Un hydrogel construire et de fibrine-colle à base son approche et proposer Therapeutics dans un infarctus du myocarde murin modèle.

This protocol aims to alleviate the limitation of poor cell engraftment for stem cell treatment of myocardial infarctions through the use of a hydrogel system and a fibrin-based glue. With this approach, cell-to-tissue contact post-infarction can be maintained, increasing the therapeutic potential of beneficial agents at the site of injury.

The murine MI model is widely recognized in the field of cardiovascular disease, and has consistently been used as a first step to test the efficacy of treatments in vivo¹. The traditional, established protocol has been further fine-tuned to minimize the damage to the animal. Notably, the pectoral muscle layers are teased away rather than simply cut, and the thoracotomy is approached intercostally as opposed to breaking the ribs in a sternotomy, preserving the integrity of the ribcage. With these changes, the overall stress on the animal is decreased.

Stem cell therapies aimed to alleviate the damage caused by MIs have shown promise over the years for their pro-angiogenic and anti-apoptotic benefits. Current approaches of delivering cells to the heart surface typically involve the injection of the cells either near the damaged site, within a coronary artery, or into the peripheral blood stream^2-4. While the cells have proven to home to the damaged myocardium, functionality is limited by their poor engraftment at the site of injury, resulting in diffusion into the blood stream⁵. This manuscript highlights a procedure that overcomes this obstacle with the use of a cell-encapsulated hydrogel patch. The patch is fabricated prior to the surgical procedure and is placed on the injured myocardium immediately following the occlusion of the left coronary artery. To adhere the patch in place, biocompatible external fibrin glue is placed directly on top of the patch, allowing for it to dry to both the patch and the heart surface. This approach provides a novel adhesion method for the application of a delicate cell-encapsulating therapeutic construct.

Un infarctus du myocarde (IM) est défini comme l'interruption de sang à une région du cœur provoquée par l'occlusion d'une artère coronaire principale. Le dommage résultant d'un infarctus du myocarde est dû au remodelage du tissu cardiaque viable dans du tissu cicatriciel non fonctionnel, ce qui diminue la capacité du cœur ou, plus précisément, du ventricule gauche, à frapper correctement. Il en résulte une diminution du volume de sang qui peut être délivrée au corps avec chaque battement de coeur, connu sous le volume d'éjection systolique, et le pourcentage de sang qui est pompé hors du cœur avec chaque battement du coeur, dite fraction d'éjection ^6. Ceux-ci, ainsi que d'autres fonctions diminué, augmente la pression sur le reste du cœur de maintenir une fonction adéquate. Souvent, cette souche accrue peut devenir si grave que cela provoque une deuxième crise cardiaque, un phénomène vu dans environ 10% des individus ^7.

Bien que les pratiques médicales ont évolué pour traiterimmédiatement après un infarctus du myocarde, aucune technique a été développée pour arrêter, lente, ou inverser les effets secondaires négatifs de remodelage tissulaire. Thérapies par cellules souches ont émergé comme une avenue possible pour un tel traitement, cependant, en dépit de leur potentiel prometteur, les cellules souches ont pas fait ses preuves dans le cadre clinique. Une théorie pour leurs lacunes est l'incapacité à assurer que les cellules restent bénéfiques sur le site de l'infarctus assez longtemps pour générer des résultats favorables ^5. Il a été démontré que pas plus de 24% des cellules qui sont simplement injecté dans le site de l'infarctus a survécu et est resté au endommagé le site un jour après l'accouchement ^2. Une perspective possible pour aborder cette question de la rétention cellulaire est de développer des systèmes d'hydrogel biocompatibles qui encapsulent soit des cellules ou thérapeutiques, qui peuvent être livrés avec le site endommagé. L'hydrogel de choix dans ce protocole est un poly (éthylène glycol) diméthacrylate raison de son utilisation précédente dans l'encapsulation cellulaire procedures, cependant, toute hydrogel capable d'encapsulation peut être utilisé ^8. La livraison de la pièce directement sur le site de la lésion assure un contact de cellule à tissu sur une longue période de temps, ce qui augmente la durée pendant laquelle les cellules peuvent fournir des facteurs bénéfiques pour le myocarde sous-jacent.

