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要約

ここでは、3色 smFRET データと 3 D アンサンブル隠されたマルコフ モデルとその解析を取得するためのプロトコルを提案する.このアプローチでは、科学者は複雑な蛋白質のシステム、協同性や相関相互作用などからキネティック情報を抽出できます。

要約

単一分子蛍光共鳴エネルギー移動 (smFRET) 生体分子のダイナミクスを調べるため広く使用されている生物物理学的技術となっています。自分のタスクを満たすために機能サイクルの相互作用パートナーと共に行動する細胞蛋白質の多くの分子機械を持っています。延長にマルチカラー 2 色 smFRET はそれに 1 つ以上の相互作用や構造変化を同時に調査することが可能。これだけではなく smFRET 実験新しいディメンションを追加しますが、イベントのシーケンスを直接研究して固定化サンプルと全反射蛍光相関相互作用を検出するユニークな可能性を提供しています顕微鏡 (TIRFM)。したがって、マルチカラーの smFRET は以前達成不可能の詳細で定量的な方法で生体分子複合体を研究するための多目的なツールです。

ここでは、蛋白質のマルチカラー smFRET 実験の特別な課題を克服する方法を示します。データを取得するため、運動情報を抽出するための詳細なプロトコルを提案します。これは、トレース選択基準、国家の分離、および 3 D アンサンブル隠されたマルコフ モデル (HMM) を用いたノイズの多いデータから状態軌道の回復が含まれています。他の方法と比較して、運動情報はドエル時間ヒストグラムから、直接 HMM からを回復しません。最尤フレームワーク キネティック モデルを批判的に評価して料金の意味のある不確実性を提供することが出来ます。

熱ショックタンパク質 90 (Hsp90) に本手法を適用しておりますはヌクレオチド結合および蛋白質のコンフォメーション変化が世界を解きほぐすことができます。これにより、Hsp90 二量体の 2 つのヌクレオチド結合ポケットの間の協同性を直接観察できます。

概要

多くの蛋白質は、動的錯体の構造変化と幅広い時間スケール1,2,3の一時的な連合を介した他の分子とその機能を発揮します。外部のエネルギー源 (例えばATP) これらの動的相互作用することができます機能サイクルの方向性につながる、最終的に生活のための前提条件のセルに非平衡定常状態を維持する結合。

これらの分子機械を完全に理解するためには、静的な記述の構造研究に導かれては十分ではありません。さらに、基になる運動モデルの知識を持って運動速度定数を決定するために不可欠です。いくつかの既存の方法許可バイナリ相互関心、表面プラズモン共鳴など、(例えば、ジャンプまたはストップト フロー分光読み出しと緩和法の 2 つの分子のダイナミクスを研究する研究者テクニック) と核磁気共鳴。ただし、適用性は、(例えば、 1 つのバインドとバインドされていない状態) の単純な 2 状態系平均一括実験に固有のために制限されてほとんどの場合です。以上の国または中間体が関与している場合、彼らは唯一速度定数の複雑な混合物をもたらします。単一分子光ピンセットや磁気ピンセットや 2 色 smFRET、つまり1 ドナー表面固定化したサンプルを 1 つの受容体 fluorophore など方法は、立体配座の変化すべての速度定数を回復できます。しかしときに、1 つ以上の結合部位に影響を与える相互作用は、これらの方法が限られている残る、2 つ (またはそれ以上) の可能な相関相互作用についてのみ、一連の実験から結論は間接を通じてアクセスできます。

マルチカラー smFRET4,5,6,7,8,9は、リアルタイムで直接、下のこれらのコンポーネント間の相互作用を研究する機会を提供しています近く生理的条件10。これにより、たとえば、リガンドまたは別タンパク質8,9,11のコンホメーション依存的結合を調査する 1 つ。ここで示した全体的なアプローチは、測定チャンバーの表面にタンパク質を付けると時間をかけて (の詳細についてを参照してください9プリズム型観察上の蛍光強度を追跡するための特定の位置で興味のタンパク質のラベルには,12) します。 異なる染料の空間的近接性することができますそれらの間のエネルギー移動から決定されます。(文献13) 蛋白質蛋白質から異なる場合があります戦略をラベリングと smFRET 測定におけるアーティファクトを避けるためのガイドライン14が存在します。

ドナー色素は、マルチカラー smFRET 実験で異なるアクセプター色素にエネルギーを移す可能性があります、ので、すべての染料の相対位置は 1 つの染料だけで15,16の興奮からアクセスできません。しかし、交互にレーザー励起 (アレックス17、および18の見直し) との組み合わせでこのメソッドは、1 秒未満でサブナノ メートル分解すべての時空間的情報を提供します。

原則として、構造情報は色素間の距離を使用して実現できます高解像度はアレックスとマルチカラー smFRET 実験ではすべての蛍光強度の組み合わせから計算されます。しかし、ここで状態の識別、分離、マルチカラー smFRET が不可欠である、運動のモデルの抽出に着目します。三角形分割による構造決定「のみ」が必要な場合、高い信号対雑音比の単純な 2 色 smFRET 実験セットは実行12,19にできます。

部分的な蛍光を用いて (figure-introduction-2319) 2 つの同時7間のエネルギー移動のためのプロキシとして。PFは、2 色実験の FRET 効率に類似した蛍光強度から計算されます。

figure-introduction-2512

ここで、figure-introduction-2610カラー exと励起後放出チャネルemの強度は、 cが最も長い波長を持つ受容体です。検出チャンネルは、試料室が蛍光ライトのスペクトル範囲が異なるレコードの同じ位置を表しています。励起と放射の同じ識別子はこのプロトコルで使用される (すなわち、 「青」、「緑」と"red")。

実験的欠点のため測定された蛍光強度はエネルギー転送のみならず、fluorophore およびセットアップ プロパティにも依存します。2 フルオロ間真のエネルギー伝達効率を得るために修正する測定強度があります。次の手順は、参照9に基づいています。明らかな漏れ (lk、すなわち、別の染料のため指定されたチャネルの蛍光体からの光子検出) の明白なガンマ補正係数 (ag、すなわち色素の蛍光量子収率とチャネルの検出効率) 表示するイベントを漂白アクセプター分子トレースから取得されます。

