באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבל נתונים smFRET תלת-צבעי וניתוח שלה עם אנסמבל תלת-ממד מודל מרקוב חבוי. מתוך תפיסה זו, מדענים יכולים לחלץ מידע קינטי מערכות חלבונים מורכבים, כולל cooperativity או אינטראקציות מתואם.

העברת אנרגיה תהודה של מולקולה בודדת פורסטר (smFRET) הפך טכניקה biophysical בשימוש נרחב כדי ללמוד את הדינמיקה של מולקולות. עבור רבים למכונות המולקולריות בחלבונים התא יש לפעול יחד עם שותפים אינטראקציה במחזור תפקודית כדי למלא את המשימה שלהם. ההרחבה של שני צבעים לצבע מרובה smFRET מאפשר לחקור בו זמנית אינטראקציה אחד או יותר או לשינוי הסתגלותי. זה לא רק מוסיף מימד חדש ניסויים smFRET אך גם מציעה את האפשרות ייחודי ללמוד ישירות רצף האירועים כדי לזהות אינטראקציות מתואם כאשר באמצעות דוגמה קיבוע פלורסצנטיות החזרה גמורה מיקרוסקופ (TIRFM). לכן, צבע רב smFRET הוא כלי רב-תכליתי ללמוד למערכות ביולוגיות מתחמי באופן כמותי, בפירוט שעצם בעבר.

כאן, אנחנו מדגימים כיצד להתגבר על האתגרים המיוחדים של צבע רב smFRET ניסויים על חלבונים. אנו מציגים נתונים היסטוריים פרוטוקולים להשגת הנתונים, לחילוץ מידע קינטי. זה כולל מעקב קריטריוני הבחירה מהמדינה, ההתאוששות של המדינה מסלולים מתוך נתוני רעש באמצעות אנסמבל תלת-ממד של מודל מרקוב חבוי (הממ). לעומת שיטות אחרות, המידע קינטי לא החלים להתעכב זמן היסטוגרמות אלא ישירות מאת הממ. המסגרת נראות מקסימלית מאפשר לנו להעריך באופן ביקורתי את מודל קינטי וכדי לספק אי ודאות משמעותיים על המחירים.

על-ידי החלת שיטת שלנו החלבון הלם חום 90 (Hsp90), אנו מסוגלים disentangle האיגוד נוקלאוטיד והשינויים הסתגלותי הכללית של החלבון. זה מאפשר לנו לצפות ישירות את cooperativity בין איגוד נוקלאוטיד שני הכיסים של דיימר Hsp90.

חלבונים רבים ממלאים תפקידם במתחמי דינמי עם מולקולות אחרות, מתווכת על-ידי שינויים הסתגלותי ואגודות ארעי על מגוון רחב של צירי זמן-^1,-^2,-³. מצמידים חיצוני כמקור אנרגיה (למשל, ATP) אינטראקציות דינמי אלה יכולים להוביל כיוון במחזור פונקציונלי ולתחזק בסופו של דבר ללא שיווי משקל היציב-המדינה בתא, תנאי מוקדם לכל החיים.

כדי להבין באופן מלא את מכונות מולקולריות אלה, תיאור סטטי מודרכת על ידי מחקרים מבניים אינה מספיקה. בנוסף, זה חיוני לא ידע קינטי מהמודל המשמש כבסיס וכדי לקבוע את קבועי קצב קינטי. קיימות מספר שיטות לאפשר לחוקרים ללמוד את הדינמיקה של האינטראקציות בינארית בין שתי מולקולות של עניין, למשל, פני השטח פלזמון תהודה, שיטות הרפיה עם הבדיקה ספקטרוסקופיות (למשל, קפיצה או זרימה עצר טכניקות), ותהודה מגנטית גרעינית. אולם, ישימות שלהם הוא ברוב המקרים מוגבל שתי המדינות מערכות פשוטות (למשל, אחד מאוגד, מדינה לא מאוגד) עקב בממוצע הטמון בניסויים בצובר. במקרים שבהם מעורבים יותר מדינות או intermediates, הן מפיקות רק תערובת מורכבת של הקבועים קצב. מולקולה בודדת שיטות כגון פינצטה אופטית או מגנטי או smFRET שני צבעים, קרי, תורם אחד אחד מקבל fluorophore, עם דגימת משטח. מרותק למיטה יכול לשחזר את קבועי קצב לכל נצפו שינויים הסתגלותי. אולם, כשמדובר אינטראקציות המשפיעים על אתר קישור אחד או יותר, שיטות אלה נשארים מוגבל, המידע לאינטראקציות מתאם אפשרי של השניים (או יותר) רק יהיה נגיש דרך עקיפה מסקנות ערכה של ניסויים.

צבע רב smFRET^4,5,6,7,8,9 מציע הזדמנות ללמוד את האינטראקציה בין רכיבים אלה באופן ישיר, בזמן אמת, תחת תנאים ליד-פיזיולוגיים¹⁰. זה מתיר אחד לחקור לדוגמה, הכריכה תלויי-קונפורמציה של ליגנד או חלבון אחר^8,9,11. הגישה הכללית המובאת כאן היא לסמן את protein(s) של עניין-עמדות מסוימות, כדי לצרף חלבון אחד על פני השטח של התא מדידה, וכדי לעקוב אחר עוצמת קרינה פלואורסצנטית לאורך זמן על TIRFM פריזמה-סוג (עבור פרטים ראה ^{9 , 12}). הקרבה המרחבי של צבעים שונים ואז יכול להיקבע מתוך העברת האנרגיה ביניהם. תיוג אסטרטגיות עשויים להשתנות מחלבון לחלבון (נבדקה ¹³), קווים מנחים כדי להימנע חפצים במדידות smFRET קיימים¹⁴.

מאז צבע התורם יכול להעביר אנרגיה שונה מקבל צבע בניסוי צבע רב smFRET, המיקום היחסי של כל צבעי אינו נגיש של עירור של צבע אחד לבד^15,16. אבל בשילוב עם מתחלפים עירור לייזר (אלכס¹⁷, ו שנסקרה ב ¹⁸) שיטה זו מספקת את כל המידע-עתיים-פחות משנייה והרזולוציה תת ננומטר.

המנהל, נתוני מבנה יכולה להיות מושגת על ידי שימוש של המרחקים בין צבע ברזולוציה גבוהה מחושב משילוב של כל עוצמות קרינה פלואורסצנטית בניסוי צבע רב smFRET עם אלכס. עם זאת, כאן אנו מתמקדים זיהוי מצב, הפרדה, כמו גם הפקת מודלים קינטי, שבו צבע רב smFRET היא הכרחית. כאשר "רק" מבנה נחישות על ידי טריאנגולציה היא הרצויה, ערכת ניסויים פשוטים smFRET שני צבעים עם יחס אות לרעש גבוה יכול להיות בביצוע^12,19.

