应用三色单分子焦虑研究蛋白质相互作用的相关性

在这里, 我们提出了一个协议, 以获得三色 smFRET 数据和分析与3D 集成隐马尔可夫模型。通过这种方法, 科学家可以从复杂的蛋白质系统中提取动力学信息, 包括协同或相关的相互作用。

单分子 rster 共振能量转移 (smFRET) 已成为一种广泛应用的生物物理技术, 研究生物分子的动力学。对于许多分子机器, 在一个细胞蛋白质必须与互动伙伴在一个功能周期, 以完成他们的任务。双色到多色 smFRET 的扩展使得同时探测多个相互作用或构象变化成为可能。这不仅为 smFRET 实验增加了一个新的维度, 而且它还提供了一种独特的可能性, 直接研究事件序列, 并在使用固定样本和全内反射荧光检测相关的相互作用显微镜 (显微镜)。因此, 多色 smFRET 是一种多用途的工具, 以定量的方式研究生物大分子化合物, 并在以前无法做到的细节。

在这里, 我们将展示如何克服多色 smFRET 实验对蛋白质的特殊挑战。我们提出了获取数据和提取动力学信息的详细协议。这包括使用3D 集成隐马尔可夫模型 (HMM) 对噪声数据的跟踪选择标准、状态分离和状态轨迹的恢复。与其他方法相比, 动态信息不是从停留时间直方图中恢复的, 而是直接从 HMM 中得到的。最大似然框架允许我们对动力学模型进行批判性评估, 并为利率提供有意义的不确定性。

通过将我们的方法应用于热休克蛋白 90 (Hsp90), 我们可以解开核苷酸结合和蛋白质的全球构象变化。这使我们可以直接观察到 Hsp90 二聚体的两个核苷酸结合袋之间的协同。

许多蛋白质完成他们的作用在动态复合体与其他分子, 由构象变化和瞬态协会介导在宽广的范围的时间表^1,2,3。耦合到外部能量源 (例如, ATP) 这些动态交互作用可以在功能循环中导致方向性, 并最终维持单元格中的非平衡稳定状态, 这是生命的先决条件。

为了充分理解这些分子机器, 以结构研究为指导的静态描述是不够的。此外, 重要的是要了解基本的动力学模型和确定的动力学速率常数。一些现有的方法让研究人员研究两个感兴趣的分子之间的二元相互作用的动力学,例如,表面等离子体共振, 具有光谱读数的松弛方法 (例如,跳转或停止流技术), 和核磁共振。但是, 它们的适用性在大多数情况下仅限于简单的双状态系统 (例如,一个绑定和一个未绑定状态), 这是由于批量实验所固有的平均值。在涉及更多的状态或中间体的情况下, 它们只产生速率常数的复杂混合。单分子方法, 如光学或磁性镊子或双色 smFRET,即,一个施主和一个受体荧光, 与表面固定的样品可以恢复所有观察到的构象变化的速率常数。但是, 当涉及到影响多个绑定站点的交互时, 这些方法仍然是有限的, 而关于两个 (或多个) 交互的可能相关性的信息只能通过一组实验的间接结论访问。

多色 smFRET^4,5,6,7,8,9提供了一个机会, 直接研究这些组件之间的交互, 在实时和下接近生理情况¹⁰。这允许一个调查例如, 一个配体或另一个蛋白质的构象依赖性的捆绑^8,9,11。这里介绍的总体方法是在特定位置标记感兴趣的蛋白质, 将一个蛋白质附加到测量室的表面, 并在棱镜型显微镜上跟踪时间的荧光强度 (详见^9,12). 不同染料的空间接近度可以通过它们之间的能量转移来确定。标记策略可能因蛋白质而异 (在¹³中进行了审查), 并且避免了 smFRET 测量中的工件存在¹⁴的准则。

由于施主染料可能转移能量对不同的接受者染料在多颜色 smFRET 实验, 所有染料的相对位置不是可接近的从励磁一个染料单独^15,16。但与交替激光励磁 (亚历克斯¹⁷, 并在¹⁸中进行了审查) 结合使用, 该方法提供了所有的时空信息, 分二次和亚纳米分辨率。

在主, 高分辨率结构信息可以通过使用的染料之间的距离计算, 从所有荧光强度的组合在一个多色 smFRET 实验与亚历克斯。然而, 在这里, 我们的重点是状态识别和分离以及动力学模型的提取, 其中多色 smFRET 是必不可少的。当 "只" 的结构确定由三角化是需要的, 一组简单的双色 smFRET 实验的高信噪比可以执行^12,19。

我们使用部分荧光 () 作为两个荧光⁷之间能量传输的代理。PF是从与双色实验的烦恼效率类似的荧光强度计算得出的:

其中, 是在发射通道上的强度与颜色ex之后的em , 而c是波长最长的受体。检测通道在样品室中代表同一位置, 但记录荧光光的不同光谱范围。此协议中使用了相同的激发和发射标识符 (即"蓝色"、"绿色" 和 "红色")。

由于实验的缺陷, 所测得的荧光强度不仅取决于能量的转移, 而且还依赖于荧光和设置的性质。为了获得两个荧光之间的真实能量传递效率, 必须对测量的强度进行修正。以下过程基于引用⁹。明显渗漏的校正因子 (lk,即从指定给另一染料的通道中的荧光中检测光子) 和表观伽玛 (ag,即,染料的荧光量子屈服和该通道的检测效率是从单分子的痕迹, 显示一个受体漂白事件。

在所有可能的受体通道上的施主染料的泄漏是从记录的荧光痕迹的所有数据点计算的, 那里的受体染料漂白, 但施主仍然荧光 ():

将泄漏直方图的中值作为表观泄漏系数。在对泄漏进行校正后, 视伽玛系数是从同一组跟踪中确定的。它是通过将受体通道中的荧光变化除以施主通道中的发光变化来计算受体染料的漂白:

其中, c再次是最长波长的接受方的检测通道。所产生的分布的中位数被用作表观校正因子。

每个通道的校正强度通过以下方法获得:

然后根据以下内容计算PF :

在PF所跨越的多维空间中, 可以分隔不同的填充。用多维高斯函数拟合数据, 确定了各状态的位置和宽度。基于所有PF跟踪的一个全局 HMM 的后续优化提供了观察到的动力学的定量描述。即使是微小的变化率是可察觉的。

模型提供一种从嘈杂的时间痕迹集合中推断状态模型的方法。系统被认为是在任意给定时间的一组离散的隐藏状态中的一个, 而实际观测 (即发射) 是这个隐藏状态的概率函数²⁰。在显微镜 smFRET 数据的情况下, 可通过连续高斯概率密度函数对每个状态i的发射概率b_i 进行建模。在通常间隔的离散时间点, 从一个到另一个状态的转换可以根据时间不变的过渡概率发生, 并且只取决于当前状态。转换矩阵a包含这些转换概率a_ij 在所有隐藏状态之间。初始状态分布为时间跟踪的第一个时间点提供特定于状态的概率. 使用最大似然方法, 这些参数可以优化, 以最有效地描述数据的前向向后和鲍姆-韦尔奇算法^20,21。这就产生了最大似然估计量。最后, 最有可能产生观测轨迹的状态序列可以用维特比算法来推断。与 smFRET 数据的其他 hmm 分析相反,^24、2526我们不使用 hmm 作为数据的 "平滑", 而是从数据集中提取动态状态模型, 而不需要拟合驻留时间直方图²⁷。HMM 分析是做内部脚本使用伊戈尔 Pro。代码的实现基于引用²¹。我们在我们的网页上提供一个软件套件和模范数据, 以遵循本协议 (https://www.singlemolecule.uni-freiburg.de/software/3d-fret) 的5和6节。可根据要求提供完整的软件。

在任何检测通道中, pf <-1 或pf > 2 的数据中的时间点被分配给所有状态 (10^-200) 的最小发射概率。这可以防止在这些数据点进行人工转换。

根据5.7 步中描述的高斯函数的 3D PF直方图的拟合, 得到了发射概率的参数。这些参数在优化 HMM 的过程中保持固定。

在所提出的方法中, 初始状态分布向量和转换矩阵在全局上用于描述整个跟踪的集合。它们根据引用²⁷的数据集中的所有N分子进行更新。

初始状态分布的起始参数由PF直方图的2D 投影确定 (步骤 5.3), 而转换概率设置为 0.05, 但概率保持在同一状态, 这是选择离开某一状态的概率被归为统一。

一种似然分析方法用于给所有过渡速率的置信区间 (CIs)^21,22, 它作为对其不确定性的有意义的估计。为了计算某一特定速率下的 CI 的边界, 将利率的转移概率定为非极大似然的值。这将生成测试模型λ "。给定数据集 0的可能性的可能性比 (LR) 测试是根据以下内容执行的:

当LR超过 3.841, 95% 位的x²-分布与一个自由度^22,23时, 参数的置信度达到了95%。

使用 Hsp90 演示了该方法的威力。这种丰富的蛋白质是在细菌和真核生物中发现的, 是细胞应激反应的一部分²⁸。它是一个有前途的药物靶在癌症治疗²⁹。Hsp90 是在每个子单元³⁰的 N 终端域中具有一个核苷酸绑定口袋的 homodimer。它可以在至少两个全局不同的构象之间进行转换, 一个闭合和一个 N 终端开放, V 形构象^19,31,32。二性质直接引起了 Hsp90 两个核苷酸结合位点之间相互作用的问题。