すべての可能な受容体チャネルにドナー色素の漏出、アクセプター色素漂白しますが、ドナーはまだ蛍光記録された蛍光トレース内のすべてのデータ ポイントから計算されます (figure-introduction-3289)。

figure-introduction-3385

漏れヒストグラムの中央値は明らかな漏洩ファクターとして使用されます。漏れの訂正後、明白なガンマ係数はトレースの同じセットによって決定されます。それはアクセプター色素の漂白時にドナーのチャネルで蛍光の変化による受容体チャネルの蛍光の変化を割ることによって計算されます。

figure-introduction-3641

場所c再び、最長波長を持つ受容体の検出チャンネルです。結果の分布の中央値は、明らかな補正係数として使用されます。

各チャンネルで修正された強度は、によって得られます。

figure-introduction-3884

PFによると計算されます。

figure-introduction-4029

別の集団は、 PFs 多次元空間で分離できます。位置と各状態の幅は、継ぎ手の多次元ガウス関数とデータによって決まります。すべてPFトレースに基づく 1 つのグローバルな HMM の後続の最適化は、観測された挙動の定量的な説明を提供します。率の小さな変更は検出です。

Hmm は、騒々しい時間トレースの収集から状態モデルを推定する方法を提供します。システムは、任意の時点と実際の観測 (すなわち、排出量) で隠された状態はこの隠し状態20の確率関数、離散のセットのいずれかにすると見なされます。観察 smFRET データの場合、放出確率bは私の状態は私あたりは連続ガウス確率密度関数でモデル化できます。定期的に間隔をあけられた離散時間ポイントでから 1 つ別の状態への遷移、時不変であり現在の状態にだけ依存する遷移確率によると発生します。遷移行列Aでは、これらの遷移確率ijをすべて非表示のステート間を含まれています。初期状態分布figure-introduction-4674状態固有の確率を与えるfigure-introduction-4750時間トレースの最初の時間の点。最大尤度アプローチを使用して、これらのパラメーターは最高前後バウム ウェルチ アルゴリズム20,21とデータを記述するために最適化できます。最尤推定 (MLE) が得られます。最後に、最も可能性の高い観察の軌道を生成状態シーケンスはビタビ アルゴリズムで推測できます。HMM、単なる「平滑化」のデータが必要とせずデータ セットから抽出運動の状態モデルのドウェル時間を嵌合するための smFRET データ24,25,26の他の HMM 解析と対照をなして使わないヒストグラム27。HMM 解析は、Igor Pro を使用してスクリプトを内部で行われます。コードの実装は、参照21に基づいています。我々 は次のセクション 5 および 6 はこのプロトコル (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret) のために当社ホームページのソフトウェア キットと模範的なデータを提供します。完全なソフトウェアは、リクエストを承ります。

時間でPFを使用してデータ ポイント <-1 またはPF > 任意の検出チャンネルで 2 がすべての州 (10-200) の発生が少ない確率を割り当てられます。これは、これらのデータ ポイントで人工の遷移を防ぎます。

放出確率のパラメーターは、手順 5.7 ガウス関数による 3 D PFヒストグラムのフィットから取得されます。これらのパラメーターは、HMM の最適化中に固定されます。

提示されたアプローチで初期状態分布ベクトルと遷移行列が、トレースの全体のアンサンブルを記述するグローバルに使用されます。参照27に従って、データ セットからのすべてのN分子に基づいて更新されます。

初期状態の配布の開始パラメーターはPFヒストグラム (ステップ 5.3) の投影から決定され、遷移確率に設定されて 0.05 確率を除いて同じ状態に滞在するそのような物選ばれました。特定の状態のままにする確率を団結を正規化します。

プロファイル尤は、すべて移行率21,22不確実性の意味のある見積もりとなるための信頼区間 (Ci) を与えるためです。特定のレートの CI の境界を計算するための関心の遷移確率は尤以外の値に固定されています。これにより、テスト モデル λ'。尤度の尤度比 (LR) 検定figure-introduction-6314によると特定のデータ セット0が実行されます。

figure-introduction-6442

バインド パラメーターはLR 3.841、 2xの 95% の変位値を超えたときに 95% の信頼-1 自由度22,23配布。

Hsp90 を使用してメソッドの力を発揮します。この豊富なタンパク質は、細菌と真核生物で発見され、細胞ストレス応答28の一部です。がん治療29で有望な薬剤標的であります。Hsp90 は各サブユニットの30の N 末端ドメインの 1 つのヌクレオチド結合ポケットのホモです。それは、少なくとも 2 つのグローバル異なるコンフォメーション、閉鎖の 1 つと 1 つ N ターミナル オープン、V 字構造19,31,32間の遷移を受けることができます。二量体の性質は直接 Hsp90 2 つのヌクレオチド結合部位間の相互作用の問題を発生させます。

以下では、データ集録および酵母 Hsp90 とヌクレオチドの 3色 smFRET 実験の解析の手順プロトコルを提供します。蛍光に分類されたアンプ PNP のコンホメーション依存的結合 (AMP-PNP *、非加水分解性 ATP アナログ) が分析します。記述されていたプロシージャのアプリケーション研究ヌクレオチド結合のと同時に Hsp90 のコンフォメーション変化が許認可により Hsp90 の 2 つのヌクレオチド結合ポケットの間の協同性を明らかにします。