אנו משתמשים על ידי קרינה פלואורסצנטית חלקית () כמדד להעברת אנרגיה בין שני fluorophores⁷. PF מחושבת על פי עוצמת קרינה פלואורסצנטית מקביל היעילות סריג של ניסוי שני צבעים:

איפה, הוא עוצמת ב פליטה ערוץ em לאחר עירור עם צבע לשעברו- c הוא מקבל עם אורך הגל הארוך ביותר. זיהוי ערוצי מייצגים באותה התנוחה לדוגמה קאמרית, אבל הרשומה טווחי האור פלורסצנטיות ספקטרלי שונים. אותו מזהה עירור, פליטה נמצאים בשימוש פרוטוקול זה (קרי, "כחול", "ירוק" או "אדום").

בגלל חסרונות ניסיוני עוצמות קרינה פלואורסצנטית נמדד תלויים לא רק על העברת אנרגיה, אלא גם על מאפייני fluorophore וההתקנה. על מנת להשיג את יעילות העברת אנרגיה אמיתית בין שתי fluorophores, עוצמות נמדד צריך לתקן. ההליך הבא מבוסס על התייחסות⁹. גורמים תיקון דליפה נראית לעין (lk, קרי, הגילוי של פוטונים מ fluorophore בערוץ המיועד צבע אחר), גאמה נראית לעין (ag, קרי, התשואה קוונטית זריחה של לצבוע את זיהוי יעילות של הערוץ) מתקבלים מן עקבות מולקולה בודדת המציגים מקבל של הלבנת אירוע.

דליפת לצבוע התורם לתוך בכל ערוץ אפשרי מקבל מחושבת על פי כל נקודות נתונים עקבות קרינה פלואורסצנטית מוקלט שבו מקבל לצבוע מולבן אך התורם הוא עדיין פלורסנט ():

החציון של ההיסטוגרמה זליגת משמש כגורם זליגת נראית לעין. לאחר תיקון עבור דליפה, הגורם גמא לכאורה נקבע מתוך אותה קבוצה של עקבות. הוא מחושב על ידי חלוקת השינוי של קרינה פלואורסצנטית בערוץ מקבל על ידי השינוי של קרינה פלואורסצנטית בערוץ התורם על הלבנה של לצבוע מקבל:

כאשר c הוא שוב בערוץ זיהוי עבור מקבל עם אורך הגל הארוך ביותר. החציון של ההתפלגות וכתוצאה מכך משמש פקטור התיקון נראית לעין.

עוצמות המתוקן בכל אחד מהערוצים מתקבלים על ידי:

PF לאחר מכן מחושב על פי:

ניתן להפריד בין אוכלוסיות שונות במרחב רב ממדית שמקיפות את s PF. המיקום ואת הרוחב של כל מדינה נקבע על ידי התאמת הנתונים עם פונקציות גאוסיאנית רב-מימדי. אופטימיזציה עוקבות של אחד הממ גלובלית המבוססת על כל עקבות PF מספק תיאור כמותי של קינטיקה התצפיות. אפילו שינויים קטנים של התעריפים הן לזיהוי.

HMMs מספקים דרך של אומדן משוער מודל המדינה מאוסף של עקבות הזמן רועש. המערכת נחשבת באחד ערכה של בדידה, הברית מוסתרים בכל זמן נתון, התצפית בפועל (קרי, הפליטה) היא פונקציה הסתברותית של המדינה מוסתרים²⁰. במקרה של נתונים smFRET TIRFM, פליטת הסתברויות b_אני לכל המדינה אני שניתן למדל באמצעות פונקציות צפיפות ההסתברות גאוסיאנית רציפה. בנקודות זמן בדידים מפוזרים באופן קבוע, מעברים מאחד למדינה אחרת יכולה להתרחש לפי ההסתברות מעבר הזמן-שמורה, רק תלויה במצב הנוכחי. המטריקס המעבר A מכיל אלה הסתברות המעבר _ij בין כל המדינות מוסתרים. התפלגות המצב ההתחלתי של נותן ההסתברויות ספציפיים- לנקודה בפעם הראשונה של עקבות הזמן. שימוש בגישה מרבי-הסבירות, פרמטרים אלה ניתן למטב בצורה הטובה ביותר לתאר את הנתונים עם קדימה-אחורה, באום-ולש אלגוריתמים^20,21. זה מניב את estimators נראות מקסימלית (MLE). לבסוף, שניתן להסיק על רצף מצב סביר הפיק את המסלול של תצפיות עם אלגוריתם ויטרבי. בניגוד אחרים ניתוחים הממ של smFRET נתונים^24,25,26 אנחנו לא משתמשים את הממ כמו גרידא "החלקה" של נתונים אבל תמצית המודל המדינה קינטי של ערכת הנתונים ללא הצורך עבור התאמת זמן להתעכב היסטוגרמות²⁷. ניתוח הממ מתבצעת באמצעות קבצי script ללא צורך במיקור חוץ באמצעות איגור Pro. הטמעת הקוד מבוסס על התייחסות²¹. אנו מספקים ערכת תוכנה ונתונים למופת בדף שלנו לעקוב סעיפים 5 ו- 6 של פרוטוקול זה, (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret). תוכנה מלא הינו זמין על פי בקשה.

נקודות הנתונים עם PF זמן <-1 או PF > 2 בערוץ כל זיהוי מוקצים ההסתברות פליטה מינימלית על כל המדינות (10^-200). פעולה זו מונעת מעברים מלאכותי בנקודות אלו נתונים.

הפרמטרים עבור ההסתברויות פליטה מתקבלים מן ההתאמה של ההיסטוגרמה PF 3D עם פונקציות לפי עקומת גאוס, כפי שמתואר בשלב 5.7. פרמטרים אלה נשמרים קבועים במהלך אופטימיזציה של הממ.

הגישה שהוצגו, הווקטור הפצה המצב ההתחלתי של המטריקס המעבר משמשים באופן גלובלי לתאר את ההרכב כולו עקבות. והם מתעדכנים בהתבסס על כל N מולקולות של ערכת הנתונים על פי הפניה²⁷.

התחל פרמטרים עבור התפלגות המצב ההתחלתי נקבעים מתוך תחזיות דו-מימדית של ההיסטוגרמה PF (שלב 5.3) ולא ההסתברויות המעבר מוגדרות כ 0.05 למעט ההסתברויות כדי להישאר באותו המצב, אשר נבחרו כך כי ההסתברות לעזוב את מצב מסוים מנורמל לאחדות.

שיטה פרופיל הסבירות משמש כדי לתת מרווחי ביטחון (CIs) עבור כל המעבר המחירים^21,22, אשר לשמש הערכות משמעותי עבור חוסר הבהירות. לחישוב גבולות של המודיע על שיעור מסוים, ההסתברות המעבר של ריבית קבוע בערך השונה MLE. זה מניב את λ דגם המבחן '. מבחן הסבירות יחס (LR) הסבירות בהתחשב ערכת הנתונים 0 מתבצע על פי:

ביטחון 95% המאוגד עבור הפרמטר הוא הגיע כאשר LR חורג 3.841, quantile 95% של x²-התפלגות עם דרגת חופש אחת^22,23.