Un goulot d'étranglement à l'approche de patch est la difficulté d'adhérer le patch à la surface du cœur. De nombreux groupes ont surmonté ce à travers une variété de techniques, la plus répandue étant une suture simple de lier la construction à la surface du cœur ^9,10. Cela a fait ses preuves dans un certain nombre de cas dans lesquels le produit de construction est fabriqué en un matériau plus rigide, mais échoue lorsque la tentative sur un système d'hydrogel, en raison de la concentration élevée en eau et de la nature fragile de la construction de patch. Pour surmonter cela, nous avons utilisé un système d'adhésif de la colle de fibrine externe qui imite la chimie de la formation de caillot. La colle de fibrine a été utilisé dans de nombreux cabinets médicaux, incLUDING larmes dura, fistules bronchiques, et la greffe de cornée, soulignant la biocompatibilité du produit comme un produit d'étanchéité de la plaie ^11-13. En outre, la fibrine a été utilisé pour une variété de fins cardiaques, y compris le traitement chirurgical des ruptures ventriculaires gauche et pontages coronariens de l'artère, cependant, son utilisation comme colle d'adhérence pour un patch cardiaque n'a pas été couramment utilisé ^{14 à 17.} Un simple formulation de thrombine et de fibrinogène se traduit par une colle biocompatible qui peut être placé directement sur l'extérieur d'une pièce cardiaque externe, en fournissant un système d'adhérence adéquate pour assurer patch pour interaction cardiaque.

La procédure est en pleine compatibilité avec le numéro de protocole IACUC 13302 et a été approuvé par la division des ressources animales.

1. Instrument Préparation

1. Autoclave tous les instruments non jetables utilisés avant l'intervention chirurgicale pour assurer la stérilité.
2. Stériliser les instruments utilisés plusieurs fois dans une session avec un stérilisateur à billes de verre entre les utilisations.

2. Préparation d'hydrogel

1. Décongeler les cellules souches et de la plaque d'au moins 24 heures avant la création de la construction d'hydrogel.
2. Préparer les correctifs un jour avant l'intervention chirurgicale en utilisant un appareil de stéréolithographie (ou un instrument similaire) qui a été décrit en détail dans les publications précédentes ^8,18.
3. Pour créer l'hydrogel, d'abord générer un design (CAD) modèle du patch désiré assistée par ordinateur et la conception exporter au format de stéréolithographie (STL).
4. Créer une solution de pré-gel par dissolving de poly (éthylène glycol) diméthacrylate (PEGDMA) dans du PBS 1x stérile pour obtenir une solution à 20% p / v. En même temps, dissoudre le photoinitiateur 1- [4- (éthoxy-hydroxy-2) phényl] -2-hydroxy-2-méthyl-1-propane-1-one dans du DMSO. Ajouter le photo-initiateur à la solution finale à une PEGDMA en poids / volume de 0,5%. Directement avant réticulation, ajouter 100 ml de la densité souhaitée de cellules. Remarque: Une densité de cellules entre 2,0 x 10 ⁵ -2,0 x 10 ⁶ cellules / ml est recommandée.
5. Introduire à la pipette la solution de pré-gel dans un plat au centre de la plate-forme SLA et exécuter le logiciel SLA avec la conception de la STL formaté précédemment téléchargée.
6. Retirer les plaques de l'appareil et incuber les hydrogels O / N, dans Eagle modifié du milieu de Dulbecco (DMEM) supplémenté avec du sérum de 5% de fœtus bovin (FBS), 100 U / ml de pénicilline et 100 mg / ml de streptomycine afin de permettre pour les cellules à ajuster à l'environnement dans le patch.