プロトコル

1. セットアップおよび前提条件

  1. プリズム型観察で多色 smFRET 測定を実行します。2 色の設定の説明ゼウス パブリケーションが与えられると12を参照します。
    1. マルチカラー観察を構築します。一般的なレイアウトは、 9の詳細です。
    2. 切替可能な使用、ダイオード励起固体の連続波レーザーは、励起パスでメカニカル シャッターの使用を不要なレンダリングします。
    3. 目的を入力する背面側から励起光の裏面の反射を防止する非対称、細長いプリズムを採用してください。
    4. 自動蛍光と収差、画像の中心から外れた領域の歪みなどを防ぎ、できるだけ多くの光を収集する検出パスに 2 インチ非球面色消し石英レンズを使用します。
    5. 別のレンズを持つ EMCCD のチップに焦点を各検出パス。これにより、各検出チャネルの最適な中心します。
      注意:クラス 3B レーザーは、観察で使用されます。これは、彼らが危険な目は直接、公開されるが、拡散反射光は有害ではない場合を意味します。システムを操作する前にレーザーの遵守を地方自治体の条例によると安全上の注意を確認します。
  2. あらかじめ dsDNA のサンプルを使用してセットアップと fluorophore プロパティの補正係数を決定します。
    1. 最長の励起波長を持つ受容体との組み合わせで各染料の 1 つ高フレット dsDNA サンプルを使用 (提示のセットアップ: Atto488-Atto647N, Atto550-Atto647N, Atto594-Atto647N)。DNA は、ビオチンとさらに変更されることを確認します。
    2. 5 サンプルを希釈 nM TNM バッファー (5 mM Tris pH 7.5、5 mM の NaCl、20 mM MgCl2) と 2 mM トロロックス (このバッファーに測定も使用)。
    3. Hsp90 の 2.5 と 2.7 の手順で説明するように、dsDNA を固定します。
    4. 明らかな漏れ (lk) およびアクセプター漂白イベントを示す分子の痕跡から明らかなガンマ (ag) の補正係数を計算します。
  3. ペグ/ビオチン ・ ペッグ パッシベーションされた石英スライドのサンドイッチの流れ区域、側面とカバー スリップの両方に接着剤を薄いフィルムを構築します。詳細プロトコル石英のクリーニングのためのスライドとパッシベーション参照9を参照してください。
    1. 使用厚 (3 mm) 水晶は石英グリセロール水晶プリズムと機能性石英スライド界面散乱レーザー光の収集を防ぐ幾何学的にスライドします。
    2. 薄いの (40 μ m) を使用して、非接着剤側に接着剤を散布、フィルム シールします。薄膜では、表面接続型分子と目的との間の距離を短縮します。80 ° C に加熱し押します。
    3. カバー スリップ上の場所。80 ° C に加熱し押します。プリズム上流れ区域を配置するときは、グリセロールのドロップを使用します。
      注: プリズム、石英スライド、グリセロールの材料、屈折率整合します。
  4. D61 または Q385 位置 2 つ単一システイン ポイント突然変異体の形態の酵母から Hsp90 を表現します。分からなかった濃度で二量体の解離を防ぐために C ターミナル コイルド コイル モチーフを追加します。別に突然変異体蛋白質のラベルし、するアミノ酸位置 61 Atto488 とアミノ酸位置 3859時 Atto550 ラベルを取得するモノマーを交換します。

2. 測定

  1. カメラのソフトウェアを起動し、以下に指定した画像のパラメーターを設定します。
    1. 暗電流ノイズを減らすため、できるだけ (外部の水冷却を用いる-95 ° C) 低冷却センサーの温度を設定します。
    2. 単一分子の録音のために最適化されたカメラの設定を使用: 3.3 μ 秒垂直シフト速度、通常垂直クロック電圧利得 17 MHz 16 ビット水平読み出し、中古増幅利得 3、電子増倍 1,000。
    3. 750 の取得サイクルの長さに「外部」を獲得、露光時間は 70 さん記録映画のトリガーを設定します。
      注: は、EMCCD センサーの飽和を防ぐためにカメラを取得する場合部屋の光をオフに。
  2. 測定のためのローカルの SSD にフォルダーを作成します。ソフトウェアの設定は、< 自動保存 > ライダーに行く < 自動保存 > を有効にしてムービー獲得のためファイル形式に「Tiff」を選択。自動保存場所として SSD 上のフォルダーを選択します。
  3. 検出パス、およびカメラのシャッター コントロール音響光学波長可変フィルター (AOTF)、レーザーの動作を制御するソフトウェア、レーザー、AOTF、同期トリガー ソフトウェア ソフトウェアを開始します。(Ca. 3 mW、プリズムに入る前に) AOTF を用いたレーザー パワーを調整し、適切なトリガー パターンをロードします。
  4. プリズムと流れ区域サンプル ホルダーをマウント、チューブを接続、遠心カップでインレット チューブを配置し、アウトレット チューブをシリンジ ポンプに接続します。チャンバー内に約 150 μ L バッファーをフラッシュでは、励起を合わせ梁、およびフォーカス。約 10 のレーザー パワーとスライドの完全な検出範囲に沿ってゆっくりと移動することによって表面に蛍光汚染物を漂白剤すべてレーザー用 mW。これに約 1 時間かかります。
    注: それ以外の場合記載されていない場合、使用されるバッファーが含まれています 40 mM HEPES pH 7.5、KCl、150 mM と 10 mM MgCl2。
  5. 商工会議所に NeutrAvidin ソリューション (バッファーに 0.25 mg/mL) の約 300 μ L をフラッシュし、商工会議所を通じて BSA 溶液 (バッファーで 0.5 mg/mL) の 1 分バッファーとフラッシュの約 300 μ L で非連結 NeutrAvidin 洗い流す間インキュベートします。
    注: このブロックの残りの表面機能化は、表面に BSA の非特異的吸着による欠陥します。
  6. ビオチン標識の約 150 μ L での流れ区域を読み込むことによってサンプルを固定し、(希釈バッファー + 0.5 mg/mL BSA) 上昇濃度で Hsp90 をラベル濃度の場合では通常十分な表面密度に到達するまで5-22。約 300 μ L バッファー + 0.5 mg/mL BSA 自由な蛋白質を洗浄します。
  7. 25 の 150 μ L にフラッシュ AMP-PNP nM * バッファー + 0.5 mg/mL BSA。それは 5 分間インキュベートし、正しい塩基濃度を確保するため一度このステップを繰り返してみましょう。
    注意: 追加、ラベルのない AMP-PNP 存在下での実験用追加 250 μ M AMP-PNP。
  8. データ集録を開始します。データの適切な量の約 1.5 時間がかかる約 20 の映画を取得します。
    1. ビューのフィールドを変更するピエゾ ステッピングと励起光に垂直な試料室の位置を移動します。
    2. 必要な場合は、目的の高さを制御する z ピエゾとフォーカスを調整します。これ必要ないはずなく傾斜測定チャンバーがマウントされたときにあまりにも頻繁です。
    3. < を取る信号 > を押すとカメラのソフトウェアのカメラの記録を準備し、トリガー ソフトウェアで < スタート >] ボタンを使用して励起/集録サイクルを開始します。これは蛍光強度の集録を開始します。
  9. チャネルの登録を実行するには、最初のセットアップのすべての検出チャンネルのスペクトル範囲の蛍光性の放出を示す蛍光ビーズと一緒に映画を記録します。明るいスポットを検索して校正映画でビードの位置を検出し、ガウス分布から中央位置合わせ強度プロファイルを決定します。すべてのチャンネルである、x のと度 3 つ9の 2次元多項式と y 方向の両方のマッピングのオフセットに合わせてビーズの座標を保存します。

