急性心筋梗塞と心血管疾患のマイクロ Rna を循環の定量化デジタル PCR

循環のマイクロ Rna は、心血管疾患および急性心筋梗塞のバイオ マーカーとして約束を示しています。本研究ではマイクロ Rna の抽出、逆のトランスクリプションおよび心血管疾患患者の血清中の miRNAs の絶対的な定量化のためデジタル PCR のためのプロトコルについて述べる。

循環血中マイクロ Rna (Mirna) は、循環に心血管系の細胞から放出される心血管疾患および急性心筋梗塞 (AMI) のバイオ マーカーとしての約束を示しています。循環の miRNAs は非常に安定した、定量化することができます。特定の miRNAs の定量化は、病理学といくつかの miRNAs ショー高組織および疾患特異性にリンクできます。心血管疾患の新規バイオ マーカーを見つけることは医学研究のための重要です。ごく最近、デジタルのポリメラーゼの連鎖反応 (dPCR) が発明されています。dPCR、加水分解蛍光プローブと組み合わせて特定の直接絶対定量ができます。dPCR は、変動の少ない、高直線性の量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) に比べて感度が高いなど、優れた技術的な資質を展示します。したがって、dPCR は、特に大規模な多施設循環器臨床試験で使用するための Mirna を直接定量化のより正確で再現性のある方法です。この文書では血清中絶対コピー数を把握するためにデジタル PCR を効果的に実行する方法をについて説明します。

循環の miRNAs は、疾患、心血管疾患の¹を含む数の有望なマーカーとして識別されています。Mirna が小さい、単一座礁させた RNA 分子の非コーディング (約 22 ヌクレオチド長い) が関与している、転写後調節を介してメッセンジャー RNA の翻訳および影響を及ぼす遺伝子表現²の変化され、生理学的および病理学的状態の循環に解放されます。特定の miRNAs の定量的表現は、病理学にリンクすることし、いくつかの miRNAs 示し高組織疾患特異性¹。心血管疾患における Mirna PCR 方法論³の助けを借りて定量化する新規バイオ マーカーが血清で非常に安定して、簡単にすることができますので、魅力的な候補となっています。小規模の研究で心筋梗塞のバイオ マーカーとしての miRNAs の潜在的な価値を評価が大規模なコホートで検証、²を欠けています。たとえば、ミール 499 は心筋の筋肉において高い発現があるし、亜美^4,5,6で大幅に増加することが示されています。さらに、それを調節するプログラムされた細胞死 (アポトーシス) 心筋細胞の分化と従って次亜美⁷いくつかのメカニズムに関与しています。別にいくつかの小さな研究優位性と AMI の診断のための Mirna の増分値を報告、高感度心臓 troponins に優位性等はまだ証明されていない大規模な研究^{2,5 ,6,8}。大規模なコホートでより多くの前向き研究は、したがって、miRNAs の潜在的な診断価値を評価するために必要。さらに、マイクロ Rna 定量法の最適化が必要な⁹のプロトコル標準化された同等を使用しています。標準化されたアッセイは、一貫性のない結果が減り、バイオ マーカーが臨床適用性を確保するため再現性のある方法で定量化する必要がある潜在的なバイオ マーカーのルーチンの臨床応用を目指しての Mirna が役立つことがあります。

最近では、dPCR は、エンドポイント分析として導入されています。それは約 20,000 の個々 の反作用¹⁰にサンプルをパーティション分割します。DPCR システムは、数学的なポアソンの統計的分析蛍光信号 (正と負の反応)、標準曲線¹⁰なし絶対定量を有効にするを利用します。加水分解蛍光プローブと dPCR を組み合わせて、miRNAs の非常に特定の直接の絶対定量が可能です。MiRNA のレベルを定量化するための優れた技術的な資質 (減少の変動、増加の日常的な再現性、高い直線性、高感度など) を展示するデジタル ポリメラーゼの連鎖反応を示しました、定量的リアルタイム PCR^10,11と比較して循環。これらの優れた技術的な資質のバイオ マーカーとして循環の miRNAs の使用上の現在の制限を軽減するために役立つかもしれないし、大規模な多施設循環器臨床試験におけるバイオ マーカーと診断法として、miRNAs の確立につながる可能性があります。一般的です。以前の研究では、最近、AMI 患者の miRNAs の循環の絶対的な定量化のための dPCR を適用し、qPCR¹²の miRNAs の定量化と比較して優れた診断能力を発揮することができた。

