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要約

ここに記載されているプロトコルは、修飾されたヌクレオシド三リン酸に至る複雑なルートのように数々の障害を説明し、要約するすることを目指しています。結果的に、このプロトコルは、これらの活性化ビルディングブロックの合成と実用化のための彼らの可用性の両方を容易にします。

要約

化学官能基の導入のための伝統的な戦略は、新生鎖に適切に修飾されたホスホルアミダイト前駆体を付加することにより、固相合成の使用である。しかし、合成中に使用される条件と、むしろ短い配列への制限は、この方法論の適用を妨げる。一方、修飾されたヌクレオシド三リン酸は、核酸に多数の官能基の導入のために軽度の実用的な用途の幅広いパレットの修飾された核酸の使用への道を開く戦略を採用されている構成要素を活性化さこのようなリボザイムおよびDNAザイムの機能的タギングおよび生成など。主要な課題の一つは、これらのヌクレオシド類似体の単離および特徴付けをもたらす方法論の複雑さにある。

このビデオの記事では、我々はテサロニケの合成のための詳細なプロトコルを提示Eリン（III）ベースの試薬を用いて類似体を変更しました。また、それらの生化学的特性評価のための手順は、プライマー伸長反応とのTdTテーリング重合に特別な重点を置いて、漏らしている。この詳細なプロトコルは、修正されたdNTPのクラフトや化学生物学におけるそれらのさらなる使用のために使用されるであろう。

概要

5'-ヌクレオシド三リン酸（（D）のNTP）は、エネルギーのユニバーサル為替であることから細胞代謝の調節因子に至るまで無数のプロセスと機能に関与している重要な生体分子のクラスを表す。これらの基本的な生物学的変換での彼らの役割に加えて、これらの変性の対応は、オリゴヌクレオチドに官能基を導入するための汎用性とマイルドなプラットフォームとしてうまく通常1,2に適用され、自動化固相合成を補完する方法論を進めてきた。実際に、（d）には、NTPをRNAのための基質として作用することができ、DNAポリメラーゼが3に 、アミノ酸4-13、ボロン酸14,15を含む官能基の富に対するnornbornene 16、ダイヤモンド状の残基17、側鎖設け有機触媒18、胆汁酸19、さらには20オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに導入することができる。

_content ">核酸の機能化のための便利なベクトルを表す以外に、修飾dNTPは、SELEXと変更された触媒核酸21〜30と、様々な実用的なアプリケーション10のためのアプタマーを生成するためのin vitro選択の他の関連するコンビナトリアル法に従事することができます31-36。修飾dNTPの重合により導入される追加の側鎖は、選択実験の間探求および核酸37のかなり乏しい官能性兵器を補完することができる化学容量を増加させると考えられているが、これらにもかかわらず魅力的な特性と、合成および分析方法の両方の開発で行われた最近の進歩、ない普遍的に適用し、高収量の手順では、修飾されたヌクレオシド三リン酸2,38のクラフティングのために存在しています。

この議定書の目的は、（場合によっては）複雑な手順をリードするTに光を当てることですこれらの活性化ビルディングブロック（ 図1B）の合成および生化学的特徴O。特に重点は頻繁に見つけることは困難であるか、実験のセクションには存在しないが、純粋な（D）のNTP（ 図1）を単離に至る合成経路が正常に完了するためにまだ非常に重要であるすべての合成の詳細について説明する。

プロトコル

1。修飾ヌクレオシド三リン酸の合成

選択された合成法は、この方法は一般的に信頼性が高く、非常に少数の副生成物（ 図1A）39につながるため、ルートヴィヒとエクスタインによって開発された手順に従います。