3. Préparation des animaux et intubati oralessur

1. Évaluer chaque souris avant la procédure pour assurer que l'animal est en bonne santé, tel que déterminé à partir de leurs habitudes de toilettage et les interactions avec leurs compagnons de cage. Note: 8-10 semaines vieilles souris C57BL / 6J femelles ont été utilisés pour cette procédure, cependant, tout âge de la souris ou de type peuvent être utilisés.
2. Placez les animaux dans une chambre d'anesthésie et exposer à 5% isofluorane avec un 1 L / min ₂ O soutien. Surveiller le niveau de l'anesthésie par pincement de l'orteil réflexe.
3. Une fois que l'animal est correctement anesthésié, peser et de les placer sur le stand de l'intubation.
4. Diriger une source de lumière vers la cavité thoracique de l'animal et utiliser une pince pour retirer la surface du larynx et d'exposer les cordes vocales. Guidez soigneusement un G angiocath 20 entre les cordes vocales, et insérer en douceur dans la trachée. Détecter l'insertion correcte par un mouvement mécanique de la cavité thoracique, une fois que le cathéter est raccordé au petit ventilateur animal.
5. Réglez les paramètres de ventilation à THpoids e de l'animal sur la base des directives du fabricant.
6. Une fois intubé, placer l'animal dans la position couchée sur un coussin chauffant pour prévenir l'hypothermie. Assurez-vous que le coussin chauffant ne dépasse pas 40 ° C. Si nécessaire, placer une barrière entre l'animal et le tampon de chauffage pour minimiser les risques de brûlures.
7. Enlever les poils à partir du site chirurgical à travers l'utilisation d'une crème dépilatoire. Stériliser le site en 3 gommages alternées de bétadine et 75% d'éthanol pour assurer la stérilisation approprié. Placez un drap pour exposer tout le site chirurgical, et placez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse au cours de la procédure.

4. Procédure chirurgicale

1. La thoracotomie est réalisée sur le côté gauche de l'animal, par conséquent, faire une incision de la peau d'environ 1 cm à gauche du sternum, qui court le long du sternum.
2. Utiliser des pinces pour séparer la couche musculaire sous-jacent à partir de la cage thoracique en deux étapes. Observer un delineligne d'exploita- qui représente les principaux muscles pectoraux de l'animal. Soulevez légèrement ce muscle, le séparer du muscle oblique externe sous-jacente et se rétracter en dedans. Ensuite, libérer le muscle oblique externe de la cage thoracique sous-jacente de la même manière, et rétracter latéralement, fournissant une vue dégagée de la deuxième, troisième, et quatrième nervures.
3. Effectuez la thoracotomie entre les troisième et quatrième côtes. Soulevez doucement la quatrième côte et utiliser un cauterizer pour ouvrir la cavité thoracique entre les troisième et quatrième côtes. Placez rétracteurs à ouvrir davantage la cavité et d'exposer le coeur.
4. Utilisez une pince à rompre le mince péricarde du cœur.
5. Ligaturer l'artère coronaire gauche avec une suture en nylon monofilament 8-0. Placer la suture d'environ 4 mm de la pointe du cœur, directement au-dessous de l'extrémité inférieure de l'oreillette gauche. Déterminer le placement de suture appropriée par un blanchiment du myocarde ventriculaire et une augmentation de la taille de l'oreillette gauche après la suture a été liée.

5. Patch placement et de colle

1. Gardez correctifs à 37 ° C et 5% de CO ₂ conditions jusqu'à utilisation.
2. Soulevez doucement le patch en utilisant une spatule indéterminée plat et placer doucement sur la surface du cœur, sur le site de l'infarctus.
   Remarque: Pour éviter de glisser hors du ventricule gauche, le patch peut être maintenu en place par le maintien de la légère contact en utilisant soit la spatule ou la pointe d'une paire de pinces.
3. Préparer la colle en mélangeant un ratio de 4: 1 du fibrinogène à la thrombine. Mélanger la solution par pipetage répété jusqu'à ce qu'il commence à épaissir, habituellement dans 1 min après le début de la préparation.
4. Une fois que la viscosité de la solution atteigne le niveau désiré, transférer rapidement d'environ 10 ml à la surface du patch. Remarque: Le temps de coagulation de la colle de fibrine est rapide, fournissant une petite fenêtre d'opportunité pour un transfert efficace de la colle.