כוחה של השיטה הוא הפגין באמצעות של Hsp90. החלבון בשפע זה נמצא ב חיידקים וב פרוקריוטים והוא חלק תגובת לחץ הסלולר²⁸. זה מטרה סמים מבטיח טיפול בסרטן²⁹. Hsp90 הוא homodimer עם כיס כריכה נוקלאוטיד בתחום N-מסוף של כל יחידה משנית³⁰. זה יכול לעבור במעברים בין לפחות שני הייצורים החיים באופן גלובלי מובהק, אחד סגור,^31,19,פתוח, בצורת V קונפורמציה N-מסוף אחד³². הטבע dimeric ישירות מעלה את השאלה של יחסי הגומלין בין האתרים מחייב נוקלאוטיד שני ב- Hsp90.

בחלק זה, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור רכישת נתונים וניתוח של ניסוי smFRET תלת-צבעי על שמרים Hsp90, נוקלאוטיד. הכריכה תלויי-קונפורמציה של המגבר-PNP שכותרתו fluorescently (AMP-PNP *, אנלוגים הלא-hydrolyzable ATP) ניתוח. היישום של ההליך המתואר היתרים המחקר של האיגוד נוקלאוטיד ו באותו הזמן את השינויים הסתגלותי של Hsp90, ובכך חושף את cooperativity בין איגוד נוקלאוטיד שני הכיסים של Hsp90.

1. התקנה ותנאים מוקדמים

1. מבצע המדידות צבע רב smFRET TIRFM מנסרה-סוג. תיאור של מלכודת שני צבעים כמו פרסום יופיטר ניתנת התייחסות¹².
   1. בנו של TIRFM צבע רב. פריסה כללי מפורט ב ⁹.
   2. השימוש להחלפה, דיודה שאוב לייזרים רציפה wave מצב מוצק, ההופכים את השימוש תריסים מכני בנתיבים עירור מיותרים.
   3. מעסיקים פריזמה אסימטרי, מוארך, המונעת את ההשתקפות האחורי של הקרן עירור מן הצד האחורי כדי להזין את המטרה.
   4. להשתמש עדשות 2 אינץ אכרומטי אספריים fused סיליקה בנתיבים זיהוי זה לאסוף כמה שיותר אור ככל האפשר ולמנוע אוטומטי-זריחה, סטיות, למשל, עיוותים באזורים מחוץ למרכז של התמונה.
   5. מתמקדים כל נתיב זיהוי השבב של EMCCD עם עדשות נפרדות. פעולה זו מאפשרת התמקדות אופטימלית של כל ערוץ איתור.
      התראה: Class 3B לייזרים משמשים את TIRFM. כלומר, שהם מסוכנים אם העין חשוף ישירות, אך השתקפויות ' מאטום לשקוף ' אינם מזיקים. להבטיח תאימות עם לייזר זהירות לפי תקנות הרשות המקומית לפני המערכת מופעלת.
2. לקבוע מקדמי תיקון הגדרת ומאפייני fluorophore מראש באמצעות דגימות dsDNA.
   1. להשתמש במדגם גבוהה-סריג dsDNA אחת עבור כל צבע בשילוב עם מקבל בעל אורך הגל הארוך ביותר של עירור (עבור ההתקנה שהוצגו: Atto488-Atto647N, Atto550-Atto647N, Atto594-Atto647N). ודא כי ה-DNA בנוסף משתנה עם ביוטין.
   2. לדלל את הדגימה כדי 5 nM עם מאגר TNM (5 מ מ טריס pH 7.5, 5 מ מ NaCl, 20 מ מ MgCl₂) ו- 2 מ מ Trolox (השתמש מאגר זה גם למדידה).
   3. לשתק את dsDNA כמתואר עבור Hsp90 בשלבים 2.5 ו- 2.7.
   4. חישוב מקדמי תיקון דליפה נראית לעין (lk), גאמה נראית לעין (ag) של מולקולה בודדת עקבות המראים אירוע הלבנת מקבל.
3. לבנות תא תזרים זה כריך של שקופית קוורץ passivated פג/ביוטין-יתד, דקה בסרט כי הוא דבק על שני הצדדים, ולטובת מכסה. לקבלת פירוט פרוטוקולים עבור ניקוי של קוורץ שקופיות, פסיבציה ראה הפניה⁹.
   1. שימוש עבה (3 מ"מ) קוורץ שקופיות גאומטרית למנוע את האוסף של אור לייזר מפוזרים על הממשק קוורץ-גליצרול-קוורץ בין מנסרתיות השקופית קוורץ functionalized.
   2. להשתמש דק (מיקרומטר 40) איטום הסרט מרוסס עם דבק בצד ללא דבק. הסרט דק מפחית את המרחק בין מולקולות צמוד-השטח לבין המטרה. מחממים עד 80 ° C ולחץ על.
   3. במקום מכסה על החלק העליון. מחממים עד 80 ° C ולחץ על. השתמש טיפה של גליצרול בעת הצבת תא זרימה מעל המנסרה.
      הערה: החומרים את המנסרה, השקופיות קוורץ, כמו גם של גליצרול הינם מתאימים-אינדקס.
4. אקספרס Hsp90 מ האפייה בצורה של שתי מוטציות נקודה ציסטאין יחיד על המיקומים D61 או Q385. הוסף מוטיב של סליל מפותל C-מסוף כדי למנוע דיימר דיסוציאציה בריכוזים picomolar. תווית בנפרד את החלבונים המוטנטים ולהחליף את מונומרים כדי לקבל heterodimers עם Atto488 במיקום חומצת אמינו 61 ו- Atto550-חומצת אמינו עמדה 385⁹תוויות.