  1. 一晩真空下で乾燥した後、無水ピリジン（2ミリリットル）で2回、適切に3'-OAcで保護されたヌクレオシド（通常は0.1 mmol）のCoevaporateと。同時に、一晩真空下で乾燥したピロリン酸トリブチルアンモニウム（0.13ミリモル）。
  2. 乾燥ピリジン（0.2ミリリットル）の最小でヌクレオシドを溶解し、共溶媒として乾燥ジオキサン（0.4ミリリットル）を追加します。最後に、2 - クロロ-1,3,2 - ベンゾジ-4 - オン（0.11ミリモル）を添加し、45分間室温で反応させる。
    注意：これは、特に注意が2 - クロロ-1,3,2 - ベンゾジ-4-1試薬と取られるべきであることは注目に値する。実際に、不活性ガス下でatmospこの試薬の偶数記憶ここにその分解を防止するのに十分ではない。従って、この分解に形成された白色固体を、使用前に掻き取られるべきであることができる。
  3. （0.17ミリリットル）の乾燥DMFトリブチルアンモニウムピロリン酸の溶液を調製し、新たに蒸留したトリ（58μL、モレキュラーシーブを追加ことはありません）。反応混合物（白色沈殿物が現れるが、すぐに消える）に、得られた溶液を添加し、45分間室温で反応させる。
  4. ヨウ素の溶液をピリジン（0.16ミリモル）（0.98 ml）およびH 2 O（20μl）を調製し、Pα（III）中心を酸化するために反応混合物に加える。得られた暗色溶液を30分間室温で撹拌する。
  5. 過剰のI 2をクエンチするのNaS 2 O 3の10％水溶液を使用する。真空下で溶媒を除去（ロータリーエバポレーターの水浴の温度が30℃以下に維持しなければなりません）。 H 2 O（5ミリリットル）を追加し、MIを許容環状三リン酸部分を加水分解し、30分間室温で放置するxture。
  6. この段階で、保護基は、通常（ すなわち、3'-OAcでかつ核酸塩基の側鎖上の基）を除去する。したがって、粗にNH 4 OH（H 2 O、10ml中30％）を添加し、室温で1.5時間撹拌し、真空下で溶媒を除去する。
  7. 2管に、H 2 Oとスプリットの2ミリリットルを追加します。 30分間アセトン、遠心（1,000×g）で中のNaClO 4の2％溶液の12ミリリットルを追加します。この手順をもう一度繰り返す。この沈殿は、このように実質的に続くRP-HPLC精製を簡略化（沈殿する）三リン酸からの合成に使用される溶媒および試薬の分離を可能にする。
  8. 油状の残渣の風乾した後、（標準的な手順以下の材料および図3のリストも参照されたい）粗製の31 P-NMRスペクトルを記録し、4ミリリットルのH 2 Oに溶解する
    注：この合成手順は、主に、修飾デオキシヌクレオシド三リン酸の生成に焦点を当てたが、非常に類似した手順は、（単に2 '、3'-ビス-O-アセチル化前駆体を使用して）、そのRNA対応物に適用することができる。

2。修飾ヌクレオシド三リン酸のHPLC精製

  1. 重炭酸トリエチル（TEAB）の1Mストック溶液の調製：40
    1. 蒸留し、濾過しH 2 Oの≈600ml中のトリエチルアミン1モル（139 ml）溶液を調製
    2. 激しく攪拌しながら溶液に（ドライアイス及びガスバブラーを介して）バブルCO 2 7.6のpHに到達するまで（これは、少なくとも10時間かかります）。このストック溶液を最大1ヶ月間冷蔵庫内に保存することができる。
  2. 精製：
    1. 超純水中の50 mMのTEABの2 L（溶出液A）A：1Mストックから2の緩衝液を準備します50％の50mM TEAB 1リットルのMeCN（溶離液B）を購入する。両方の溶出液を真空下で20分間攪拌したドガは（細心の注意を脱ガス中にCO 2を除去することにより、pHを変化させないように必要とされる）。
    2. 300μlの蒸留H 2 O中の粗三リン酸を10μlに溶解することにより、分析試料を調製し、セミ分取RPカラム（C18）を搭載し、範囲の勾配を用いたHPLCシステムに注入し40分で0〜100％Bから（ 図4）。 （通常は、クロマトグラムのメインピークである）三リン酸のR Tと（わずかに低いR tを有する）二リン酸に応じて、HPLCプログラムを調整します。これらの条件を用いて粗混合物を精製し、いくつかの二リン酸が含まれている場合があり、早期の画分を除去することによって。
    3. 望ましくないdiphosphへの加水分解を最小限にするために、回転蒸発器で蒸発して好まれている（製品を含むすべての画分を組み合わせ、凍結乾燥）食べた。 （溶離液から残留トリエチルアミンを除去するために）、超純水で数回Coevaporate。標準的なプロトコルを適用することによってNMR（1 Hおよび31 P NMRの両方）およびMALDI-TOFによって三リン酸の純度を評価する（ 図5参照）。このプロトコルの適用により得られた典型的な収率は、典型的には、基質に応じて、30〜70％の範囲にある。