3. 単一分子のトレースの選択

  1. データ分析は、Igor Pro を使用してスクリプトを内部で行われます。"IniTIRF.ipf"を開くことによってすべての必要なスクリプトをロードし、実験の適切な型を選択します。
    注: 以下では、<] ボタン > メニューまたはユーザー インターフェイスのクリック可能な要素を指定します。関数呼び出しは、引用符、例えば、 「印刷「こんにちは世界」」で示されます。これらのコマンドは、(それを囲む引用符) Igor Pro のコマンドラインに貼り付けることができます。
  2. 検出チャンネル登録パラメーターが読み込まれていることを確認します。
  3. クリックして GUI を開始 < 新しい smFRET |GUI の分析 >。
  4. それぞれのチャンネルの強度を保持する (すなわち512 × 512 ピクセル 16 ビット TIFF スタックとして格納されますとフレームのシーケンス) のムービーをロードします。< ロード フィルム > ボタンを押すと他の後いわゆる「マスター」と「スレーブ」カメラの 1 つからファイルを選択することによってこれを行います。
  5. 特定のチャネルの検出の最初の 5 フレームの合計の最も明るい部分を捜すことによって潜在的な分子の位置を識別します。チャンネル マッピングからの他のすべての検出チャンネルに対応する位置を計算します。蛍光強度のトレースを取得するには、各フレームの中央の位置の周囲ピクセルの正方形の強さを合計します。GUI で < 検索トレース > ボタンを押すことによってこれを行います。
    注: (ピクセル) の正方形の側面の長さによって与えられる: 2 * < 合計 Pxs > + 1。
  6. 各分子の励起同色の場所のすべてのトレースの合計として共同生強度トレースを計算します。次の条件のすべてのチャンネルで分子の強度プロファイルを評価します。
    1. 共同生強度と単一漂白でほぼ平らな台地がすべて励起色、適切な検出チャンネルで anticorrelated 現象は、赤い蛍光性の検出のステップ (バインドされたアンプ PNP にフレットを示す *) 以内に、トレース、および 2 アンプ PNP の存在を示す赤い蛍光性のない複数のステップ * 1 つの Hsp90 ダイマーにバインドします。
  7. これらの条件が満たされている場合は、さらなる分析のためのスポットの蛍光トレースを保存します。カーソルのトレースを選択して「タイムライン」グラフの < 保存 >] ボタンを押すことによってこれを行います。青い映画あたり約 200 分子励起後 3 つの検出チャンネル強度トレースを手動で検査します。

4. 部分的な蛍光の計算トレースします。

  1. 保存された分子の 1 つのためのすべての蛍光強度トレースを表示します。グラフでカーソルを使用すると、時間範囲を選択します。
  2. すべて fluorophores が既に漂白されている時間間隔を選択します。平均背景強度は、この範囲から計算され、各チャンネルの輝度トレースから減算します。< 背景 >] ボタンを押すことによってこれを行います。
  3. とも染料が Hsp90 に添付 FRET 効率範囲を選択 (Atto488 と Atto550) があります。点滅のイベントを含むトレースを除外するを確認してください (図 3B参照)。これらのイベントは、他のチャネルに伴う増加なしの 1 つのチャネルでドロップイン蛍光強度が特徴です。
  4. PFトレースを計算します。< PF Calc >] ボタンを押すことによってこれを行います。明らかな漏れ (lk) および明白なガンマ (ag) の定義済み補正係数は、光物理の修正するために生の強度に適用されるセットアップ プロパティと。