この文書の dPCR を使用してが直接心血管の miRNAs の循環の定量化の正確かつ再現性のある方法であることを実証したいです。デジタル PCR を用いる血清中マイクロ Rna レベルの絶対定量は、大規模なマルチ センター心臓血管臨床試験で使用するため潜在的なを示しています。この文書で述べるデジタル PCR を効果的に実行する方法、および血清の miRNA 絶対コピー数を検出する方法。

1. 血漿/血清中からマイクロ Rna の抽出

注: Mirna を適切に定量化するために血漿/血清中から正しいマイクロ Rna 分離は重要なステップです。心に留めて、さまざまなプロトコルが存在するために特に重要なことは、サンプルの処理中に同じワークフローに準拠するためです。このプロトコルでは、miRNA が 50 μ L の血清から抽出されます。この制限の正しい抽出プロセスとしてよりも 200 μ L を使用しないでください。

1. 血清の準備または凍結試料を凍結解除。
2. 250 μ L (5 冊) 商業溶解試薬を 50 μ L の血清に追加します。ボルテックスによって、換散をサポートします。5 分間室温でベンチにライセートとチューブを配置します。
3. スパイク スパイクの制御 (1.6 倍 10⁷コピー/μ L) の 3.5 μ L でライセート、ボルテックスでそれらをミックスします。
4. 相分離のクロロホルム (すなわち、開始の血清サンプルほど等しい金額) の 50 μ L を追加します。15 s. 場所 2 〜 3 分間室温でベンチにチューブのチューブを積極的に振る。
5. 相分離の 4 ° C 15 分で 12,000 × g でチューブを遠心します。
   注: サンプルは、RNA、白い中間期およびより低い、ピンクの有機相を含む上部の水相に今区切られます。
6. 新しい管に RNA を含む上部水様段階 (100 μ L) を転送します。これは正しい RNA 数を偽って、白い界面材料を転送していません。
7. 100% エタノール 150 μ L を (すなわち、転送されたサンプルの量 × 1.5) を追加します。それらを上下にピペッティングにより材料を混ぜます。それらを遠心分離しないし、すぐに次のステップに移りましょう。
8. ピペット 2 mL 採取管の商業スピン列にサンプルを 250 μ l 添加します。カバーを閉じます。遠心分離機の位置にある列 > フロースルー - 15 s. 破棄のため室温で 8,000 × g。
9. 1 商業洗浄バッファー数 700 μ L をスピン列に追加します。蓋を閉めるし、遠心分離機の位置にある列 > 室温 15 s. 破棄スルー洗浄バッファーで 8,000 × g。
10. 2 商業洗浄バッファー数 500 μ L をスピン列に追加します。蓋を閉めるし、遠心分離機の位置にある列 > 8, 000 15 s. 破棄スルー洗浄液は室温において g x。
11. スピン列に 80% エタノール 500 μ L をピペットします。ふたを閉じる、遠心分離機の位置にある列 > 8, 000 x g 2 分の室温でフローとコレクションの管を破棄します。
12. 回転カラムを新しい 2 mL のコレクションの管に転送します。膜を乾燥する開いた蓋にフルスピードで列を遠心します。流れとコレクションの管を破棄します。
13. 新しい 1.5 mL コレクション チューブにスピン列を転送します。RNase フリーの水の 30 μ L 膜の中心に直接に適用することによって、RNA を溶出します。カバーを閉じます。1 分のフルスピードで列を遠心します。
14. -70 ° C で RNA を保存します。
    注:-70 ° C ~-20 ° C の間に RNase フリー水で浄化された RNA の記憶により 1 年間の RNA の劣化はありません。製造元のプロトコル、RNA を希釈するための水の RNase フリーの最小量は 10 μ L. 10 μ L が十分に膜をメタンハイド レートし、総 RNA の収穫を減らすより小さいを使用しています。

2. 逆のトランスクリプション

注: 次の 15 μ L の逆のトランスクリプション (RT) プロトコル (全反応ボリューム) を使用して相補的 DNA (cDNA) が合成されました。

1. 雪解けの氷の上 RT キット。酵素を分解からそれらを防ぐため、使用する前にそれらをスピンダウンし可能な限りの冷凍庫において。氷の上 RT プライマーを解凍し、使用する前にそれらをスピンダウンします。
2. 表 1に示すようにマスター ミックスを準備します。
3. マスター ミックスの 10 μ L、5 μ L/ウェルの 96 ウェル プレートで抽出した RNA を結合します。
4. 2 分のための 4 ° C で 2,000 x g でウェル プレートを遠心します。
5. 逆のトランスクリプションの表 2に示す熱サイクル プロトコルを使用します。
   注: 以下で説明された cDNA が直接処理デジタル PCR マシンで (材料の表を参照)。また、それは、-20 ° C で保存されるかもしれない

