11):2515. |
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