Method Article
This protocol aims to alleviate the limitation of poor cell engraftment for stem cell treatment of myocardial infarctions through the use of a hydrogel system and a fibrin-based glue. With this approach, cell-to-tissue contact post-infarction can be maintained, increasing the therapeutic potential of beneficial agents at the site of injury.
The murine MI model is widely recognized in the field of cardiovascular disease, and has consistently been used as a first step to test the efficacy of treatments in vivo1. The traditional, established protocol has been further fine-tuned to minimize the damage to the animal. Notably, the pectoral muscle layers are teased away rather than simply cut, and the thoracotomy is approached intercostally as opposed to breaking the ribs in a sternotomy, preserving the integrity of the ribcage. With these changes, the overall stress on the animal is decreased.
Stem cell therapies aimed to alleviate the damage caused by MIs have shown promise over the years for their pro-angiogenic and anti-apoptotic benefits. Current approaches of delivering cells to the heart surface typically involve the injection of the cells either near the damaged site, within a coronary artery, or into the peripheral blood stream2-4. While the cells have proven to home to the damaged myocardium, functionality is limited by their poor engraftment at the site of injury, resulting in diffusion into the blood stream5. This manuscript highlights a procedure that overcomes this obstacle with the use of a cell-encapsulated hydrogel patch. The patch is fabricated prior to the surgical procedure and is placed on the injured myocardium immediately following the occlusion of the left coronary artery. To adhere the patch in place, biocompatible external fibrin glue is placed directly on top of the patch, allowing for it to dry to both the patch and the heart surface. This approach provides a novel adhesion method for the application of a delicate cell-encapsulating therapeutic construct.
心筋梗塞(MI)は、主要な冠動脈の閉塞によって引き起こされる心臓の領域への血液の中断として定義されます。 MIに起因する損傷が原因または、より具体的には、左心室は、適切に打つ心臓の能力を低下させる非機能的瘢痕組織に生存可能心臓組織のリモデリングです。これは、一回拍出量としても知られているすべてのハートビート、および駆出率6と呼ばれる各心拍で心臓から送り出される血液の割合で身体に送達することができる血液の量の減少をもたらします。これらは、他の減少の機能とともに、十分な機能を維持するために、心臓の残りの部分に負担を増加させます。多くの場合、これは、株は、それが第二の心臓発作、個人7の約10%に見られる現象を引き起こすほど重症になることができます増加しました。