5. 人口の選択および 3 D ヒストグラムの当てはめ

  1. PFトレースで低信号対雑音比を示す分子を削除します。間隔を超える [-1; 2] 任意のPFのトレースでフレームの 10% 以上の分子は、データ セットから削除されます。これを行うには、コマンド ウィンドウから"RemoveTracesLowSNR()"を実行します。
  2. PFデータのビン分割投影を計算します。プロットfigure-protocol-6094をfigure-protocol-6162とfigure-protocol-6232をfigure-protocol-6300100 × 100 箱の解像度を持つ範囲 [-0.5; 1.5]。これを行うには、次のコマンドを実行します。
    1. "HistFret2D (「r_b」、"r_g"binHist = 100)」
    2. "HistFret2D (「r_b」、"g_b"、binHist = 100);MoveWindow 553.5、42.5、1055.25、508.25」
  3. 各区別、投影州の相対的な人口を決定します。
    1. 適切なグラフを前面に移動し、"panelHist2DCount()"を実行します。
    2. < Init > ボタンを押すし、ピークの周り無料手多角形を描きます。
    3. [< カウント >] ボタンをクリックします。多角形のデータ ポイントの数と投影のデータ ポイントの合計数は、コマンド ウィンドウに出力されます。
  4. 実行してPFデータの 3次元ヒストグラムを準備"HistFret3D ("g_b、""r_b"、「r_g」)」。
  5. 1 の整数を 3 D ヒストグラムを正規化します。次のコマンドを実行します。
    1. 「NewDataFolder/S fit0」
    2. 「重複/O:: フレット: Hist3D、Hist3D」
    3. "可変/G div = sum(Hist3D)*(DimDelta(Hist3D,0)) ^3」
    4. 「Hist3D = div;/印刷部"
  6. 3 D ガウスの初期パラメーターに合わせて、必要なデータ構造を準備を提供します。
    1. "Gauss3D_initParam(); を実行します。"W_coef_old を編集します。
    2. 状態の人口をパラメーターのベクターの末尾に追加します。
    3. "Gauss3D_prepareFit()"を実行します。
      注:W_coef_old は、フィットの初期パラメーターを保持するベクトルです。つまり、状態ごとfigure-protocol-7357と同州の人口は、ベクターの末尾に連結します。共分散マトリックスは対称であることを確認します。
  7. S区別できる状態の数をされていると 3 D のPFヒストグラムとS 3 D ガウス関数の和に合います。
    1. "Do3D()"を実行します。これは初期パラメーターの品質に応じて通常のオフィスの PC で 1 時間以上かかることがあります。
    2. "PostprocessFitMultiGauss3D(); を実行します。evalFitMultiGauss3D();"W_coef を編集します。
  8. フィットの結果を表示します。2 2D プロジェクションのそれぞれに対して、次のコマンドを使用します。
    1. 「contourPF3D_new(0)。contourPF3D_new(1);contourPF3D_new(2);contourPF3D_new(3);contourPF3D_new(4)」
    2. "contourPF3D_colorize()"

6. 動態解析 3 D アンサンブルうーん

  1. アンサンブル HMM 運動情報を抽出するために実行を準備します。1 つの HMM は、データ セット内のすべての分子から最適です。前の手順で取得した情報を使用して、3 D のPF空間の位置と各状態の幅を定義します。
    1. HMM のユーザー インターフェイスを初期化 (< HMM |Init うーん >) 状態の適切な数を選択 (Hsp90 データの場合、これは < NumStates > を意味 = 5)、入力信号の次元の数 (< NumDims > = 3)、および入力の種類 (< 入力 > =「フレット 3 D bgr」)。
  2. HMM の尤度が収束ソフトウェアをさせることにより、HMM のパラメーターを最適化 (実行"prepENS_CONVERGE_gB(GetDataFolder(1)、-14)」) 前のイテレーションと比較して遷移行列の変更 (10-14 しきい値を下回るまで各遷移確率の絶対変更の合計)。これは、通常のオフィスの PC に約 1 時間の遷移確率の MLE を得られます。
  3. データ (例えば、データ セット全体の 75%) のサブセットの人口の選択、ガウス継手と HMM 最適化を繰り返します。さまざまな実験から完全なデータ セットがマージされた場合、また各単一の実験の最適化を繰り返します。サブセットの解析マニュアルの人口の選択、データ セット内のばらつきの不確かさを推定することができます。
  4. データ セットの不均一性と HMM の精度について報告する遷移確率の CI を計算します。
    1. 「Cd $(ルート: path3Dimport +"うーん"); を実行して CI 境界の大まかな推定値を得るloop_getCI_estimate_limits()."
    2. 実行することにより、CI の正確な制限値を計算します。
    3. "loop_getCI_HMM_converge(1)"
    4. "CIresults_conv_new()"
    5. 「cd:: HMM_CIresult;reportCI_conv()」
    6. 「cd:: cmp_CI_conv;CI_plot2 (「うーん」、doAppend = 0)"
  5. 解釈を簡素化する運動情報を凝縮します。
    1. 標識ヌクレオチド Hsp90 にバインドされたまま時刻に関する情報を収集します。崩壊アンプ PNP にバインドされている状態でこれを行う * (すなわちS1S2 S3、また図 2を参照)、ドエル時間ヒストグラムをコンパイルします。「Cd $(ルート: path3Dimport +"うーん"); を実行します。collapse_states_get_DT({0,1,1,1,0})」、S0と S4 S1、2S、S3の状態を組み合わせたの宿る。
    2. 関心の各状態のビタビ復号のパスから滞留時間を抽出し、異なる実験条件の結果のドエル時間ヒストグラムを比較します。「Plot_collapsed_DT_Hist (wDTo_01110_record1)」を実行します。
    3. 詳細な画像を個別にPFが容易、さらにデータ分析、例えば、ラベル付き Hsp90 とヌクレオチド、状態 S2 S と 3 色の実験の場合と機能的に同じ状態を折りたたむ3を折りたたむことができます。"Collapse_states_get_DT({0,1,2,2,4})"を実行します。

結果

マルチカラー smFRET 測定は、2 つ以上の異なる相互作用部位との相関の直接検出を許可します。これは蛋白質の複合体などの多成分システムを検討するユニークな技術をレンダリングします。具体例として 3 色 smFRET 実験がここでは、プレゼンテーションに着目します。

図 1にメソッドの一般的なワークフローを示します。最初の部分には、プリズム式全反射顕微鏡にマルチカラーの smFRET データの記録が装備されています。付着戦略とセットアップの回路図は、図 2 aに描かれています。セットアップの詳細な説明、9を参照を参照してください。提示されたメソッドの 2 番目の部分は、データの分析に焦点を当てください。図 2 bには、模範的な蛍光強度トレースが表示されます。適当な時間をトレース表示: (i) (ii) フラットの強度の高原、Hsp90 に接続されている両方の fluorophores の明確な漂白ステップ (iii) 反相関動作対応するチャンネルのアンプ PNP の (iv) 少なくとも 1 つのバインディング イベント * (図 3)。選択条件を満たす以上 400 の分子は、信頼性の高い統計を生成するために選ばれました。研究システム 5 つの州は機能的に異なる (図 2) をされている 4 つの州での蛍光強度で区別できます。