在下面的过程中, 我们提供了一个分步协议的数据获取和分析三色 smFRET 实验酵母 Hsp90 和核苷酸。分析了荧光标记的安培-pnp (amp)、非水解模拟 ATP 的构象依赖性结合。被描述的做法的应用允许研究核苷酸结合和同时 Hsp90 的构象变动和从而显露协同在二个核苷酸结合的口袋 Hsp90 之间。

1. 设置和先决条件

1. 在棱镜型显微镜上执行多色 smFRET 测量。在参考¹²中给出了作为朱庇特出版物的双色设置的说明。
   1. 构造多色显微镜。⁹中详细介绍了常规布局。
   2. 使用可切换、二极管泵浦的固态连续波激光器, 使机械百叶窗在励磁路径中的使用不必要。
   3. 使用不对称的, 拉长的棱镜, 防止从后方反射的励磁光束进入目标。
   4. 在检测路径中使用2英寸无色非球面熔融石英透镜, 收集尽可能多的光, 并防止自动荧光和像差,例如图像的非中心区域失真。
   5. 将每个检测路径集中在 EMCCD 的芯片上, 并使用一个单独的镜头。这使得每个检测通道的最佳聚焦。
      警告:类3B 激光器用于显微镜。这意味着他们是危险的, 如果眼睛是直接暴露, 但漫反射是无害的。在系统运行前, 根据当地政府的规定, 确保遵守激光安全预防措施。
2. 使用 dsDNA 样品预先确定安装和荧光性能的校正因子。
   1. 使用一个高烦恼 dsDNA 样品为每染料与接受人有最长的励磁波长 (为被提出的设置: Atto488-Atto647N, Atto550-Atto647N, Atto594-Atto647N)。确保 DNA 是另外用生物素修饰的。
   2. 将样本稀释至 5 nM, TNM 缓冲 (5 mm pH 7.5, 5 毫米氯化钠, 20 mm 氯化镁₂) 和 2 mm Trolox (也可使用此缓冲区进行测量)。
   3. 固定在步骤2.5 和2.7 中描述的 dsDNA Hsp90。
   4. 计算表观渗漏 (lk) 和表观伽玛 (ag) 的校正因子, 从单分子迹线上显示受体漂白事件。
3. 建造一个流室, 这是一个三明治的 peg/生物素 peg 钝化石英幻灯片, 薄膜, 是胶粘剂两边, 和一个封面滑动。为细节协议为石英幻灯片和钝化的清洁参见参考⁹。
   1. 使用厚 (3 毫米) 石英幻灯片, 以几何上防止激光散射在石英-甘油-石英界面之间的棱镜和功能化石英幻灯片的收集。
   2. 使用在非粘合面上喷涂粘合剂的薄 (40 µm) 密封膜。薄膜减少了表面附着分子与物镜之间的距离。加热到80° c 并按上。
   3. 在顶部放置一个盖子滑动。加热到80° c 并按上。在棱镜上放置流动腔时, 使用一滴甘油。
      注: 棱镜和石英玻片的材料以及甘油是指数匹配的。
4. 表达 Hsp90 从酿酒酵母以两个单一的半胱氨酸点突变体的形式在位置 D61 或 Q385。添加一个 C 终端盘绕线圈的主题, 以防止二聚体离解在 picomolar 浓度。分别标记突变蛋白, 并交换单体以获得 heterodimers 标记的 Atto488 在氨基酸位置61和 Atto550 在氨基酸位置 385⁹。