2. מדידה

1. הפעל את תוכנת המצלמה והגדר את הפרמטרים הדמיה כמצוין להלן:
   1. הגדר את הטמפרטורה על החיישן קירור יהיה נמוך ככל האפשר (-95 מעלות צלזיוס עם קירור מים חיצוני) כדי להקטין את הרעש הנוכחי כהה.
   2. השתמש בהגדרות המצלמה ממוטבים עבור הקלטת מולקולה בודדת: 3.3 µs אנכי shift מהירות, השעון אנכי נורמלי מתח, 17 מגה-הרץ 16 סיביות אופקי הקריא, קדם הגברה הגברה 3, רווח של אלקטרון מכפיל 1,000.
   3. הגדר מפעילה של רכישת "חיצוניות", את זמן החשיפה לסרטים שיא 70 גב' באורך 750 רכישה מחזורים.
      הערה: לכבות את האור בחדר כאשר המצלמה היא רכישת למניעת רוויה של החיישן EMCCD.
2. צור תיקייה על SSD מקומי למדידה. בתוכנה הגדרות ללכת הרוכב < שמירה אוטומטית > הפעל < שמירה אוטומטית >, בחר את תבנית הקובץ "Tiff" עבור רכישת הסרט. בחר את התיקיה על SSD כמיקום שמירה אוטומטית.
3. להתחיל את תוכנת סינון tunable פקדים אקוסטו אופטי (AOTF), התוכנה השולט על פעולת של הלייזרים, התוכנה ההדק המסנכרנת הלייזרים, AOTF, תריסי גילוי הנתיב, ואת המצלמות. להתאים את עוצמת הלייזר עם AOTF (ca. 3 mW לפני הכניסה את המנסרה) ולטעון את התבנית המניעים הנכונים.
4. הר בעל הדגימה את המנסרה, תא זרימה לצרף אבובים, למקם את צינור כניסת בכוס microcentrifuge, להתחבר לאורך צינור עודפים משאבת מזרק. לרוקן את המיכל עם 150 מאגר µL, ליישר את עירור קרן, ולהתרכז. אקונומיקה כל מזהמים פלורסנט על פני השטח על-ידי הזזת באיטיות לאורך טווח זיהוי מוחלט השקופית עם כוח לייזר של בערך 10 mW עבור כל לייזרים. זה לוקח בערך 1 h.
   הערה: אם לא צוין אחרת, המאגר משמש מכיל 40 מ מ HEPES pH 7.5, 150 מ מ. אשלגן כלורי, ו- 10 מ מ MgCl₂.
5. ועצירה כ 300 µL של פתרון NeutrAvidin (0.25 mg/mL במאגר) החדרה של תקופת דגירה של 1 מינימלית ריקון החוצה NeutrAvidin לא מאוגד עם µL כ-300 מאגר, סומק של פתרון BSA (0.5 mg/mL במאגר) דרך החדר.
   הערה: בלוק זה שנותר functionalization משטח פגמים על-ידי ספיחה לא ספציפי של BSA אל פני השטח.
6. לשתק את הדגימה על-ידי טעינת תא זרימה עם 150 µL של biotinylated ומתויגים Hsp90 בריכוזים העולה (מדולל מאגר + 0.5 מ"ג/מ"ל BSA) עד צפיפות המשטח מספיק, שהוא בדרך כלל המקרה-ריכוז של 5-10 בלילה. לשטוף חלבון לא מאוגד עם מאגר µL כ 300 + 0.5 מ"ג/מ"ל BSA.
7. וחלילה µL 150 של 25 ננומטר AMP-PNP * מאגר + 0.5 מ"ג/מ"ל BSA. . תן לזה תקופת דגירה של 5 דקות, חזור על שלב זה פעם אחת כדי להבטיח ריכוז נוקלאוטיד הנכון.
   הערה: לניסויים בנוכחות נוספים ללא תווית AMP-PNP, גם להוסיף מיקרומטר 250 אמפר-PNP.
8. מתחילים עם רכישת נתונים. עבור הכמות המתאימה של נתונים לרכוש כ 20 סרטים אשר לוקח בערך 1.5 h.
   1. העבר את המיקום של תא הדגימה בניצב קרן עירור עם צעד piezo לשנות את שדה הראייה.
   2. התאם את המוקד עם z-piezo השולטת על גובה המטרה במידת הצורך. זה לא צריך להיות נחוץ לעתים קרובות מדי כאשר התא מדידה נטענה ללא נטייה.
   3. להכין את ההקלטה של המצלמות על ידי לחיצה על < לקחת אות > תוכנה המצלמה והתחל את מחזורי עירור/רכישה באמצעות לחצן < התחל > בתוכנה על ההדק. זה מתחיל הרכישה של עוצמת קרינה פלואורסצנטית.
9. לבצע רישום הערוץ על ידי הראשון הקלטת סרט עם חרוזים פלורסנט המציגים פליטת קרינה פלואורסצנטית בטווח ספקטרלי של כל הערוצים זיהוי של ההתקנה. לאחר מכן, לזהות עמדות חרוז בסרט כיול על-ידי חיפוש המקומות המבריקים, לקבוע את שהמיקום המרכזי החל Gaussian להתאים לפרופיל בעוצמה. שמור את הקואורדינטות של חרוזים מצויים כל הערוצים, להתאים הן את ההיסט מיפוי ב x - y-כיוון עם פולינום 2D של שלוש מעלות⁹.

3. מבחר של מולקולה בודדת עקבות

1. ניתוח הנתונים נעשה באמצעות קבצי script ללא צורך במיקור חוץ באמצעות איגור Pro. לטעון את כל פריטי script הכרחי על-ידי פתיחת "iniTIRF.ipf" ובחר בסוג הנכון של הניסוי.
   הערה: בחלק זה, < לחצן > מציין אלמנטים לחיץ בתפריט או בממשק המשתמש. קריאות לפונקציות מסומנים בתוך גרשיים, למשל, "דפוס"שלום עולם"". פקודות אלה יכולים להדביק לשורת הפקודה של איגור Pro (ללא המרכאות תוחם).
2. ודא שהפרמטרים עבור הרישום הערוץ זיהוי נטענים.
3. התחל GUI על-ידי לחיצה על < smFRET חדש | ניתוח GUI >.
4. לטעון את הסרטים (קרי, רצף מסגרות עם 512 x 512 פיקסלים המאוחסנים כ- 16 סיביות TIFF ערימות) להחזיק את עוצמת בערוצים המתאימים. לעשות זאת על ידי לחיצה על לחצן < טעינת הסרט > בחירת הקבצים ממצלמות כביכול "מאסטר", "העבד" אחד אחרי השני.
5. לזהות את העמדות של פוטנציאל מולקולות יחיד על-ידי חיפוש המקומות המבריקים בסכום של המסגרות חמישה בערוץ זיהוי מסוים. לחשב את עמדות כל הערוצים זיהוי אחרים מהמיפוי הערוץ המקביל. כדי להשיג את האיתור עוצמת קרינה פלואורסצנטית, לסכם את עוצמת ריבוע פיקסל סביב המיקום המרכזי לכל מסגרת. לעשות זאת על ידי לחיצה על לחצן < למצוא עקבות > GUI.
   הערה: האורך לצד הכיכר (פיקסל) ניתנת על ידי: 2 * < סכום Pxs > + 1.
6. עבור כל מולקולה, לחשב מעקב משותף בעוצמה raw כסכום של כל עקבות של המקום הזה עם אותו צבע עירור. להעריך את הפרופיל בעוצמה של המולקולה של כל הערוצים עבור הקריטריונים הבאים:
   1. מישור שטוח בערך האינטנסיביות raw משותפת, הלבנת יחיד צעד כל עירור צבעים, התנהגות anticorrelated בערוצים המתאימים זיהוי, איתור של פלואורסצנטי אדום (המציין סריג המגבר-PNP מאוגד *) לפחות פעם אחת בתוך מעקב, אין מספר השלבים ב פלואורסצנטי אדום, מה שמצביע על הנוכחות של המגבר-PNP שני * מאוגדים אחד Hsp90 דימר.
7. שמור את עקבות קרינה פלואורסצנטית המקום עבור ניתוח נוסף אם קריטריונים אלה מתקיימים. לעשות זאת באמצעות בחירת המעקב עם הסמן ולאחר מכן הקשה על לחצן < שמור > בגרף "צירי זמן". באופן ידני לבדוק את העקבות בעוצמה של כל הערוצים זיהוי שלושה לאחר עירור כחול כ-200 מולקולות לכל סרט.