蛍光強度からトレース部分の蛍光 (PF、FRET 効率多色 smFRET 実験のための拡張) することができます (図 4 a) を計算します。PFの染料の近さに関連しています。3色 smFRET 実験では、データは、3 D 空間 (図 5 b) をまたがっています。3 D ヒストグラムの投影 (図 4 bC) の国家の分離に有用であると証明しました。成功した実験で応用実験条件下で理論的に予想されるすべての状態は、2 D プロジェクションでのPFで区別。

州の相対的な人口は、ピーク (図 5) を囲む図面の無料手ポリゴンによって、投影から決定されます。このアプローチは、正確で信頼性の高い9をことが判明しました。HMM の放出確率がSが区別できる状態 (5 枚提示された場合の数は、3 D のガウス関数の和と 3 D のPFヒストグラムを適合させて得られる図 5)。正しく収束するこのフィット感、位置と、ガウス分布の幅は自由に一定に保たれる、のみ、相対的な人口pは私の各状態私があります。

1 アンサンブル HMM は、ガウス フィット (図 6) から得られたパラメーターに固定放出確率と完全なデータ セットを最適化されています。各移行は、抽出された遷移確率, 95 %ci の不確実性の測定を得るために (図 7) を決定します。

さらに、平均時間を AMP-PNP ラベル記者ヌクレオチド * Hsp90 にバインドされたまま異なる実験条件 (図 8 a) の下で得ることができます。これは、さらに結果の複雑さを軽減するのに役立ちます。そう、AMP-PNP を表す状態 * 連結および非連結の立体構造がそれぞれ状態軌道に折りたたまれています。これから平均滞留時間アンプ PNP * 解離することができます (図 8 b) を算出します。

有無やその他の存在にみられる反応を比較すると、Hsp90 のコンフォメーション変化とヌクレオチド状態の相関に関するラベルのないアンプ PNP、ユニークな情報を得ることができます。これは Hsp90 の 2 つのヌクレオチド結合ポケットの間の協同性を直接研究することが可能になります。その上、基質濃度 (例えば、丘プロット) の関数としてバインド サイト職業を測定の滴定実験の必要性を回避できます。Hsp90 などの非常に動的な蛋白質のシステム、このアプローチは料金11の小さな変化に敏感またです。

figure-results-2658
図 1: データ集録および解析の一般的なワークフローです。マルチカラー smFRET 全反射蛍光顕微鏡 (TIRFM) のデータを取得します。後にトレース選択と部分の蛍光 (PF) の計算、3 D のPFヒストグラムとその投影がコンパイルされます。2 D プロジェクションを使用すると、すべての識別可能な州の人口を決定できます。これらは、 PFのヒストグラムに合わせて 3 D ガウスの制約として使用されます。その後の 3 D のアンサンブルのための放出確率としてガウス確率密度関数隠れマルコフ モデル (HMM)。これはシステムの運動の説明を生成します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-3279
図 2: データ集録のスキーム。Hsp90 ダイマーの研究体制の (A) 絵文字 (黄色の楕円は、ドメイン構造を表す) Atto488 (ブルー)、Atto550 (緑) のラベルと AMP-PNP 記者ヌクレオチド表面に付着した * ソリューションで付いたAtto647N (赤)。データは、レーザ励起 (アレックス) を交互にプリズム式全反射顕微鏡に記録されます。青と緑の励起後 (B) 模範的な蛍光強度 (フロリダ州 int.) 跡。Hsp90 の区別の構造状態の (C) 絵文字 (S0S1S2S3,4S) との機能的状態 (O、C、O *、C *) この作業で使用する彼らのそれぞれの識別子。赤、緑、青の蛍光体の位置が示されます。2 つの集団が同じの機能状態を表す、すなわちアンプ PNP と Hsp90 を開く * (S2と S3) をバインドします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-4105
図 3: 選択条件。(A) A 分子がさらなる分析のために選択します。(B、 C)分子は、さらなる分析のために選択されていません。(B) フラットの高原と Atto550 がない暗い状態で約 30 (矢印によって示されます) 緑の励起後 s。(C) (矢印によって示されます) 緑の励起後の手順を複数の漂白します。階の int 型: 蛍光強度、青: Atto488、グリーン: Atto550、赤 Atto647N、ex: 励起。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 4: PFトレースと代表的なヒストグラムの計算。(A) 代表的な蛍光強度 (フロリダ州 int.) トレースと対応する部分的な蛍光 (PF) トレース。(B) 2 つの追加、ラベルのヌクレオチドの不在で測定 3 D PFヒストグラムの投影。(C) 追加の 250 μ M の存在下で実験のため同じ予測 AMP-PNP。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-5276
図 5: 人口選択プロセス。(A) 2 つの 2D プロジェクションに区別可能な個体の位置。(B)図 2のピクトグラムのコピー。(C) 代表的な 3 D 散布図PFデータの。データ ポイントの色は、可視化のみです。B と同じ色のコードを使用します。(D) 相対的な集団による、2次元ヒストグラムのピークの周囲にフリーハンド ポリゴンを描画することによって行われます。図 3に示した 2 つの投影法の組み合わせを使用して、すべての 5 つの集団を区別できます。A. 描かれた内のPFデータのヒストグラムに合わせて 3 D ガウスの (E) 結果は、5 つの異なる集団を表す、半値幅で等値面です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