2. 测量

1. 启动摄像机软件并设置如下所述的成像参数:
   1. 设置传感器冷却的温度尽可能低 (-95 ° c 与外部水冷), 以减少暗电流噪音。
   2. 使用针对单分子记录进行优化的相机设置: 3.3 µs 垂直移位速度、正常垂直时钟电压、17 MHz 16 位水平读出、预放大增益3、电子倍增器增益1000。
   3. 将捕获的触发设置为 "外部", 并将曝光时间设为 70 ms 记录电影, 其长度为750采集周期。
      注意: 当照相机获得时, 关闭房间灯, 以防止 EMCCD 传感器的饱和。
2. 在本地 SSD 上为测量创建一个文件夹。在软件设置进入 < 自动保存 > 车手, 启用 < 自动保存 >, 并选择文件格式 "Tiff" 的电影获取。选择 SSD 上的文件夹作为自动保存位置。
3. 启动控制声光可调谐滤镜 (AOTF) 的软件, 该软件控制激光器的运行和触发软件, 同步激光器、AOTF、检测路径中的百叶窗和照相机。调整激光功率与 AOTF (约3兆瓦前进入棱镜), 并加载正确的触发模式。
4. 安装的样品持有人与棱镜和流室, 附加油管, 放置在一个离心杯进口油管, 并连接出口油管到注射器泵。冲洗室与大约150µL 缓冲, 排列励磁光束和焦点。将任何荧光污染物漂白在表面上, 通过缓慢地沿着幻灯片的完整探测范围移动, 激光功率约10兆瓦, 用于所有激光器。这大约需要1小时。
   注: 如果不另行说明, 则使用的缓冲器包含 40 mm HEPES pH 7.5、150 mm 氯化钾和 10 mm 氯化镁₂。
5. 冲洗约300µL 的 NeutrAvidin 溶液 (0.25 毫克/毫升缓冲) 进入会议厅和孵化1分钟. 冲洗出未绑定的 NeutrAvidin 与缓冲区和冲洗约300µL 的 BSA 溶液 (0.5 毫克/毫升缓冲) 通过会议厅。
   注意: 这块剩余表面功能化缺陷通过不吸附 BSA 到表面。
6. 固定样品通过装载流动房间与大约150µL 化并且被标记的 Hsp90 在上升的集中 (稀释在缓冲 + 0.5 毫克/毫升 BSA) 直到充足的表面密度被到达, 通常是案件在集中5-下午10点。用大约300µL 缓冲液 + 0.5 毫克/毫升 BSA 清洗未绑定的蛋白质。
7. 在缓冲区 + 0.5 毫克/毫升 BSA 中, 150 µL 25 nM-PNP * 的冲洗。让它孵育5分钟, 并重复此步骤一次, 以确保正确的核苷酸浓度。
   注: 对于在额外的, 未标记的 amp 的存在的实验, 也添加250µM 功放-pnp。
8. 从数据获取开始。对于一个适当的数据量获得约20电影约1.5 小时。
   1. 将样品室的位置垂直于励磁梁与压电步进, 以改变视野。
   2. 调整焦点与 z 压电, 控制目标的高度, 如果需要。当测量室没有倾斜时, 这不应该经常是必要的。
   3. 通过在相机软件中按 < 采取信号 > 的方法准备摄像机的记录, 并使用触发器软件中的 < start > 按钮启动励磁/采集周期。这开始了对荧光强度的获取。
9. 通过在设置的所有检测通道的光谱范围内, 首先录制带有荧光珠的电影来执行通道注册。然后, 通过搜索最亮的斑点并确定从高斯拟合到强度剖面的中心位置, 来检测校准影片中的磁珠位置。保存在所有通道中找到的珠子的坐标, 并将 x 和 y 方向的映射偏移量与2D 多项式的度数三⁹相匹配。

3. 单分子痕迹的选择

1. 数据分析是通过内部脚本使用伊戈尔 Pro。通过打开 "iniTIRF. ipf" 并选择正确的实验类型来加载所有必要的脚本。
   注意: 在下面的 "< 按钮 >" 中指定菜单或用户界面中的可单击元素。函数调用用引号表示,例如, "打印" Hello 世界 "。这些命令可以粘贴到命令行的伊戈尔 Pro (没有封闭引号)。
2. 确保已加载检测通道注册的参数。
3. 通过单击 < smFRET 新建 |分析 GUI >。
4. 加载影片 (即,存储为16位 TIFF 堆栈的 512 x 512 像素的帧序列), 在各自的通道中保持强度。通过按 < 加载胶片 > 按钮, 然后从所谓的 "主" 和 "从属" 相机中选择一个接一个的文件。
5. 通过在某一检测通道中搜索前五帧的总和中的最亮点来识别潜在单分子的位置。从通道映射中计算所有其他检测通道中的相应位置。为了获得荧光强度迹线, 对每个帧的中心位置周围的像素正方形的强度求和。通过按按钮 < 在 GUI 中查找跟踪 > 来执行此项。
   注: 正方形的边长 (像素) 由: 2 * < 总和靴 > + 1。
6. 对于每个分子, 计算一个联合的原始强度跟踪作为这个点的所有痕迹的总和相同的励磁颜色。根据以下标准评估所有通道中分子的强度分布:
   1. 一个大致平的高原在联合原始的强度和一个单一漂白步为所有励磁颜色, anticorrelated 行为在适当的检测渠道, 红色荧光的检测 (表明苦恼对一个束缚的放大器-PNP *) 至少一次在跟踪, 并没有在红色荧光的多个步骤, 这将表明存在两个安培-PNP * 绑定到一个 Hsp90 二聚体。
7. 保存荧光痕迹的现场, 以进一步分析, 如果这些标准得到满足。通过选择带有光标的跟踪, 然后按 "时间线" 图中的 < 保存 > 按钮来执行此项。手动检查所有三检测通道的强度痕迹, 蓝色激发后, 每部电影大约200分子。