4. חישוב של עקבות קרינה פלואורסצנטית חלקית

1. הצגת כל עקבות עוצמת קרינה פלואורסצנטית מאחת המולקולות שנשמרו. השתמש הסמנים בגרף כדי לבחור טווחי הזמן.
2. בחר מרווח זמן שבו כל fluorophores הם מולבן כבר. עוצמת רקע רשע שמחושבים לטווח זה, להחסירו המעקב בעוצמה בכל אחד מהערוצים. לעשות זאת באמצעות לחיצה על לחצן < רקע >.
3. בחר את הטווח יעילות סריג, שבו לפחות בשני הצבעים המצורפת Hsp90 (Atto488 ו Atto550) נוכחים. הקפד לכלול עקבות המכילים אירוע מהבהב (ראה איור 3B). אירועים אלה מאופיינים של עוצמת קרינה פלואורסצנטית פתע בכל אחד מהערוצים ללא עלייה הנלווה לאף ערוץ אחר.
4. לחשב את עקבות PF . לעשות זאת באמצעות לחיצה על לחצן < PF Calc >. מקדמי תיקון מראש לכאורה דליפה (lk), גאמה נראית לעין (ag) חלות על עוצמת raw על מנת לתקן צילום-גופנית, מאפייני תוכנית ההתקנה.

5. האוכלוסייה בחירה, התאמה היסטוגרמה תלת-ממד

1. הסר את מולקולות הצג את יחס אות לרעש נמוך ב- PF העקבות. מולקולות החורגות את מרווח הזמן [-1; 2] עקבות PF עבור יותר מ-10% של המסגרות יוסרו ערכת הנתונים. לעשות זאת על ידי הפעלת "RemoveTracesLowSNR()" מתוך חלון הפקודה.
2. לחשב תחזיות 2D נשברתי הנתונים PF . מגרש על , על בטווח [-0.5; 1.5] עם רזולוציה של 100 100x סלים. לשם כך, בצע:
   1. "HistFret2D ("r_b","r_g", binHist = 100)"
   2. "HistFret2D ("r_b","g_b", binHist = 100); MoveWindow 553.5, 42.5, 1055.25, 508.25"
3. לקבוע את האוכלוסייה היחסי של כל מדינה ניתן להבחנה ב- 2D ההקרנות.
   1. להציג את הגרף המתאים בחזית ובצע "panelHist2DCount()".
   2. לחץ על לחצן < Init >, לצייר מצולע סגנון חופשי סביב הפסגה.
   3. לחץ על לחצן < ספירת >. את מספר נקודות הנתונים בתוך המצולע ואת המספר הכולל של נקודות נתונים בההקרנה מודפסות בחלון הפקודה.
4. הכן היסטוגרמה תלת-ממדית של הנתונים PF על ידי ביצוע "HistFret3D ("g_b","r_b","r_g")".
5. לנרמל את ההיסטוגרמה 3D אינטגרל של 1. בצע את הפעולות הבאות:
   1. "NewDataFolder/S fit0"
   2. "שכפול/O:: סריג: Hist3D, Hist3D"
   3. "Div משתנה /G = sum(Hist3D)*(DimDelta(Hist3D,0)) ^ 3"
   4. "Hist3D / = div; Div הדפסה"
6. לספק ראשונית פרמטרים עבור גאוסיאן תלת-ממד מתאים ולהכין מבני נתונים הדרושים.
   1. לבצע "Gauss3D_initParam(); ערוך W_coef_old."
   2. להוסיף את אוכלוסיית המדינה לסוף של וקטור פרמטר.
   3. לבצע "Gauss3D_prepareFit()."
      הערה: W_coef_old הוא וקטור שמכיל את הפרמטרים הראשוני עבור התאם. לכל מדינה זה אומר ואת האוכלוסייה המדינה משורשר בקצה של הווקטור. ודא כי מטריצת השונות המשותפת היא סימטרית.
7. מתאים הסכום של פונקציות גאוסיאנית 3D S כדי ההיסטוגרמה PF תלת-ממד, S להיות מספר מדינות ניתן להבחנה.
   1. לבצע "do3D()." פעולה זו עשויה להימשך שעה או יותר ב- office נורמלי PC, בהתאם לאיכות של הפרמטרים הראשונית.
   2. לבצע "postprocessFitMultiGauss3D(); evalFitMultiGauss3D(); ערוך W_coef."
8. הצגת התוצאה מתאים. לכל אחד שני הקרנות 2D, השתמש בפקודות הבאות:
   1. "contourPF3D_new(0); contourPF3D_new(1); contourPF3D_new(2); contourPF3D_new(3); contourPF3D_new(4)"
   2. "contourPF3D_colorize()"

6. קינטי ניתוח עם אנסמבל תלת-ממד?