医療行為は、治療のために進化してきたがMIの直後には、何の技術は遅く、停止、または組織リモデリングの負の副作用を逆転するように開発されていません。幹細胞療法は、それらの有望な潜在的にもかかわらず、しかし、そのような治療のための可能な道として出現した幹細胞は、臨床設定において成功することが証明されていません。その欠点の一つの理論は、有益な細胞が良好な結果5を生成するのに十分な長さ梗塞部位に残って確保することができないことです。これは単に、梗塞の部位に注射された細胞のない24%以上が生存していないと損傷部位1日後に配達2にとどまったことが示されています。細胞保持のこの問題に対処するための可能な見通しは、細胞または損傷部位に送達することができる治療薬のいずれかをカプセル化する生体適合性ヒドロゲル系を開発することです。このプロトコルにおける選択のヒドロゲルは、ポリ(エチレングリコール)は、細胞のカプセル化では、直前の使用広報によるメタクリレートでありますoceduresしかし、カプセル化することができる任意のヒドロゲルが8を使用してもよいです。直接損傷部位へのパッチの送達は、細胞が、下にある心筋に有益な因子を提供することができる時間の長さを増加させ、長期間にわたる細胞 - 組織接触を確実にします。
パッチアプローチのボトルネックは、心臓の表面にパッチを接着するのが困難です。多くのグループが、最も普及しているが、心臓の表面9,10に構造物を結びつけるための簡単な縫合糸である、種々の技術によってこれを克服しています。これは、構築物はより硬い材料で作られたケースの数は成功しますが、高い水濃度とパッチ構築物の繊細な性質のために、ヒドロゲル系にしようとしたときに失敗しました。これを克服するために、我々は、血栓形成の化学的性質を模倣するフィブリン糊外部接着剤系を利用しています。フィブリン糊は、INC、多数の医療手術で使用されています創傷シーラント11〜13として、製品の生体適合性を強調し、硬膜涙、気管支瘻、及び角膜移植をluding。さらに、フィブリンは、左心室破裂および冠動脈バイパス手術の外科的治療を含む心臓の目的の種々のために使用されている、しかし、心臓パッチの接着糊としてのその使用は、一般的に14〜17を使用していません。心臓の相互作用にパッチを確実にするために実行可能な接着システムを提供すること、外部心臓パッチの外側に直接配置することができる生体適合性の接着剤でトロンビンおよびフィブリノーゲン結果の単純な製剤。
手順はIACUCプロトコル番号13302との完全な互換性であり、動物資源の部門によって承認されています。
1.機器の準備
2.ハイドロゲルの調製
3.動物の準備とオーラルintubatiオン
4.手術手順
5.パッチの配置とグルー
6.縫合
7.手術後の処置
心機能と組織学の8解析
外科的処置の間に、左冠動脈の結紮は、閉塞した動脈の下流のブランチングマークすることによって同定することができます。結び目を作る前の試験のように、縫合糸は、それが適切な場所にあるかどうかを確認するために簡単に締め付けることができます。さらに、適切にビートに左心房の能力のほぼ瞬時減少動脈結果の閉塞ので、左心房は、システム内の血液の逆流に応じて拡大します。
Mモード心エコー検査の測定は、梗塞後は、筋肉の再構築を示す、左の壁運動の停止を示し、早くも2日としました。データから作られた定性的な計算は、梗塞心での駆出率とストローク量の減少を示します。心臓を組織学的目的のために収集されたときに実験の終了時に、左心室の明確な拡張は、左心室の薄型化に伴って、見ることができます壁、および機能の心筋細胞( 図1)の代わりに、瘢痕組織の沈着を示し、コラーゲンの沈着。
また、( 図2)は 、組織学的分析にヒドロゲルの存在は、フィブリンゲルの投与のおかげで構成で見られます。我々の目的のために、接着剤系は、正確な配置の制御を可能にし、周囲の器官に後続の流出を最小限にするのに十分に粘性でなければならないが、十分な展性心臓機能に干渉しません。予備試験は、我々のニーズに合った適切な組み合わせを決定するために、粘度、ゲル化時間、および様々なフィブリノゲン/トロンビン比の剛性を計算するために行われた。 インビボ分析はpatch-を維持するためにフィブリン糊の能力を試験するために行きました。の組織接着まだ完全心機能を可能にしながら(データは示さず)。これは、Lによって証明されるように、フィブリン糊は、心筋を傷つけるしなかったことに留意すべきです部位における組織リモデリング又は心室間伐のACK( 図2)。心筋細胞は、心臓パッチとそれに付随する接着剤の両方の添加にもかかわらず、無傷のままです。さらに、生存能力試験は、細胞カプセル化ハイドロゲルパッチの外部表面にフィブリン接着剤の投与は、( 図3)は 、パッチ内の細胞の生存に影響を及ぼさなかったことをことを確認しました。
図1:心エコー検査により測定される心機能の低下を左冠動脈結紮の結果(a)は、健康で、(b)は、梗塞心のMモード心エコー検査。梗塞心は、生存組織が瘢痕組織に置き換えられた壁運動の明確な欠如を示します。これは、左室駆出率(EF)で測定可能な減少と相関し、心臓発作ボリューム(SV)、および心拍出量(CO)。健康(c)および梗塞(d)の心臓の組織学的分析は、左心室および梗塞心筋の左心室壁の菲薄化、組織リモデリングおよび瘢痕組織沈着の両方の徴候の拡張を示しています。組織学的画像は、左(より大きな室)と右(小さい室)心室を捕獲する断面のスライスです。
図2。胸腔を手順(a)の間に露出している心臓にフィブリン煙を確実に接着パッチの適用は、パッチは、心臓の表面上に配置されます。配置されたら、フィブリンベースの接着剤は、心臓の上部に添加し、乾燥させます。パッチは、明らかに1週間後手順(B)で採取した心臓組織の組織学的切片上で見ることができます。組織学的画像における心臓表面からパッチの解離が収集および切削プロセスの成果物です。結果は、接着までの8週間で一致しています。
図3:フィブリンベースの接着剤は、カプセル化された組織を損傷しない細胞の生存率は、1週間前の刊行物8に詳細に記載されたプロトコルを使用して、フィブリンベースの接着剤の投与後にMTT分析により測定しました。パッチ内の細胞の生存率は、構造物の表面に接着剤を添加することによって影響されませんでした。