4. 部分荧光痕迹的计算

1. 显示所保存的分子的所有荧光强度迹线。使用图表中的游标选择时间范围。
2. 选择所有荧光已漂白的时间间隔。平均背景强度是从这个范围计算的, 并减去每个通道的强度跟踪。通过按 < 背景 > 按钮完成此项。
3. 选择烦恼效率范围, 其中至少两个染料连接到 Hsp90 (Atto488 和 Atto550) 存在。请确保排除包含闪烁事件的跟踪 (请参见图 3B)。这些事件的特点是一个下降的荧光强度在一个通道没有伴随增加的任何其他渠道。
4. 计算PF跟踪。通过按 < PF 计算器 > 按钮执行此项。用于表观泄漏 (lk) 和表观伽玛 (ag) 的预定义校正因子被应用于原始强度, 以纠正照片物理和设置属性。

5. 人口选择和3D 直方图拟合

1. 删除在PF跟踪中显示低信噪比的分子。在任何PF跟踪中超过10% 帧的时间间隔 [-1; 2] 的分子将从数据集中移除。通过从命令窗口执行 "RemoveTracesLowSNR ()" 来完成此项。
2. 计算PF数据的搁置2D 投影。在范围 [-0.5; 1.5] 中, 以 100 x 100 箱的分辨率绘制过和结束. 为此, 请执行以下操作:
   1. "HistFret2D (" r_b "," r_g ", binHist=100)"
   2. "HistFret2D (" r_b "," g_b ", binHist=100);MoveWindow 553.5, 42.5, 1055.25, 508.25 "
3. 确定2D 投影中每个可区分状态的相对总体。
   1. 将适当的图形带到前面并执行 "panelHist2DCount ()"。
   2. 按 < 初始化 > 按钮, 在峰值周围绘制一个自由多边形。
   3. 单击 < 计数 > 按钮。多边形中的数据点数和投影中的数据点总数将打印在命令窗口中。
4. 通过执行 "HistFret3D (" g_b "、" r_b "、" r_g ") 来准备PF数据的3D 直方图。
5. 将3D 直方图正常化为1的整数。执行以下操作:
   1. "NewDataFolder/S fit0"
   2. "重复/O:: FRET:Hist3D, Hist3D"
   3. "可变/G div = 总和 (Hist3D) * (DimDelta (Hist3D, 0)) ^ 3"
   4. "Hist3D/= div;打印 div "
6. 为3D 高斯拟合提供初始参数, 并准备必要的数据结构。
   1. 执行 "Gauss3D_initParam ();编辑 W_coef_old。
   2. 将状态填充添加到参数向量的末尾。
   3. 执行 "Gauss3D_prepareFit ()"。
      注意:W_coef_old 是一个向量, 它保存了适合的初始参数。每状态这意味着和状态填充, 在向量的末尾串联. 确保协方差矩阵是对称的。
7. 将S 3D 高斯函数的总和与 3D PF直方图相匹配, 其中s是可区分状态的数目。
   1. 执行 "do3D ()"。这可能需要一个小时或更多的正常办公 PC, 取决于初始参数的质量。
   2. 执行 "postprocessFitMultiGauss3D ();evalFitMultiGauss3D ();编辑 W_coef。
8. 显示合适的结果。对于两个2D 投影中的每一项, 请使用以下命令:
   1. "contourPF3D_new (0);contourPF3D_new (1);contourPF3D_new (2);contourPF3D_new (3);contourPF3D_new (4) "
   2. "contourPF3D_colorize ()"