3. 液滴生成とデジタル PCR

注: デジタル 40 μ L の次のプロトコルを使用して PCR を行った。

1. 商業 dPCR ミックス、準備された cDNA および氷の上、PCR のプライマーを解凍します。使用直前にそれらを遠心します。
2. に従ってマスター ミックスを準備テーブル 3.
3. RT 製品の 1.33 μ L/ウェルを追加し、簡単にそれを遠心します。
4. 8 よくカセット (中行) の各ウェルに試料の 20 μ L をピペットします。
   注: 8 もカセットが完全に入力されていない場合テンプレート以外のコントロール (NTCs) cDNA (すなわち、抽出した RNA の代りに水で生産された RT 製品) を省略すると残りの井戸を埋めるまたは dPCR 商業バッファー。NTC は、コンタミネーション コントロールとして機能します。液滴形成の質が低下するので、残りの井戸で水を使用ない必要があります。
5. 8 もカセットの油田 (下の行) に、プローブの液滴生成油の 70 μ L をピペットします。
6. 8 もカセットの上にガスケットを配置し、液滴形成配列装置のカセットを配置します。液滴形成配列装置を閉じます。3 つのインジケーター ライトが緑色に点灯するまで待ちます。
   注: 液滴が生成されている今。
7. 丁寧にゆっくりとピペッティングによる 96 ウェル プレートの別の井戸に液滴状サンプル (上の行) の 40 μ L を転送します。
8. サンプルの液滴形成を完了すると、シール 4 180 ° C で pierceable dPCR 箔で PCR プレート s。
9. Cycler の箔シール PCR プレートを置き、2.5 のランプに入る率で表 4で説明されているようにそれをサイクル ° C/s。

4. 液滴の読書と分析

1. プレート ホルダーのベースに、熱 cycler からプレートを転送します。PCR プレート プレート ホルダーの上部に配置することによって PCR プレートを締めます。
2. 商業 dPCR ソフトウェアを起動します。
3. セットアップにサンプル名、実験、およびターゲットの名前を入力します。絶対数量を選択します。
4. 液滴を実行] をクリックして読み取りを開始します。加水分解プローブを操作するとき、検出化学としてファム/HEXまたはファム/ヴィックを選択します。
   注: 商業 dPCR ソフトウェアは、自動 - データを分析します。
5. 確実に正しい液滴生成結果テーブル内の液滴の数字を確認します。
6. 同じ定量化された miRNA とすべての井戸を選択し、分析] をクリックします。肯定的な液滴をマークし、自動分析データ (図 1) を手動で修正する 2D のしみを使用します。

5. サンプルの計算を修正します。

1. 正規化係数 (NF) サンプルを乗じてサンプルを正規化します。
   NF = 中央 [c. の elegansミール 39 測定]_{すべてのサンプル}/[c. の elegansミール-39]_{ある特定のサンプル}
2. 希釈倍率 (DF) の調整、最終 miRNA 血清濃度を計算します。
   [miRNA]_最終DF_RT DF_{dPCR Ex} DF x x x [miRNA]_生の値を =
   どこ：
   [miRNA]_生の値= 商業 dPCR ソフトウェアにより定量化 miRNA
   DF_RT = 逆のトランスクリプション; でテンプレートの希釈係数
   DF_dPCR = dPCR; でテンプレートの希釈係数
   _Ex DF 抽出で希釈倍率を =。

6. 合成オリゴヌクレオチド希釈系列

1. 氷の上の凍結乾燥の合成オリゴヌクレオチドを解凍します。簡単にそれを遠心分離機します。
2. ヌクレアーゼ フリー水 10 pmol の最終的な集中に凍結乾燥させた合成オリゴヌクレオチドを希釈/μ L。 簡単に遠心分離機のそれ。
3. 表 5に示すヌクレアーゼ フリー水で希釈します。10 の 8,000 の x g で各希釈段階間簡潔に希釈を遠心分離機 s。
4. 手順 2 で説明した逆のトランスクリプションを続行し、手順 3 と手順 4 で説明したようにデジタル PCR のサンプルを分析します。