6. Suture

1. Effectuer toutes les sutures de fermeture en utilisant une suture en nylon 6-0 monofilament.
2. Fermez la couche de nervure trois à quatre points de suture séparés individuels.
3. Avant la fermeture complète de la couche intercostal, insérer une canule PE-10 dans l'incision à évacuer la cavité de la poitrine après la fermeture est complète et rétablir la pression intrapleurale correspondant.
4. Fermez les muscles pectoraux trois à quatre points de suture séparés individuels.
5. Sceller la couche de la peau avec une suture continue.
6. Suite à la fermeture complète, fixer une seringue de 1,0 ml à l'extrémité de la canule et l'utiliser pour évacuer la cavité thoracique.
7. Appliquer un adhésif tissulaire au site d'incision à renforcer le site de suture.

7. Traitement post-opératoire

1. Envoyer des souris une injection de buprénorphine (0,05-1,0 mg / kg) et le carprofène (2,2 mg / kg) par voie sous- cutanée immédiatement après la ligature coronaire et moins 20 min avant le réveil. Administrer deux médicaments 6-8 h après la chirurgie, Et ensuite donner deux fois par jour pour un maximum de trois jours pour contrôler la douleur et la détresse.
2. Surveiller en permanence les animaux jusqu'à conscient et toutes les heures pour la première 4 heures après la chirurgie. Effectuer un deuxième bilan de la nuit de la chirurgie (2-4 heures plus tard) d'administrer une deuxième dose d'analgésique.
3. Surveiller les animaux tous les jours après le deuxième jour suivant la procédure, jusqu'à ce que les animaux semblent stables.

8. Analyse de la fonction cardiaque et histologie

1. Effectuer Échocardiographes sur les souris 4 semaines après la procédure afin de déterminer l'étendue des dommages suite à la MI.
2. Anesthésier la souris avec 4-5% d'isoflurane dans une chambre pour l'induction de l'anesthésie anesthésie par inhalation, puis 2% d'isoflurane au masque pour entretien de l'anesthésie.
3. Dégagez la zone d'imagerie avec une crème dépilatoire et utiliser un petit échographie animale pour obtenir un balayage de l'échocardiographie 2D M-mode du coeur battant et enregistrer des paramètres asso fonctionnelleciées avec elle.
4. Euthanasier les souris dans une chambre de dioxyde de carbone, puis recueillir les coeurs des animaux et les placer dans une solution de formol à 10% pendant 24 heures. Après 24 heures, transférer les cœurs à 70% d'éthanol et de garder à 4 ° C jusqu'à ce que le traitement des tissus.
5. Traiter les cœurs et les intégrer dans des blocs de paraffine.
6. Coupez 5 mm articles à travers la région ventriculaire du coeur, à partir de la pointe et se terminant à l'atrium.
7. Stain tranches avec deux trichrome et hématoxyline Masson et aux taches de éosine utilisant des protocoles standards sectionné.

Au cours de l'intervention chirurgicale, la ligature de l'artère coronaire gauche peut être identifié par un net blanchiment en aval de l'artère occluse. Comme un test avant d'attacher le noeud, la suture peut être serré brièvement pour vérifier si elle est à l'endroit approprié. En outre, étant donné que l'occlusion de l'artère résultats dans presque instantanée diminution de la capacité de l'oreillette gauche à battre correctement, l'oreillette gauche va agrandir en réponse à un reflux de sang dans le système.

Mesures d'échocardiographie en mode M prises dès que deux jours post-infarctus montrent une cessation du mouvement de la paroi gauche, indicative de la reconstruction musculaire. Calculs qualitatifs réalisés à partir des données montrent une diminution de la fraction d'éjection et le volume de la course dans les cœurs un infarctus. A la fin de l'expérience, quand les cœurs sont collectées à des fins histologiques, une dilatation claire du ventricule gauche peut être vu, avec un amincissement de la ventriculaire gauchemur, et le dépôt de collagène qui dénote dépôt de tissu cicatriciel en place de fonctionner cardiomyocytes (Figure 1).