6. 3D 集成 HMM 的动力学分析

1. 准备一个集成 HMM 运行来提取动力学信息。从数据集中的所有分子中优化一个 HMM。使用上一步中获得的信息来定义 3D PF空间中每个状态的位置和宽度。
   1. 初始化 hmm 用户界面 (< hmm |初始化 HMM >) 并选择适当数量的状态 (在 Hsp90 数据的情况下, 这意味着 < NumStates > = 5), 输入信号的维数 (< NumDims > = 3) 和输入类型 (< 输入类型 > = "烦恼 3D bgr")。
2. 通过让软件收敛 hmm 的可能性来优化 hmm 的参数 (执行 "prepENS_CONVERGE_gB (GetDataFolder (1),-14)"), 直到转换矩阵中与上一个迭代相比的变化低于阈值 (10^-14对于每个过渡概率的绝对更改的总和)。这将在正常的办公室 PC 上的一个小时内生成过渡概率的极大似然。
3. 重复填充选择、高斯拟合和数据子集的 HMM 优化 (例如,完整数据集的 75%)。如果完整的数据集是从不同的实验中合并而成的, 那么对每个单独的实验也重复优化。子集分析允许估计人工人口选择的不确定性和数据集内的变异性。
4. 计算了转换概率的 CI, 报告了数据集的异构性和 HMM 的精度。
   1. 通过执行 "cd $ (根: path3Dimport +" HMM) 来粗略估计 CI 边界;loop_getCI_estimate_limits ()。
   2. 通过执行以下操作计算 CI 的确切限制:
   3. "loop_getCI_HMM_converge (1)"
   4. "CIresults_conv_new ()"
   5. "cd:: HMM_CIresult;reportCI_conv () "
   6. "cd:: cmp_CI_conv;CI_plot2 ("嗯", doAppend=0) "
5. 压缩可用的动力学信息以简化解释。
   1. 收集有关标记的核苷酸停留在 Hsp90 的时间的信息。通过折叠绑定到即插即用的状态 (即, s₁, s₂和 s₃, 请参阅图 2) 并编译驻留时间直方图。执行 "cd $ (根: path3Dimport +" HMM ");collapse_states_get_DT ({01、11、0}) ", 它合并了状态 s 的₀和 s₄以及 s₁、s₂和 s₃。
   2. 提取的停留时间从维特比路径的每一个利益状态, 并比较所产生的停留时间直方图为不同的实验条件。执行 "plot_collapsed_DT_Hist (wDTo_01110_record1)"。
   3. 对于更详细的图片, 折叠具有不同PF但功能相同的状态, 以缓解进一步的数据分析,例如, 在带有标记的 Hsp90 和核苷酸的三色实验中, 状态 S₂和 s₃可以折叠。执行 "collapse_states_get_DT ({01、22、4})"。

多色 smFRET 测量允许直接检测两个或多个不同的交互站点之间的相关性。这使得技术独特的研究多组分系统, 如蛋白质复合物。我们专注于介绍一个三色的 smFRET 实验, 这是一个例证。

该方法的常规工作流显示在图 1中。第一部分包括在棱镜型 TIRF 显微镜上记录多色 smFRET 数据。图 2A中描述了曲面附着策略和安装示意图。有关安装程序的详细说明, 请参阅参考⁹。本文的第二部分着重于数据分析。示范荧光强度跟踪显示在图 2B。适当的时间踪影显示: (i) 一个清楚的漂白步为两个荧光附有 Hsp90, (ii) 平的强度高原, (iii) 反相关的行为在对应的渠道和 (iv) 至少一个绑定事件的 AMP-PNP * (图 3)。选择符合选择标准的400多个分子, 以产生可靠的统计数据。在所研究的系统中, 五状态可以通过荧光强度来区分, 四状态在功能上是不同的 (图 2C)。

从荧光强度痕迹部分荧光 (PF, 延长的烦恼效率为多色 smFRET 实验) 可以计算 (图 4A)。PF与染料的接近度有关。在三色 smFRET 实验中, 数据跨越3D 空间 (图 5B)。2D 投影的3D 直方图已被证明是有用的状态分离 (图 4B, C)。在一个成功的实验中, 在应用的实验条件下, 所有理论上预期的状态都可通过2D 投影中的PF区分出来。

通过绘制包围峰值的自由多边形 (图 5C), 从2D 投影中确定状态的相对数量。此方法被认为是准确和可靠的⁹。通过拟合 3D PF直方图和3D 高斯函数的总和得到了 HMM 的发射概率, 其中S是可区分状态的个数 (在所提出的情况下为五);图 5D)。为了使此适合正确收敛, 只有每个状态i的相对总体p_i 必须保持不变, 而高斯的位置和宽度是可用的。

一个合奏 HMM 是优化的整个数据集的发射概率固定的参数得到的高斯拟合 (图 6)。为了得到一个测量为被提取的转折可能性的不确定性, 95% CI 为每个转折被确定 (图 7)。

此外, 在不同的实验条件下 (图 8A), 标记的记者核苷酸放大器-PNP * 仍然绑定到 Hsp90 的平均时间可以提取。这有助于进一步降低结果的复杂性。为此, 分别在状态轨迹中折叠表示 AMP-PNP 绑定和未绑定构象的状态。从这个平均停留时间为安培-PNP * 离解可以被计算 (图 8B)。

通过比较在缺席和存在的额外的, 未标记的安培 PNP 的反应动力学, 唯一的信息关于 Hsp90 的构象变化与核苷酸状态之间的相关性可以得到。这使得有可能直接研究的协同之间的两个核苷酸结合袋的 Hsp90。此外, 它绕过了滴定实验的需要, 测量的结合位点占领作为一个功能的基质浓度 (例如,丘陵地块)。对于高度动态的蛋白质系统, 如 Hsp90, 这种方法也对率¹¹中的小变化很敏感。