figure-results-6051
図 6: アンサンブル 3 D HMM 最適化のフローチャート。1 つのモデルは、データ セットからのすべての分子に最適です。開始値は、状態数が事前に定義された) (入力モデルによって与えられます。与えられたデータ (3 D PFトレース) モデルの尤度前後 (FB) アルゴリズムで評価しています。バウム ・ ウェルチ (BW) アルゴリズム パラメーターのローカルの最尤推定 (MLE) が得られます。グローバルの MLE は、繰り返し見つけることが。ビタビ アルゴリズムは、モデルを与えられて最も可能性の高い状態の軌道を計算します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 7: CI と有意義な不確かさの推定します。(A) 1 つの模範的な速度定数 CI の決定。最尤推定 (MLE) モデルと比較してテスト モデルの尤度比 (LR) は、速度定数の MLE 一帯で計算されます。LR 3.841 (水平方向の暗い灰色の線) を超えたとき、バインドされている 95% の信頼は達されます。(B) 抽出率定数追加ヌクレオチド (赤) と (青) のアンプ PNP とその 95% 信頼区間。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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図 8: 平均滞在時間 AMP-PNP 記者ヌクレオチドの * 追加塩基の存在下で Hsp90 をバインドを延長します。ラベルの付いたアンプ PNP の観測の解離の (A) ピクトグラム * Hsp90 のすべての構造を平均 Hsp90 ダイマーから。Hsp90 のドメイン構造は黄色の楕円形で描かれ、構造の柔軟性は、オープンとクローズのダイマーを重ねることによって示されます。(B) 平均滞在時間アンプ PNP の * 追加ヌクレオチド (赤) の不在とアンプ PNP (ブルー) ラベルなし 250 μ M の存在で、Hsp90 にバインドされています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

ディスカッション

複雑なタンパク質系のこれらの測定値の分析の手順を追って説明 3色 smFRET データを取得する実験を紹介します。このアプローチでは、直接複数の相互作用部位や構造変化との相関を評価するユニークな可能性を提供しています。

タンパク質の適切なマルチカラー分子データを得るために低ノイズ レベルで再現可能な測定を行うことが重要です。これは、フロー商工会議所9効率的かつ信頼性の高い表面不活性化プロトコルを使用して実現できます。表面に固定化された分子の十分な密度は分子記録映画あたりの収量を高めるために使わなければなりません。これは、光の単一分子からの蛍光が記録されたイメージのピクセルの約 5-10% に当たるべきことを意味します。同時にオーバー ロードしないようにする、隣接する分子の重複になりますので。ラベルの付いた種がソリューションで無料 (AMP-PNP * 提示における)、濃度が低く、短い波長をもつレーザーから直接励起による測定に干渉されていないかどうかを確認 (すなわち、通常、マイクロモル以下も濃度)。また、これらの化合物の濃度はインタ フェースへの非特異的結合によるものよりも低くないことを確認します。さらに、最適な励起電源は、信号対雑音比と、蛍光物質の変質のトレードオフを表します。

提案するプロトコルの酸素消去システムは採用されていません。使用されている Atto テック染料が重要な実験 (励起サイクルあたり照明 70 ミリ秒) の時間スケールで点滅表示されず、グルコース酸化酵素、カタラーゼ、トロロックス33 成るスカベン ジャー システムによって写真漂白剤率の低下認められなかった ,34。また、酸素スカベン ジャーの不在は、酸素清掃システムは通常最大35マイクロモル濃度のタンパク質成分を含んでいる非特異的タンパク質相互作用によるアーティファクトを回避できます。

もう一つの重要なステップは、トレースが選択されます。単一分子蛍光の強度の合計のための領域のサイズが可能ですが、点広がり関数の設定のより静かでより大きいのような小さなに選ばれました。フラットで高原を検出チャンネルが似たような明白なガンマのトレースが期待できます共同強度要因、トレース分析のこの段階で修正されていないので注意してください。(セクション 3) における蛍光強度の痕跡を明確に定義された条件を満たす分子のみが含まれます。PFのトレースに貧しい信号対雑音比を持つ分子は、さらに分析から除外され、条件を使用する選択をクリアとしてデータの評価には影響を与えません。

データ品質に応じて代替的なアプローチは、最適な状態の割り当てを提供します。無料多次元アンサンブル HMM に基づいているか蛍光強度トレース27かPFトレース対応する放出確率を (例えばガウスを最適化することによって基になる状態の割り当てに適用できません。Pdf ファイル) 同じに、キネティック モデルを最適化します。両方のアプローチにはそれぞれ長所と短所があります。PFのトレースは、蛍光強度レベルの異なる分子から分子間不利なスパイクを含めることができます。提示プロトコルにより人工の遷移、スパイクが発生した場合、 PFのヒストグラムに合わせて 3 D ガウスから放出確率の推定とその後の遷移確率を最適化するだけでこの問題は解決します。アンサンブル HMM を実行します。

提示されたアプローチは、従来の単一分子計測に必要な低濃度と互換性があるために比較的高い親和性と結合する標識の相互作用パートナーの必要性によって制限されます。これはローカル濃度 (相互作用パートナー36のテザリング、小胞37,38のカプセル化) または (例えば、ゼロモード興奮して音量を下げる方法を増やす戦略によって克服される可能性があります。導波路39)。また、慎重に選択する必要があるラベルの位置、制御実験は、fluorophores の重篤な副作用を排除すべき。Hsp90 の場合、これは通常40酵素活性を証明する atpase 活性アッセイによってチェックされます。場合は、結晶または NMR 構造からの構造情報が考慮されなければなりません。最寄りの位置は相互作用のインターフェイスから、表面に露出したループで、タンパク質表面ポケットの中に埋没してしまわない。これは染料の大量アクセスを保証します。

フレームワークは、任意の数の色のマルチカラー smFRET 実験に適しています。ここでは、3 色の測定に着目し、これらは既に他の単一分子の実験、すなわち、2 つのプロセス間の相互関係を直接観察する可能性から個別属性を表示する機能を提供 (のバインディングなど相互作用パートナーと構造変化)。この情報は、標準の 2 色 smFRET 実験ではアクセスできないが任意の分子機械の機能を理解するための基本的な関心は。