1. להכין את אנסמבל הממ לרוץ כדי לחלץ את המידע קינטי. הממ אחד ממוטבת ממולקולות כל בערכת הנתונים. השתמש במידע המתקבל בשלב הקודם כדי להגדיר את המיקום ואת הרוחב של כל מדינה בשטח PF תלת-ממד.
   1. אתחל את ממשק המשתמש הממ (< הממ | Init הממ >) ובחר מספר מתאים של מדינות (במקרה של הנתונים Hsp90 פירוש < NumStates > = 5), מספר הממדים של אותות קלט (< NumDims > = 3), ואת סוג הקלט (< סוג הקלט > = "bgr תלת סריג").
2. למטב את הפרמטרים של הממ בכך שהוא מאפשר את התוכנה מתכנסת את הסבירות הממ (ביצוע "prepENS_CONVERGE_gB(GetDataFolder(1),-14)") עד לשינוי מטריצת המעבר בהשוואה האיטראציה הקודמת יורד מתחת לסף מסוים (10^-14 סכום השינוי המוחלט על כל הסתברות המעבר). זה מניב את MLE עבור המעבר ההסתברויות כשעה על סניף רגיל PC.
3. חזור על הבחירה האוכלוסייה התאמה לפי עקומת גאוס, אופטימיזציה הממ עבור קבוצות משנה של הנתונים (למשל, 75% של ערכת הנתונים המלא). אם ערכת הנתונים המלא הושלם מיזוגו של ניסויים שונים, חזור על אופטימיזציה גם עבור כל אחד הניסויים יחיד. ניתוח של קבוצות משנה מאפשרת להעריך את הוודאות של בחירת האוכלוסייה ידנית, ההשתנות בתוך ערכת הנתונים.
4. לחשב את המודיע על ההסתברויות המעבר, אשר הדו ח על הטרוגניות ערכת נתונים של דיוק הממ.
   1. לקבל הערכה גסה של גבולות המודיע על ידי הפעלת "תקליטור $(הבסיס: path3Dimport +"הממ"); loop_getCI_estimate_limits()."
   2. לחשב את הגבולות המדויקים של המודיע על ידי הפעלת:
   3. "loop_getCI_HMM_converge(1)"
   4. "CIresults_conv_new()"
   5. "תקליטור:: HMM_CIresult; reportCI_conv()"
   6. "תקליטור:: cmp_CI_conv; CI_plot2 ("הממ", doAppend = 0) "
5. לדחוס את המידע קינטי זמין כדי לפשט את הפרשנות.
   1. אוספים מידע על הזמן נוקלאוטיד שכותרתו נשאר אל Hsp90. עושים זאת על ידי כיווץ המדינות המאוגדות לשדות AMP-PNP * (קרי, S₁, S₂ ו- S₃, ראה גם באיור 2) ולעבד ההיסטוגרמה זמן להתעכב. לבצע "תקליטור $(הבסיס: path3Dimport +"הממ"); collapse_states_get_DT({0,1,1,1,0}) ", המשלב שוכנת של מדינות S₀ ו- S₄ וכן S₁, S₂ו- S₃.
   2. לחלץ את הזמנים להתעכב מהנתיב ויטרבי לכל מדינה עניין והשווה ההיסטוגרמה זמן להתעכב וכתוצאה מכך בתנאי ניסוי שונים. לבצע "plot_collapsed_DT_Hist (wDTo_01110_record1)."
   3. עבור תמונה מפורטת יותר, התמוטטות מדינות נפרדות PF אך זהים מבחינה תפקודית כדי להקל את נתוני ניתוח נוסף, למשל, במקרה של ניסוי תלת-צבעי עם שכותרתו Hsp90, נוקלאוטיד, הברית S₂ ו- S ₃ יכולה להתכווץ. לבצע "collapse_states_get_DT({0,1,2,2,4})."

צבע רב smFRET המידות לאפשר זיהוי ישיר קורלציה בין שניים או יותר אתרים אינטראקציה ברורים. זה הופך את הטכניקה הייחודית לחקור מערכות רכיבים מרובים, כגון חלבון מתחמי. אנו מתמקדים המצגת של smFRET תלת-צבעי ניסוי כאן, אשר משמש דוגמה להמחשה.

תהליך העבודה הכללי של השיטה מוצגת באיור1. החלק הראשון כולל את ההקלטה של צבע רב smFRET נתונים על מיקרוסקופ TIRF מנסרה-סוג. האסטרטגיה מצורף משטח, את התרשימים של ההתקנה מתוארת באיור2 א. לקבלת תיאור מפורט יותר של ההתקנה, עיין הפניה⁹. החלק השני של השיטה הציג מתמקד ניתוח הנתונים. עקבות עוצמת קרינה פלואורסצנטית למופת מוצגים באיור 2B. זמן מתאים רשמים הצג: (i) ברור הלבנת צעד עבור שני fluorophores מחובר Hsp90, מישורים שטוחים (ii) בעוצמה, (iii) אנטי-בקורלציה התנהגות ערוצים המתאימים, וכן אירוע מחייב (iv) לפחות אחת של AMP-PNP * (איור 3). יותר מ- 400 מולקולות העונים על הקריטריונים לבחירת נבחרו להניב נתונים מהימנים. במערכת למדה, בחמש מדינות ניתן לזיהוי על-ידי קרינה פלואורסצנטית עוצמות, עם ארבע מדינות להיות ברורים באופן פונקציונלי (איור 2C).

מן עוצמת קרינה פלואורסצנטית עקבות שקרינה פלואורסצנטית חלקית (PF, ההרחבה של יעילות סריג לניסויים צבע רב smFRET) יכול להיות מחושב (איור 4A). PF קשורה הקרבה של הצבעים. בניסוי תלת-צבעי smFRET, הנתונים משתרע על פני מרחב תלת-ממד (איור 5B). בהקרנת 2D ההיסטוגרמה 3D הוכיחו להיות שימושי עבור המדינה ההפרדה (איור 4B, ג). ניסוי מוצלח, כל המצבים צפויים תיאורטית בתנאים ניסיוני יישומית הם ניתן להבחנה על ידי שלהם PF ב ההשתקפויות 2D.

האוכלוסיות היחסי של הברית נקבעות מההשתקפויות 2D ציור מצולעים יד התוחמים הפסגה (איור 5C). גישה זו נמצאה להיות מדויקות ואמינות⁹. ההסתברויות פליטה עבור הממ מתקבלים על ידי התאמת היסטוגרמה PF 3D עם הסכום של פונקציות גאוסיאנית תלת-ממד, כאשר S הוא מספר מדינות ניתן להבחנה (חמישה במקרה הציג; איור 5D). ראוי מתכנסת כראוי, רק האוכלוסייה היחסי p_אני של כל מדינה אני יש שייערך מתמדת בזמן המיקום ואת רוחב Gaussians חופשיים.

אנסמבל אחד הממ ממוטבת על ערכת הנתונים המלא עם ההסתברויות פליטה קבוע כדי הפרמטרים המתקבל התאם לפי עקומת גאוס (איור 6). כדי לקבל מדד על הוודאות של המעבר שחולצו ההסתברויות, 95% CI כל מעבר הוא נקבע (איור 7).

בנוסף, הזמן הממוצע נוקלאוטיד כתב שכותרתו AMP-PNP * ניתן לחילוץ השרידים חייבים Hsp90 בתנאים ניסיוני שונים (איור 8A). פעולה זו מסייעת לצמצם עוד יותר את המורכבות של התוצאות. לשם כך, מדינות המייצגים AMP-PNP * הייצורים החיים המאוגדים והלא מאוגדים מכווצות במסלולים המדינה, בהתאמה. מזה זמן להתעכב הממוצע המגבר-PNP * דיסוציאציה יכול להיות מחושב (איור 8 ב').

על ידי השוואת את קינטיקה שנצפתה העדר ואת נוכחותם של נוספים, ללא תווית AMP-PNP ייחודי מידע על הקשר בין השינויים הסתגלותי של Hsp90 לבין המדינה נוקלאוטיד יכולה להיות מושגת. זה עושה את זה אפשר ללמוד ישירות את cooperativity בין איגוד נוקלאוטיד שני הכיסים של Hsp90. חוץ מזה, זה עוקף את הצורך לניסויים טיטור המודדים הכיבוש באתר איגוד כפונקציה של ריכוז המצע (למשל, חלקות היל). חלבון דינמי מאוד במערכות כגון Hsp90, גישה זו הוא גם רגיש לשינויים קטנים המחירים¹¹.