3。プライマー伸長反応とのTdT重合

  1. プライマーの5 '末端標識
    1. 10倍のポリヌクレオチドキナーゼの4μL（PNK）緩衝液、3μlのγ-[32 P]-ATP、PNKの1μL、およびのddH 2 O（のために適当なプライマー（ 例えば 、P1、材料のリスト）の30ピコモルを混ぜる40μlの総反応容量）。 30分間37℃で反応混合物をインキュベートし、次いでキナーゼ（70°Cで10分間）加熱失活。
    2. 標識反応の準備中にシラン化ガラスウールで1ミリリットルピペットチップを接続し、G10液（蒸留H 2 O中10％、オートクレーブ処理）で先端を充填することによってG10セファデックスカラム。スピンダウンし、500μlの蒸留H 2 Oおよび50μlのddH 2 Oで1最終洗浄で3回洗浄（無料で放射性標識を除去するために）G10を通して反応混合物を実行します。
    3. ゲルは、（20ページ％）の放射性標識プライマーを浄化し、クラッシュを適用することによって回復し、15 72℃で1％のLiClO 4と1ミリメートル純3（pH8）に含有する水溶液500μlの方法（ すなわち溶出ソーク分）。エタノール沈殿し、G10が溶出されたオリゴヌクレオチドを​​脱塩。
  2. プライマー伸長反応
    1. アニール1放射性標識プライマーP1のピコモル、10ピコモルのプライマーP1、およびtを配置することによって（使用されるポリメラーゼの供給業者によって提供される）10×反応緩衝液中のテンプレートT1 10pmolの（材料のリスト）熱い（90〜95℃）の水に、徐々に（45分かけて）室温まで冷却することにより宇部。
    2. チューブを氷上に置き、（順番に）追加します（変更された、自然な三リン酸、100μMの最終濃度の両方を含む）のdNTPカクテルやDNAポリメラーゼ（（ エキソベントの1 U - ）、クレ、 のPwoまたは9°N m）および20μlの総反応容量のための水（）を完備。 （ - ）が使用されているが、ベント（ エキソ 30分間、例えば 60°C）、酵素の最適な作動温度でインキュベートする。
    3. 停止液（ホルムアミド（70％）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA、50 mM）を、ブロモフェノールブルー（0.1％）、キシレンシアノール（0.1％））の20μl加え、サンプル（95℃、5分間）加熱し、冷却下（0℃）、そして変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により解決する。ホスホイメージャーで可視化する。
  3. TdTを重合
    1. 一本鎖の7ピコモルを希釈非標識プライマーP2（材料のリスト）、1μLのTdTバッファー10倍での放射性標識されたプライマーの1ピコモル。
    2. チューブを氷上に置き、（今度は）（10〜200μmの間に含まれる適切な濃度で）のdNTPカクテルとのTdTポリメラーゼ（4 U）を追加します。 1時間37℃でインキュベートする。停止溶液10μlを追加するサンプル（95℃、5分）を加熱、（0℃）を冷却し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE 15％）変性させることによって解決します。ホスホイメージャーで可視化する。

4。変更されたヌクレオシド三リン酸を用いたPCR

  1. 順方向の8ピコモルを混合し、増幅すべきテンプレートの0.5ピコモルとリバースプライマー。 10倍反応バッファーおよび（200μM最終濃度用）のdNTPカクテルを追加して、チューブを氷上に置く。 DNAポリメラーゼの1 Uを追加し、20μlの最終体積に達するまでのH 2 Oを備えた。 PCRのバイアルに混合物を移し、30回のPCRサイクルを実施しています。
  2. 2Xのスクロースローディングバッファーの6μlの6μLを希釈し、電気泳動（臭化エチジウムで染色した）をアガロースで2％を解決します。ホスホイメージャーで可視化する。

結果

彼らは核酸41への官能基の広大な配列の容易な導入を可能にするので修飾されたヌクレオシド三リン酸は合成標的を魅惑的なされています。しかしながら、これらの活性化されたビルディングブロックの単離および特徴は、しばしば困難であることが判明している。従って、本明細書に示した結果は、上述の合成および生化学的手順内の様々な工程（ 図1B）を追従する手助けを提供すると考えられている。

特に、 図3は、 すなわち A（リン中心の特性信号を観測することができる修飾されたdNTP（この特定の場合において、dUをBPU TP（4）18、図2）の典型的な粗31 P-NMRスペクトルを示す、-5.02（Pのγ）で-20.55で-10.44の二重線（のPα）と三重項のダブレット（Pβ）PPM）。また、よ高いリン酸塩（-21.02および-23.19 ppmのシグナル）とともに二リン酸の​​ために起因するignals（-4.84および-10.63 ppmの2重線）とリン酸（-0.18 ppmにおける一重項）副生成物は、常に、この段階で観察される。粗混合物の最初のRP-HPLC分析は、主な副生成物ながら、5（dUをBPU TP（4）の）主ピーク（R t を = 30.78分）、5'-三リン酸に対応し、図4に示されている' -二リン酸は、わずかに低い保持時間（R T = 30.03分）が表示されます。最後に、徹底したRP-HPLC精製後、変性のdNTPは、NMR及びMALDI-TOF（ 図5）により特徴付けされる必要がある。望ましくないジ-およびモノ-リン酸塩の存在が特徴的なシグナルを与えるため、1 H-NMR及び31 P-NMRスペクトルの両方が、修飾dNTPの純度を評価するために重要である。