提示実験と解析3自体は、非常に柔軟な状態間の時間スケールの広い範囲でダイナミクスを表示可能性があります蛋白質システムを特徴付けることができます。これは、ホリデー接合など4(大抵 2) 明確に定義された状態間の遷移を示す DNA または RNA のモデル システムに焦点を当てて、以前に発行されたマルチカラー smFRET 実験を対照的です。タンパク質における信号対雑音比が低いとフォトブリーチングによる smFRET 実験で一時的な帯域幅が限られたため、遷移確率の完全なセットを抽出は難しい。ここでは、我々 を示す - と合理的な制約 - 慎重に適用されている場合測定蛋白質システムで障害克服できる多次元状態割り当てとアンサンブルの隠されたマルコフ解析9を使用してマルチ カラー smFRET と。

開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

この作品は、ドイツ研究振興協会 (INST 39/969-1) し ERC 助成契約 n. 681891 を通じて欧州研究評議会によって資金を供給します。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Setup
vibration-damped optical table  Newport, Irvine, CA, USARS2000
OBIS 473nm LX 75mW LASERCoherent Inc, Santa Clara, CA, USA1185052
OBIS 532nm LS 50mW LASERCoherent Inc, Santa Clara, CA, USA1261779
OBIS 594nm LS 60mW LASERCoherent Inc, Santa Clara, CA, USA1233470
OBIS 637nm LX 140mW LASERCoherent Inc, Santa Clara, CA, USA1196625
laser control unitCoherent Inc, Santa Clara, CA, USA1234465Scientific Remote
aspheric telescope lensesThorlabs Inc, Newton, New Jersey, USAd=25.4mm, f=50mm and f=100mm
CF ex1AHF analysentechnik AG, Tübingen, GermanyZET 473/10cleanup filter excitation
CF ex2AHF analysentechnik AG, Tübingen, GermanyZET 532/10cleanup filter excitation
CF ex3AHF analysentechnik AG, Tübingen, GermanyZET 594/10cleanup filter excitation
CF ex4Thorlabs Inc, Newton, New Jersey, USAFL635-10cleanup filter excitation
DM ex1AHF analysentechnik AG, Tübingen, GermanyZQ594RDCdichroic mirror excitation
DM ex2AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany570DCXRdichroic mirror excitation
DM ex3AHF analysentechnik AG, Tübingen, GermanyZQ491RDCdichroic mirror excitation
AOTFnC-VisAA Opto-Electronic, Orsay, France
λ/4 plateThorlabs Inc, Newton, New Jersey, USAAQWP05M-600
CFI Apo TIRF 100xNikon Instruments Inc, Melville, NY, USAhigh-NA objective
piezo focus positioner MIPOS 250 CAPpiezosystem jena GmbH, Jena, GermanyPiezo Controller NV 40/1 CLE
piezo stepperNewport, Irvine, CA, USAPZA12PZC200-KT NanoPZ Actuator Kit
achromatic aspheric lensesQioptiq Photonics GmbH & Co. KG, Göttingen, GermanyG322-304-000d=50mm, f=200mm
adjustable optical slitOwis GmbH, Staufen i. Br., Germany27.160.1212max. aperture 12 x 12 mm
DM det1AHF analysentechnik AG, Tübingen, GermanyT 600 LPXRdichroic mirror detection
DM det2AHF analysentechnik AG, Tübingen, GermanyH 560 LPXR superflatdichroic mirror detection
DM det3AHF analysentechnik AG, Tübingen, GermanyHC BS R635dichroic mirror detection
BP det1AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany525/40 BrightLine HCbandpass filter detection
BP det2AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany586/20 BrightLine HCbandpass filter detection
BP det3AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany631/36 BrightLine HCbandpass filter detection
BP det4AHF analysentechnik AG, Tübingen, Germany700/75 ET Bandpassbandpass filter detection
optical shutters detectionVincent Associates, Rochester, NY, USAUniblitz VS25S2T0 
EMCCD iXon Ultra 897Andor Technology Ltd, Belfast, Northern Ireland
digital I/O card, PCIe-6535National Instruments, Austin, Texas, USA
syringe pumpHarvard Apparatus, Holliston, MA, USAPHD22/2000
NameCompanyCatalog NumberComments
Flow chamber
quartz slidesG. Finkenbeiner Inc, Waltham, MA, USASpectrosil2000, h=3mm
TEGADERM film3M Deutschland GmbH, Neuss, Germany1626W10 x 12cm
spray adhesive3M Deutschland GmbH, Neuss, GermanyPhoto Mount 050777
glycerolCarl Zeiss AG, Oberkochen, GermanyImmersol G
immersion oilOLYMPUS EUROPA SE & CO. KG, Hamburg, GermanyIMMOIL-F30CC
prismVogelsberger Quarzglastechnik GmbH, Hauzenberg, GermanySuprasil1
aluminium prism holdercustom built
hollow setscrewsThorlabs Inc, Newton, New Jersey, USAwith custom drilling
Tygon S3 E-3603 tubingneoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany2-4450ACF00001
PTFE tubingBohlender GmbH, Grünsfeld, GermanyS1810-08
NameCompanyCatalog NumberComments
Sample
yeast Hsp90 D61C, Q385C_biotinUniProt ID P02829
Maleimide derivatives of Atto488, Atto550ATTO-TEC GmbH, Siegen, Germany
AMP-PNP*Jena Bioscience, Jena, Germanyγ-[(6-Aminohexyl)-imido]-AMP-PNP-Atto647N
FluospheresThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAF8764amine-modified, 0.2 μm, yellow-green fluorescent
NameCompanyCatalog NumberComments
Software
Andor SolisAndor Technology Ltd, Belfast, Northern Irelandversion 4.30
LabVIEWNational Instruments, Austin, Texas, USAversion 2012, 32bit; misc. hardware control
MDS control softwareAA Opto-Electronic, Orsay, Franceversion 2.03a
Coherent ConnectionCoherent Inc, Santa Clara, CA, USAversion 3
Igor ProWaveMetrics Inc, Portland, OR, USAversion 6.37

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