איור 1 : זרימת העבודה הכללי של הנתונים, ניתוח. נתונים נרכש במיקרוסקופ פלורסצנטיות גמורה צבע רב smFRET (TIRFM). לאחר הבחירה מעקב וחישוב של קרינה פלואורסצנטית חלקית (PF), מבוצע הידור של תלת-ממד PF היסטוגרמה ותחזיות 2D הימנו. באמצעות ההשתקפויות 2D, האוכלוסייה של כל המדינות ניתן להבחנה יכול להיקבע. אלה משמשים בתור אילוץ עבור גאוסיאן תלת-ממד שיתאים ההיסטוגרמה PF . פונקציות צפיפות ההסתברות גאוסיאנית לשמש פליטה הסתברויות עבור האנסמבל 3D עוקבות מוסתרים מרקוב דוגמנות (הממ). זה מניב את התיאור קינטי של המערכת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2 : ערכה של רכישת נתונים. Pictogram (A) של מערכת למדה המורכב דיימר Hsp90 (צהוב אליפסות מייצגים את המבנה התחום) המחובר אל פני השטח עם התוויות Atto488 (כחול), Atto550 (ירוק), של נוקלאוטיד כתב AMP-PNP * בפתרון, עם תוויות Atto647N (אדום). הנתונים נרשמים על מיקרוסקופ TIRF מנסרה-סוג עם מתחלפים לייזר עירור (אלכס). (B) זריחה למופת רשמים בעוצמה (int. קומה) לאחר עירור כחול וירוק. (ג) יצוגיים המדינות הסתגלותי ניתן להבחנה של Hsp90 (S₀, S₁, S₂, S₃, S₄) ואת המזהה שלהם בהתאמה למצב התפקודי (O, C, O *, C *) נעשה שימוש בעבודה זו. עמדות Fluorophore מסומנים בכחול, ירוק ואדום. שתי האוכלוסיות מייצגים אותו למצב התפקודי, כלומר פתח Hsp90 עם המגבר-PNP * מאוגדים (S₂ ו- S₃). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3 : קריטריוני הבחירה. (א) של מולקולה שנבחרו לניתוח נוסף. (B, C) מולקולות לא נבחרה עבור ניתוח נוסף. (B) אין מישורים שטוחים, Atto550 נמצא במצב כהה סביב 30 s לאחר עירור ירוק (המסומנים על ידי חצים). (ג) הלבנת מספר צעדים לאחר עירור ירוק (המסומנים על ידי חצים). Int. קומה: עוצמת קרינה פלואורסצנטית, כחול: Atto488, ירוק: Atto550, Atto647N אדום, לשעבר: עירור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 4 : חישוב של PF עקבות, היסטוגרמות נציג. (א) זריחה נציג בעוצמה (int. קומה) עקבות, עקבות קרינה פלואורסצנטית חלקית (PF) המתאים. (B) שתי תחזיות דו-מימדית של ההיסטוגרמה PF תלת-ממד עבור המידה בהעדרו של נוקלאוטיד נוספים ללא תווית. (C) ההשתקפויות אותו לניסוי בנוכחות נוספים מיקרומטר 250 אמפר-PNP. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 5 : תהליך בחירת האוכלוסייה. (א) המיקום של אוכלוסיות ניתן להבחנה חמש ב- 2D ההשתקפויות שני. (B) עותק יצוגיים ב- 2C איור. (C) מגרש נציג פיזור תלת-ממדית של הנתונים PF . הגיוון של נקודות הנתונים הוא רק עבור פריט חזותי. משתמשים באותו קוד צבע כמו B. (ד) קביעת של אוכלוסיות יחסית נעשית על ידי ציור מצולעים יד סביב הפסגות בהיסטוגרמה 2D. באמצעות שילוב של שני הקרנות מתואר באיור3, כל האוכלוסיות חמש ניתן לזיהוי. (E) Gaussian 3D שיתאים ההיסטוגרמה של הנתונים PF שמוצג א Depicted אלו isosurfaces-FWHM, אשר מייצגים את האוכלוסיה השונות חמש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 6 : תרשים זרימה אנסמבל 3D אופטימיזציה הממ. מודל אחד ממוטב וכל המולקולות של ערכת הנתונים. ערכי ההתחלה ניתנת לפי מודל קלט (עם מספר מצבים מוגדרים מראש). הסבירות של המודל בהתחשב בנתונים (עקבות PF 3D) הוא מדורג עם האלגוריתם קדימה-אחורה (פנסיון מלא). האלגוריתם באום-וולש (BW) מניב הערכה מקומית נראות מקסימלית (MLE) של הפרמטרים. MLE הכללית ואז ניתן למצוא iteratively. אלגוריתם ויטרבי מחשבת את המסלול מצב סביר בהתחשב מודל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 7 : אי ודאות משמעותיים אמידה עם CI- (א) קביעת המודיע על אחד קבוע קצב למופת. היחס הסבירות (LR) של מודל הבדיקה בהשוואה לדגם משערך (MLE) נראות מקסימלית מחושבת באזור סביב MLE עבור קצב קבוע. ביטחון 95% מחויב להגיע כאשר LR חורג 3.841 (קו אפור כהה אופקי). (B) קצב שחולצו קבועים ללא נוקלאוטיד נוספים (אדום) ועם כח-PNP (כחול), 95% CI שלהם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 8 : הממוצע להתעכב זמן של נוקלאוטיד כתב המגבר-PNP * מוכרחים Hsp90 מוארך בנוכחות של נוקלאוטיד נוספים- (א) Pictogram הדיסוציאציה הנצפה של המגבר-PNP שכותרתו * מ דיימר Hsp90, ממוצע של מעל שכל הייצורים החיים של Hsp90. המבנה התחום של Hsp90 מתוארת על-ידי אליפסות צהוב, הגמישות הסתגלותי שציין בשכבת-על דיימר פתוחים וסגורים. (B) ממוצע להתעכב זמן של AMP-PNP * מאוגדים Hsp90 בהעדר נוקלאוטיד נוספים (אדום), בנוכחות של תווית AMP-PNP (כחול) 250 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

אנו מציגים בהליך ניסיוני להשיג smFRET תלת-צבעי נתונים עבור מערכת חלבונים מורכבים, תיאור שלב אחר שלב של הניתוח של מדידות אלה. גישה זו מציעה את האפשרות ייחודי להעריך ישירות המתאם בין מספר אתרים אינטראקציה או שינויים הסתגלותי.