マウスMIモデルにこの方法では、我々は他のマウスのMI技術と関連している非心筋領域へのダメージを最小限に抑えるシステムを開発しました。これらの領域は、気管切開による損傷、筋層の切断、および胸腔を露出させるために、リブの破損を含みます。我々は、これらの変更は、外科手術中など、肋骨や筋肉の層を含む、主要な構造の多くの無傷を保つように注意する全体的な手術結果のおかげで改善することを考えています。
これは、最大の一日の唯一の8-10完全手術手順の結果、その時間がかかる性質であることで、この手法にはいくつかの制限があることに留意すべきです。これを克服するために、第二の人工呼吸器は、手順は、同時に2匹の動物に対して実行されるのを可能にする、使用することができます。加えて、肋間血管のような主要な血管、および開胸術を行う際に、内部胸動脈は、避けるべきです。これらの血管の近くにいる場合は、焼灼が原因破裂動脈にブリードアウトを防止するために使用されるべきです。
フィブリン糊は、すぐに血栓形成を助けるために、その能力、ならびにその潜在的な提供するために、ホストのMSC 14-17,19に実験室および臨床現場の両方のおかげで知られています。私たちの目的のために、フィブリン糊は、水ベースのヒドロゲルは、心臓の表面に付着した構築物の生体適合性のアプローチを務めました。フィブリンベースの接着剤の使用は、時間の長い量の組織との接触の可能性で、最大8週間、損傷部位でのヒドロゲル構造体を維持するのに成功しました。この接着システムの使用は、心筋などの構築物自体に害を与える追加の縫合を必要とせずにデリケートな構造物を配置するための制御を可能にしました。我々は、接着剤自体がカプセル化されたセルAに対して非毒性であることを見出しましたND負下にある組織には影響を与えません。ヒドロゲルおよびフィブリンベースの接着剤システムは、長期間の細胞または治療の接触を望む他の組織工学の様々な目的に適用することができます。また、SLAの製造方法を用いて、デザインおよび構造は細胞送達18より複雑なシステムを作成するために、パッチ内に組み込むことができます。
フィブリンベースの接着剤の使用に対する一つの後退は、複数の研究者が、パッチの配置と接着剤の添加の間に、外科用の部屋に存在しなければならないという事実です。これは、最初の研究者の仕事は第二の研究者は、溶液を混合し、適切な粘度に達した後にパッチに適用しながら、パッチは、所定の位置に残り、胸腔内に失われないことを確認することです。接着剤供給のタイミングを最適化するために、それは、第二の研究者は、パッチを配置する前に接着剤のゲル化をテストし回ことが示唆されています接着剤の適切なゲル化は、パッチの接着のために重要であるため。
最初は、心筋梗塞の誘導であるとのプロトコル内の重要なステップと、エラーが発生しやすい地域の数があります。これは、左冠状動脈の閉塞を確実にするために、例えば、左心室壁のブランチング及び左心房の拡大などの徴候を確認することが不可欠です。これは、単に交差縫合糸列の端部を締め付けて縫目を添加する前に行うことができます。それは左冠状動脈を縫合によって囲まれていないと判定された場合、文字列を取り出すことができる、再適用しました。第二の重要な尺度は、気管内に残り、中間手術引き出されないことを確実にするために、手順全体を通して挿管チューブを監視し続けることです。最後に、手術を通して、すべての試みは、任意の連絡先がつぶれた肺につながる可能性を秘めているように、肺に接触しないようになされるべきです。、手術中に、肺の崩壊が発生し、単純にするための試みで、最大3秒間挿管の流出管をブロックした場合、肺の問題を抱えた領域を再膨張させます。
The authors declare that they have no competing financial interests.
この作品は、米軍グラント(W81XWH-08-1-0701)とカール財団病院からフェローシップによって資金を供給されました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Harvard Model 687 Mouse Ventilator | Harvard Apparatus | 55-0001 | |
Inintech Biosciences LLC Dry Glass Bead Sterilizer | Fisher Scientific | NC9531961 | |
Leica MZ6 surgical microscope | Leica | ||
Cautery Kit | Gemini | GEM 5917 | |
Delicate Forceps - 0.4 mm Tips Angled | Fine Science Tools | 11063-07 | |
Agricola Retractor - 3.5 cm Spread | Fine Science Tools | 17005-04 | |
Spring Scissors - 2.5 mm Blades Straight | Fine Science Tools | 15000-08 | |
Castroviejo Needle Holder - w/Lock Tungsten Carbide 14 cm | Fine Science Tools | 12565-14 | |
Iris Scissors - Delicate Straight 10.5 cm | Fine Science Tools | 14060-10 | |
8-0 monofilament suture | Ethicon | 8730P | |
6-0 Silk suture | Ethicon | 639G | |
Thrombin | Sigma | T7009 | |
Fibrinogen | Sigma | F3879 | |
Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
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