On voit également sur ​​l'analyse histologique est la présence de l'hydrogel construction grâce à l'administration du gel de fibrine (Figure 2). Pour nos besoins, le système adhésif doit être suffisante pour permettre le contrôle de placement précis et minimiser le ruissellement ultérieure dans les organes environnants visqueuse, mais suffisamment malléable pour ne pas interférer avec la fonction cardiaque. Des essais préliminaires ont été effectués pour calculer la viscosité, le temps de gélification, et la rigidité de divers rapports de fibrinogène / thrombine, afin de déterminer la combinaison appropriée qui convient à nos besoins. Analyse in vivo a été réalisée pour tester la capacité de la colle de fibrine pour maintenir patchwork à l'adhérence des tissus tout en permettant fonctions cardiaque (données non présentées). Il est à noter que la colle de fibrine ne pas nuire au myocarde, comme en témoigne le lack de remodelage tissulaire ou ventriculaire amincissement sur ​​le site (Figure 2). Les cardiomyocytes restent intactes malgré l'ajout d'un patch à la fois cardiaque et sa colle accompagnant. En outre, les essais de viabilité ont confirmé que ce que l'administration de la colle de fibrine sur la surface externe d'une pastille d'hydrogel encapsulant des cellules n'a pas affecté la survie des cellules à l'intérieur de la pièce (Figure 3).

Figure 1:. Coronaire gauche artère ligature en résulte une diminution de la fonction cardiaque, telle que mesurée par échocardiographie en mode M échocardiographie de santé (a) et un infarctus (b) de cœurs. Coeurs infarcis montrent un manque évident de mouvement de la paroi où le tissu viable a été remplacé par du tissu cicatriciel. Cette corrélation avec une diminution mesurable de la fraction d'éjection ventriculaire gauche (EF), accident vasculaire cérébral cardiaquevolume (SV), et le débit cardiaque (CO). L'analyse histologique de santé (c) et (d) un infarctus cœurs montre la dilatation du ventricule gauche et l'amincissement de la paroi ventriculaire gauche ayant subi un infarctus du myocarde, les deux signes de remodelage tissulaire et le dépôt de tissu cicatriciel. Images histologiques sont des tranches transversales capturant la droite (petite chambre) ventricules gauche (grande chambre) et.

Figure 2:. Application de fibrine Flue Assure Patch adhésion au coeur Le patch est placé sur la surface du cœur tandis que la cavité de la poitrine est exposée au cours de la procédure (a). Une fois placé, une colle à base de fibrine est ajouté au-dessus du cœur et on laisse sécher. Le patch peut être clairement vu sur les coupes histologiques de tissu cardiaque qui ont été recueillis à 1 semaine après la procédure (b).Dissociation du patch de la surface du cœur dans les images histologiques est un artefact du processus de collecte et de sectionnement. Les résultats sont en accord pour un maximum de 8 semaines d'adhérence.

Figure 3: colle à base de fibrine ne nuit pas encapsulés tissus viabilité cellulaire a été mesurée par analyse MTT 1 semaine après l'administration d'une colle à base de fibrine en utilisant des protocoles décrits en détail dans les publications précédentes ^8.. La viabilité des cellules au sein de la pièce n'a pas été affectée par l'addition de la colle à la surface de la construction.

Avec cette approche pour le modèle MI murin, nous avons développé un système qui minimise les dommages aux zones non-myocarde qui sont associés à d'autres techniques MI murins. Ces domaines comprennent les dommages causés par une trachéotomie, la coupe de la couche musculaire et la rupture des nervures afin d'exposer la cavité de la poitrine. Nous croyons que ces changements améliorent les résultats globaux chirurgicales grâce au soin apporté à garder autant des grandes structures, y compris les côtes et les couches musculaires, intacte pendant l'intervention chirurgicale.