加水分解蛍光プローブと組み合わせてデジタル PCR 直接コピー/μ L に特定の miRNAs の絶対的な量を定量化することも可能。 にします。DPCR のサンプルは約 20,000 の個々 の PCR の反作用でパーティション分割された dPCR は技術不要、¹⁰をレプリケートします。DPCR システム (反応と正と負の異なる) 蛍光信号の数学的なポアソン統計分析を利用して¹⁰曲線の標準のための必要性なしに絶対的な数量を有効にします。許容滴数、濃度を正しく計算するために必要です (> 15,000)。テンプレート コントロールは、かなり非特異的増幅を除外しないようにするため。分析に含まれるすべてのサンプルは、得られた結果の妥当性を強化するため、同じボリューム、メソッド、および PCR のプロトコルを使用して処理されます。DPCR で得られた濃度がスパイクの合成と分析したすべてのサンプルの間で中央値の正規化の手順を使用して、正規化線虫ミール 39¹³。スパイクにc. の elegansの量を測定したデータを正規化ミール 39 は RNA 抽出効率のサンプルにサンプル変化を修正し、PCR 反応の制御、さらに結果の妥当性に加えとして提供しています。血清 miRNAs; の正規化の確立されたゴールド スタンダードがないです。しかし、外因性のコントロールでは、スパイクなど線虫ミール-39 は、内因性の Mirna が様々 な病気の状態⁹により変化すること正規化手順は、エレガントなソリューション。

分析された血清サンプル急性 st 上昇型心筋梗塞 (STEMI) 患者からの PCI 後経の冠動脈インターベンション (PCI)、PCI 後、8 h 前後 16 h に買収されました。STEMI 患者は重症虚血を示す見極め新しい虚血のバイオ マーカーの評価のため。ミール 499 リリースの動態と心血管疾患における虚血のバイオ マーカーとしてミール 499 の潜在的な使用を評価するには、は、3 つの異なる時間ポイント¹⁴のすべての患者間で dPCR とミール 499 を行った。

図 1は、ソフトウェアによって計算された最終的なマイクロ Rna 濃度を与える肯定的な液滴の選択を示しています。サンプルでは陽性の割合は、商業 dPCR ソフトウェアによって計算されたコピー/μ L の濃度を決定します。結果は 2 D プロットも可視化することができ、手動でに円マーク陽性。濃度は、非特異的増幅は NTCs の上でない場合にのみと見なされます。

図 2は、重複の直線性とマイクロ Rna の合成オリゴヌクレオチドは-ミール-499-5 p 希釈系列の適合度を示します。0 コピー/μ L 2,500 コピー/μ L から 8 段階希釈系列行った。計算された予想されるコピー/μ L と表 5に示す 100 %rt とデジタル PCR 効率を仮定します。この設定でデジタル PCR は直線性の高度を示します (r² = 0.99)。検出限界 (LoD = 0.12) と定量化の限界 (LoQ = 0.23)図 2も低 miRNA の発現が正常に認識されることを示すに表示されますも。したがって、dPCR は、miRNAs の循環の低血清濃度を定量化する使用できます。Forootanらのアプローチ (LoD) 検出限界と定量 (LoQ) の制限を計算します。¹⁵とは LoD として定義 = LoB + 1.645 x σ の_{低濃度サンプル}、LoB として空白 (LoB) の制限を計算する場所 = 平均_空白+ 1.645 x σ の_空白。標準的な推定の実行している複製曲線¹⁵LoQ です。Mirna の再現可能な数量を確保するため、LoD と、LoQ 上マイクロ Rna 濃度のみが有効な正確な値と見なされます。

図 3は、ST 上昇心筋梗塞 (STEMI) nのミール 499 レベルの代表的な結果を示しています = 各時点で 16。経皮的インターベンション (PCI) の前に採取した (t = 0)、PCI 後 8 h (t = 8)、および PCI 後 16 h (t = 16)、ミール 499 レベルは安定した冠動脈疾患 (CAD、 n 患者のミール 499 レベルと比較されたと= 20)。患者の主な特徴は、表 6で見つけることができます。心筋梗塞に続く最初の 8 時間で血清にミール 499 の最初のリリース後ミール 499 レベルは 16 時間後に再び減少します。増加の傾向は、STEMI の初めに既に見ることが (t = 0)、CAD と患者と比較してミール 499 レベルの大幅な増加は、STEMI 後見られる 8 h をすることができます (t = 8, p < 0.01) にミール 499 レベルを比較するとき安定している CAD 患者のミール 499 レベル。受信機の動作曲線 (中華民国) ショー、STEMI 患者および CAD と区別するために新規バイオ マーカーとしてのミール-499 の可能なユーティリティ [(AUC) 曲線下面積経皮的インターベンション (PCI)、AUC の前に撮影したサンプルの 0.62 を = =PCI、および AUC 後 8 h を撮影したサンプルで 0.75 0.78 CAD とミール-499 患者の血清と比較して PCI 後 16 時間に撮影のサンプルを =]。