图 1: 数据获取和分析的一般工作流.在多色 smFRET 全内反射荧光显微镜 (显微镜) 上获取数据。对部分荧光 (pf) 进行了跟踪选择和计算后, 对其 3D pf直方图和2D 投影进行了编译。利用2D 投影, 可以确定所有可区分状态的种群。这些被用作3D 高斯拟合到PF直方图的约束。高斯概率密度函数作为后续3D 集合隐马尔可夫模型 (HMM) 的发射概率。这就产生了系统的动力学描述。请单击此处查看此图的较大版本.

图 2: 数据获取的方案.(A) 所研究系统的象形, 由 Hsp90 二聚体 (黄色椭圆形代表域结构) 与标签 Atto488 (蓝色) 和 Atto550 (绿色) 和在溶液中的报告核苷酸放大器-PNP * 在表面上, 标有Atto647N (红色)。数据被记录在棱镜型 TIRF 显微镜与交替激光励磁 (亚历克斯)。(B) 模范荧光强度 (Fl. Int.) 在蓝色和绿色励磁以后踪影。(C) Hsp90 (S₀的可分辨构象状态的象形图, 此工作中使用的₁、s₂、s₃、s₄) 及其各自的功能状态标识符 (o、c、o、c *)。荧光的位置以蓝色、绿色和红色表示。两个种群代表相同的功能状态, 即开放 Hsp90 与 AMP-PNP * 绑定 (s₂和 s₃)。请单击此处查看此图的较大版本.

图 3: 选择条件.(a) 选择用于进一步分析的分子。(B, C)没有选择的分子作进一步分析。(B) 没有平坦的高原和 Atto550 是在一个黑暗的状态在三十年代附近在绿色励磁以后 (由箭头指示)。(C) 绿色激发后的多个漂白步骤 (箭头表示)。Int.: 荧光强度, 蓝色: Atto488, 绿色: Atto550, 红色 Atto647N, ex: 激发。请单击此处查看此图的较大版本.

图 4: PF跟踪和具有代表性的直方图的计算.(A) 具有代表性的荧光强度 (Fl. Int.) 迹和相应的部分荧光 (PF) 跟踪。(B) 两个2D 投影的 3D PF直方图为测量没有额外的, 未标记的核苷酸。(C) 在存在额外的250µM 放大器 PNP 的情况下, 对实验的相同预测。请单击此处查看此图的较大版本.

图 5: 人口选择过程.(A) 两个2D 投影中五可区分的种群的位置。(B) 在图 2C中的象形文字的副本。(C) 代表PF数据的3D 散点图。数据点的着色仅用于可视化。使用与 B 中相同的颜色代码。(D) 通过在2D 直方图的峰值周围绘制自由多边形来完成相对种群的测定。使用图 3中描述的两个投影的组合, 可以区分所有五填充。(E) 图中所示的PF数据的直方图的3D 高斯拟合结果是 FWHM 中的等值, 它代表五不同的种群。请单击此处查看此图的较大版本.

图 6: 集成 3D HMM 优化的流程图.一个模型是针对数据集的所有分子进行优化的。起始值由输入模型 (具有预先定义的状态数) 给出。给定数据的模型的可能性 (3D PF跟踪) 用前向向后 (FB) 算法进行分级。鲍姆 (BW) 算法生成参数的局部极大似然估计。然后可以迭代地发现全局极大似然。维特比算法计算出最有可能的状态轨迹给出一个模型。请单击此处查看此图的较大版本.

图 7: 有意义的不确定性估计与 CI.(A) 为一个模范速率常数确定 CI。将测试模型的似然比 (LR) 与最大似然估计模型进行了比较, 计算出了速率常数的极大似然区域。当 LR 超过 3.841 (水平暗灰色线) 时, 就达到了95% 的置信度。(B) 提取的速率常数不附加核苷酸 (红色) 和与 AMP (蓝色) 和他们的 95% CI。请单击此处查看此图的较大版本.

图 8: 在存在额外的核苷酸的情况下, 对Hsp90 的报告核苷酸放大器的平均驻留时间会延长.(A) 象形从 Hsp90 二聚体中观察到的标记的安培-PNP * 的离解, 平均超过 Hsp90 的所有构象。用黄色椭圆形描述 Hsp90 的畴结构, 并通过叠加一个开放和闭合的二聚体来表示构象的灵活性。(B) 在没有附加的核苷酸 (红色) 和存在250µM 未标记的 amp (蓝色) 的情况下, Hsp90 的平均驻留时间。请单击此处查看此图的较大版本.