Il convient de noter qu'il ya des limites à cette technique, la plus importante étant la nature de temps, résultant en seulement 8-10 procédures chirurgicales complètes en une seule journée. Pour y remédier, un deuxième ventilateur peut être utilisé, ce qui permet pour la procédure à effectuer sur deux animaux simultanément. En outre, les navires majeurs, tels que les vaisseaux intercostaux etintérieur artère thoracique, devrait être évitée lors de l'exécution de la thoracotomie. Si près de l'un de ces navires, un cauterizer doit être utilisé pour prévenir les saignements en raison de la rupture d'une artère.

La colle de fibrine est connu à la fois dans le laboratoire et paramètres cliniques grâce à sa capacité à aider rapidement à la formation de caillots, ainsi que son potentiel de livrer et d'accueil MSC ^14-17,19. Pour nos fins, la colle de fibrine a servi comme une approche biocompatible à respecter un hydrogel à base d'eau de construire à la surface du cœur. L'utilisation d'une colle à base de fibrine a fait ses preuves en maintenant la construction d'hydrogel sur le site endommagé pendant jusqu'à 8 semaines, avec la possibilité de contact avec le tissu d'une quantité de temps plus longue. L'utilisation de ce système d'adhésion a permis le contrôle pour le placement de la construction délicate sans avoir besoin de sutures supplémentaires qui nuisent le myocarde ainsi que la construction elle-même. Nous avons découvert que la colle elle-même est non toxique pour les cellules encapsulées une n'a pas d'incidence négative sur le tissu sous-jacent. L'hydrogel et un système de colle à base de fibrine peuvent être appliquées à une variété d'autres fins d'ingénierie tissulaire qui désirent cellule ou un contact thérapeutique pendant une période prolongée de temps. En outre, avec l'utilisation de la méthode de fabrication SLA, des dessins et des structures peuvent être incorporées dans le patch de créer un système plus complexe pour la livraison de la cellule ^18.

Un revers pour l'utilisation de la colle à base de fibrine est le fait que plus d'un chercheur doit être présent dans la salle d'opération lors de la pose de patch et plus de colle. Il est le travail du premier chercheur à assurez-vous que le patch reste en place et ne pas se perdre dans la cavité de la poitrine, tandis que le second chercheur mélange la solution et l'applique à l'patch après viscosité appropriée est atteinte. Afin d'optimiser le calendrier de la livraison de la colle, il est suggéré que le second chercheur teste et parfois aussi la gélification de la colle avant le placement de patch,depuis une bonne gélification de la colle est critique pour le patch adhérence.

Il ya un certain nombre d'étapes critiques et les zones sujettes à erreur dans le protocole, le premier étant l'induction de l'infarctus du myocarde. Il est impératif de vérifier les signes, tels que le blanchiment de la paroi ventriculaire gauche et l'élargissement de l'oreillette gauche, afin d'assurer une occlusion de l'artère coronaire gauche. Ceci peut être réalisé avant l'addition de la maille traversée par simple serrage et la fin des chaînes de suture. Si l'on détermine que l'artère coronaire gauche est non entourée par le fil de suture, la chaîne peut être retiré et la ré-application. Une deuxième mesure essentielle est de continuer à surveiller le tube d'intubation long de la procédure, pour assurer qu'il demeure dans la trachée et ne soit pas sorti mi-chirurgie. Enfin, tout au long de l'opération, tous les efforts doivent être faits pour éviter le contact avec les poumons, comme tout contact a le potentiel de conduire à un collapsus pulmonaire.Si, au cours de la chirurgie, effondrement du poumon se produit, il suffit de bloquer le tube de sortie de la intubateur jusqu'à 3 sec dans une tentative pour regonfler régions troublées des poumons.

The authors declare that they have no competing financial interests.

Ce travail a été financé par Grant US Army (W81XWH-08-1-0701) et une bourse de recherche de l'Hôpital Carle Fondation.