図 1: 重複で希釈系列における肯定的な液滴の選択実行されます。(A) しきい値は、負の液滴上記手動で設定されます。(B) 結果は、2 D のしみ、旋回によって選択された陽性で可視化します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2: 合成ミール 499 オリゴヌクレオチド希釈系列。(A) で重複して測定を行った。データは μ L。 線形回帰と適合度あたり絶対コピーと変換ログを表示 (r²-値) が表示されます。データは、平均 ± SEM. このパネル (B) に示す検出 (LoD) の数の制限と定量化 (LoQ) のように掲載されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3: ST 上昇型心筋梗塞患者における血清ミール-499-5 p を循環の定量化 (n = 16) 安定した冠動脈と患者に比較して経皮的冠動脈インターベンション (PCI)、PCI 後、8 h と 16 h PCI 後の前に病気 (n = 20).循環 (A) 血清ミール-499-5 p は対応するpの平均の標準誤差の平均値として表されます-一方向の分散分析によって計算された値に続いてボンフェローニポスト アドホックテスト (p < 0.05 として考えられていた統計的に有意な)。(B) A 受信者動作特性曲線 (中華民国) 解析は、パネルAからのデータで実行されます。ROC 解析は、感度とのバイオ マーカーの特異性を示します。さらに、曲線 (AUC) 値の下の対応する領域が表示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

表 1: 逆のトランスクリプションの試薬のミックス。

表 2: 逆のトランスクリプションの熱サイクリング条件。

表 3: デジタル PCR 試薬のミックス。

表 4: 熱サイクリング条件デジタル PCR のため。

ミール 499 表 5: 合成の希釈系列。

表 6: 主要患者特性。

デジタル PCR は比較的新規エンドポイントにより、核酸サンプル内の直接の絶対定量 PCR 法であります。メソッドでは、減少の変動、高められた日常の再現性、優れた感度^11,12など、特定の利点を所有しています。さらに、サンプルは約 20,000 の単一反応やエンドポイント分析に分配による dPCR は堅牢に定量的 RT-PCR 法¹⁶と比較して PCR の妨害物質。DPCR これらの資質は、定量化のための診断ツールとして定量的 RT-PCR 法に魅力的な代替手段です。Mirna を循環として多い低血清濃度で存在、これまで科学者たちが挑戦されている PCR⁹Mirna を適切に定量化します。その一方で、dPCR は適切に低カウント miRNA 定量化¹⁷点の問題を軽減する血清中式でも低の miRNA を定量化できます。DPCR の能力を非常に低い miRNA 式でも数/μ L を直接与えるためにこうしてそれに魅力的な診断ツール マイクロ Rna バイオ マーカー研究の心血管研究コミュニティのため。カウント/μ L は、濃度は、抽出、RT の反作用、および dPCR で使用される希釈係数が乗算できます、1 μ L の血清でコピーの正確な数を達成することが可能です。ここで紹介するワークフローは、大きな心血管研究ツールを提供するため、プレート上に最大 96 サンプルで実行できます。DPCR 展示定量的 RT-PCR 法にいくつかの利点がそれはまだ日常的に適用されません miRNAs 心血管試験の定量化のため。さらに、標準化されたデータ正規化手順が欠けています。

このアプローチでは、dPCR、加水分解蛍光プローブと組み合わせて有効に心血管疾患にリンクされている Mirna の循環の特定の直接の絶対定量を示します。このレポートでは、miRNA 検出を介してdPCR のための最適化されたプロトコルを示す定量的 RT-PCR 法上 dPCR の利点を確認に目指しました。

直線性の良い dPCR 展示と低検出限界と定量 Mirna を定量化するための dPCR を確認しました。合成オリゴヌクレオチドとサンプルを打ちつけることによってサンプルの正規化は、抽出効率とサンプルにサンプル変化の調整可能です。

結論としては、デジタル PCR は技術的な習熟度の診断の可能性、優位性を発揮、miRNA の定量化のための最高の現在のメソッドし、さらに大規模な多施設心血管マイクロ Rna バイオ マーカー研究に使用するかもしれない。

著者が明らかに何もありません。

著者の謝辞があります。