על מנת לקבל נתונים יחיד מולקולה צבע רב מתאימים חלבונים חשוב לבצע מדידות לשחזור ברמת רעש נמוכה. זו יכולה להיות מושגת באמצעות פרוטוקול פסיבציה משטח יעיל ואמין עבור זרימת קאמרית⁹. צפיפות מספיקות של מולקולות ותשמרו על פני השטח אמור לשמש כדי להגדיל את התשואה של מולקולות לכל סרט מוקלט. משמעות הדבר היא כי קרינה פלואורסצנטית אור ממולקולות יחיד צריך ליפול על-5-10% של הפיקסלים הכלולים תמונות מוקלטות. במקביל העמסת צריך למנוע, כי זה יגרום חפיפה בין מולקולות שכנות. כאשר זן שכותרתו היא חינם בתמיסה (AMP-PNP * במחקר הציג), לוודא הריכוז הוא מספיק נמוך כדי לא להפריע המדידה על ידי עירור ישירה מן לייזרים עם אורך גל קצר יותר (קרי, טוב בדרך כלל מתחת micromolar ריכוז). כמו כן, ודא הריכוז של תרכובות אלו לא נמוך יותר המיועד בשל הכריכה לא ספציפי לממשקים. בנוסף, הכוח עירור אופטימלית מייצג פשרה בין יחס אות לרעש של photobleaching של fluorophores.

אין חמצן ניקוי המערכת הוא מועסק בפרוטוקול שהוצגו. צבעים אטו-Tec בשימוש אינם מראים משמעותי מהבהב על ציר הזמן של הניסוי (70 ms תאורה בכל מחזור עירור), ירידה של קצב אקונומיקה תמונה נצפתה על ידי מערכת נבלות של גלוקוז אוקסידאז, קטלאז, Trolox^{33 ,34}. בנוסף, העדר חמצן נבלות מונע חפצים בגלל אינטראקציות חלבון לא ספציפי, כמו מערכות הניקוי חמצן בדרך כלל מכילים רכיבים חלבון עד ריכוז micromolar³⁵.

עוד צעד קריטי היא בחירת מעקב. הגודל של האזור עבור סיכום האינטנסיביות של fluorophore יחיד נבחר להיות קטן כמו אפשרי אבל עדיין גדולים יותר הנקודה להפיץ את הפונקציה של ההתקנה. שימו לב כי מישור שטוח בעוצמת משותפת עקבות ניתן לצפות אם הערוצים זיהוי גמא לכאורה דומה גורמים, מאז העקבות לא מתוקנות בשלב זה של הניתוח. רק מולקולות העונים לקריטריונים מוגדרים היטב של עקבות עוצמת קרינה פלואורסצנטית כלולים בניתוח (סעיף 3). מולקולות עם יחס אות לרעש המסכן ב עקבות PF אינם נכללים ניתוח נוסף, אינם משפיעים על הערכת נתונים כבחירה ברור קריטריונים משמשים.

בהתאם לאיכות הנתונים, גישות אלטרנטיביות לספק הקצאת מצב אופטימלי. הממ חינם של אנסמבל רב-ממדי מבוסס גם עוצמת עקבות של קרינה פלואורסצנטית²⁷ או עקבות PF יכול להיות מיושם להקצות הברית המשמשת כבסיס על-ידי מיטוב ההסתברויות פליטה המתאים (למשל, Gaussian קובצי Pdf) בזמן בו זמנית מיטוב דגם קינטי. שתי הגישות יש יתרונות וחסרונות. PF עקבות עשויים להכיל קוצים שלילי ואילו רמות עוצמת קרינה פלואורסצנטית להשתנות מולקולה מולקולה. פרוטוקול הציג פותרת בעיה זו על ידי מניעת מעברים מלאכותי קוצים מתרחשים על ידי בהערכת שההסתברויות פליטה מ- Gaussian תלת-ממד שיתאים ההיסטוגרמה PF ומיטוב רק ההסתברויות המעבר ב עוקבות אנסמבל הממ להפעיל.

הגישה הציג מוגבל על ידי הצורך שותף אינטראקציה עם תוויות המאגד עם משיכה וזהובה גבוהה על מנת להיות תואם עם ריכוזים נמוכים הצורך למדידות מולקולה בודדת קונבנציונלי. זה עשוי להיות מוכרע אסטרטגיות כדי להגדיל את ריכוז מקומי (tethering של שותפים אינטראקציה³⁶, כימוס שלפוחית^37,38) או שיטות להפחתת (למשל, אפס-מצב אמצעי האחסון נרגש waveguides³⁹). בנוסף, עמדות תיוג צריך להיבחר בקפידה, בקרת ניסויים נחוצים לא לכלול תופעות לוואי חמורות של fluorophores. במקרה של Hsp90, זה נבדק בדרך כלל על ידי וזמינותו ATPase, המוכיחה את פעילות אנזימטי⁴⁰. אם הוא זמין, במידע המבני קריסטל או NMR מבנה צריך להיחשב. עמדות המועדפת בלולאות השטח החשופים, מן האינטראקציה ממשקים, לא קבורות כיס משטח חלבון. פעולה זו מבטיחה נפח גדול נגיש עבור לצבוע.

המסגרת מתאים ניסוי צבע רב smFRET עם מספר שרירותי של צבעים. אנו מתמקדים מדידות תלת-צבעי. כאן, כמו אלה כבר לספק תכונת המעבדת אותם שונה אחר הניסויים מולקולה בודדת, כלומר את האפשרות לצפות ישירות מתאם בין שני תהליכים (למשל, איגוד של השותף לאינטראקציה ושינויים הסתגלותי). מידע זה אינו נגיש בניסוי smFRET שני צבעים סטנדרטיים, אבל הוא עניין מהותי להבנת הפונקציה של כל מכונה מולקולרית.

הניסוי הציג וניתוח הוא מסוגל אפיון מערכות חלבון, אשר עשויה להציג dynamics על מגוון רחב של פרקי זמן בין המדינות, כי הם מאוד גמישים עצמם³. זה ניגוד ניסויים שפורסמו קודם לכן צבע רב smFRET, אשר מתמקדת במערכות דגם ה-DNA או RNA, כגון הולידיי צמתי⁴, מפגין מעברים בין מצבים מוגדרים היטב (בעיקר שני). במערכות חלבון, יחס אות לרעש הוא נמוך, מחלץ את הערכה המלאה של הסתברות המעבר הוא קשה בגלל רוחב הפס זמני מוגבל בניסויים smFRET עקב photobleaching. כאן, אנחנו מראים כי - אם החלת ובזהירות עם אילוצים סביר - המכשולים במדידת חלבון מערכות ניתן להתגבר עם smFRET צבע רב באמצעות הקצאת מצב רב-ממדי ואנסמבל מוסתרים מרקוב ניתוח⁹.

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

עבודה זו ממומן על ידי קרן מחקר גרמני (מוסד 39/969-1), המועצה האירופית למחקר באמצעות הסכם גרנט ERC 681891 (ש. ע.)..