我们提出的实验程序, 以获得三色 smFRET 数据的复杂蛋白质系统和逐步描述的分析这些测量。这种方法提供了一种独特的可能性, 直接评估多个交互站点或构象变化之间的相关性。

为了在蛋白质上获得合适的多色单分子数据, 在低噪声水平下进行可重复测量是很重要的。这可以通过使用高效可靠的流室⁹的表面钝化协议来实现。一个足够密度的分子固定在表面, 应用于提高每片电影的分子产量。这意味着单分子的荧光光应该落在所记录的图像中大约 5-10% 的像素上。同时超载应该防止, 因为它将导致邻居分子的重叠。当一个标记的物种是免费的解决方案 (AMP-PNP * 在所提出的研究), 确保浓度足够低, 以不干扰的测量直接激发的波长较短的激光器 (即,通常远远低于 micromolar浓度)。此外, 确保这些化合物的浓度不低于预期, 由于不绑定到接口。此外, 最佳励磁功率表示信噪比和漂白的荧光。

在所提出的协议中, 没有采用氧气清除系统。使用的阿托染料在实验的时间尺度上不显示显著的闪烁 (每励磁周期70毫秒光照), 由葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和 Trolox 33 组成的清道夫系统没有观察到照片漂白率的下降. ^,34。另外, 由于氧清除系统通常含有蛋白质组分到 micromolar 浓度³⁵, 没有氧清除剂可以避免由于不蛋白相互作用而造成的伪影。

另一个关键步骤是跟踪选择。对单个荧光的强度进行求和的面积的大小被选择为尽可能小, 但仍然大于设置的点扩展函数。请注意, 如果检测通道具有类似的明显伽玛因子, 则只能预期在联合强度迹线上的平坦高原, 因为在分析的这个阶段没有纠正这些痕迹。在分析中, 只有符合定义好的荧光强度标准的分子才包括在内 (3 节)。在PF跟踪中, 具有较差的信噪比的分子被排除在进一步分析之外, 并且不影响数据评估, 因为使用了明确的选择标准。

根据数据质量的不同, 备选方法提供最佳的状态分配。一个自由的多维合奏 HMM 基于荧光强度跟踪²⁷或PF跟踪可以应用到通过优化相应的发射概率来分配基础状态 (例如,高斯pdf) 同时优化动力学模型。这两种方法都有其优缺点。PF跟踪可能包含不利的峰值, 而荧光强度水平因分子而异。所提出的协议解决这个问题, 防止人为的过渡时, 峰值发生和估计的发射概率从3D 高斯适合的PF直方图, 只优化过渡概率在随后合奏嗯运行。

所提出的方法是有限的, 需要一个标记的互动伙伴, 绑定与一个可比较高的亲和力, 以便与低浓度所需的常规单分子测量。这可能是克服的策略, 以增加本地浓度 (耦合的互动伙伴³⁶, 在囊泡的封装^37,38) 或方法, 以减少兴奋的音量 (例如,零模式波导³⁹)。此外, 标签的位置必须选择与护理和控制实验是必要的, 以排除严重副作用的荧光。在 Hsp90 的情况下, 这通常是由 atp 化验, 这证明了酶活性⁴⁰。如有, 应考虑晶体或核磁共振结构的结构信息。首选位置是在表面暴露的循环, 远离交互界面, 而不是埋在一个蛋白质表面口袋。这可确保染料的大容量。

该框架适合于具有任意数量颜色的多色 smFRET 实验。我们专注于这里的三色测量, 因为它们已经提供了使它们有别于其他单分子实验的特性, 即直接观察两个进程之间的相关性的可能性 (例如,绑定互动伙伴和构象变化)。在标准的双色 smFRET 实验中, 这些信息是不可访问的, 但对于了解任何分子机器的功能具有根本的意义。

所提出的实验和分析能够对蛋白质系统进行表征, 这可能显示在高度灵活的状态之间的广泛的时间尺度上的动态³。这对比以前出版的多色 smFRET 实验, 它集中于脱氧核糖核酸或 RNA 模型系统, 例如假日连接点⁴, 陈列转折在 (主要二) 清楚地定义的状态之间。在蛋白质系统中, 由于漂白的 smFRET 实验中的时间带宽有限, 信噪比较低, 因此很难提取出完整的过渡概率集。在这里, 我们表明, 如果谨慎地使用, 并有合理的约束-用多维状态分配和集合隐马尔可夫分析的方法, 可以克服蛋白质系统的障碍, 用多色 smFRET⁹。

作者声明没有利益冲突。

这项工作由德国研究基金会 (研究所 39/969-1) 和欧洲研究理事会通过《紧急救济协调员赠款协定》681891资助。