nucleosの純度を確立した後アミド類似体及び質量又はUV-分光法のいずれかによってストック溶液の濃度を評価し、修飾されたdNTPは、種々のポリメラーゼによってその基質の受け入れ能力を評価するために、プライマー伸長反応において使用することができる。 図6は、プライマー伸長反応の結果を示すdUをトン P TP（2）、dAをHsと TP（6）、およびdCのヴァル TP（7）のいずれか2つの修飾dNTP（レーン8-10）の組み合わせ、または単独の修飾（レーン5-7）として使用で唯一の天然のdGTP（レーン11）と一緒に。

最後に、 図7は、別の修正されたdUTPを類似した代表のTdT媒介重合反応を示しています。この文脈において、dUをC P TP（1）およびdUのFP TP（3）のTdTための最良の基質である（レーン1および4）テーリング効率は同等であるので、あるいは天然のdTTP（レーン6）のそれを超えています。多分散少し長いサイズのオリゴヌクレオチドは観察することができるので、その代わりにdUをBPU TP（4）（レーン5）は、この文脈においてかなり乏しい基質である。

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図1。 A）（ベース）の合成のためのルートヴィヒ·エクスタインのアプローチは、39ヌクレオシド三リン酸を変更しました。B）の前にこのようなSELEXなどのアプリケーションでの使用に変更されたdNTPの合成および生化学的特徴付けに必要なすべての手順の模式図。 見るにはここをクリックしてください拡大表示 。

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図2。 dUをC P TP（1）のdU のt P TP（2）、dUをFP TP（3）、dUをBPU TP（4）、dUをイン·TP（5）、18のdA Hsは TP（：修飾されたヌクレオシド三リン酸の化学構造6）、およびDC ヴァルTP（7）13。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

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図3：31 P-NMRスペクトル（121 0.4 MHzの劣化ウランBPU TPの粗反応混合物のD 2 O）（4）。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

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図4。粗製のdU BPU TPのRP-HPLCプロファイル（4）：H 2 O中50mMのTEAB、溶離剤B：：3.5 ml /分（溶離液A：40分間で0〜100％溶離液B、流速Hで50mMのTEAB 2 O / CH 3 CN（1/1））。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

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図5。修飾されたヌクレオシド三リン酸のdU 宿泊 TP（5）の特性評価：A）31 P-NMRスペクトル（121.4 MHzの、D 2 O、128回のスキャン）、18 B）の 1 H-NMRスペクトル（300 MHzの、D 2 O、128スキャン）、C）、MALDI-TOFスペクトル。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

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図6。様々な塩基修飾dNTPの類似したプライマー伸長反応の代表的なゲル画像（15ページ％）レーン1：プライマー;。レーン2：dUTPのない自然のdNTP;レーン3：dATPのない自然のdNTP;レーン4：dCTPでない自然のdNTP;レーン5：ドゥ P-TP（2）T;レーン6：ダHsの TP（6）;レーン7：DC ヴァル TP（7）;レーン8：dAをHsと TP（6）とのdU さt Pの TP（2）;レーン9：ダHsの TP（6）とDC ヴァル TP（7）;レーン10：dUをさt Pの TP（2）およびdCのヴァル TP（7）;レーン11：dUのトン P TP（2）、dAをHsと TP（6）、およびdCのヴァル TP（7）;レーン12：自然のdNTPは、 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

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図7。様々な塩基修飾dUTPの類似とのTdT重合反応のゲル画像（20ページ％）レーン1：劣化ウランのCのP-TP（1）;レーン2：のdU さt Pの TP（2）;レーン3：ドゥ宿泊 TP（5）;レーン4：ドゥFP-TP（3）;レーン5：ドゥBPU TP（4）;レーン6：dTTPの;レーン7：プライマー。濃度：10μM、25、50μM、75μMの、および100μMの拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

ディスカッション

核酸への変更を含めることは、アンチセンスおよびアンチジーン剤の開発42,43、標識及びオリゴヌクレオチド41の機能的なタグ付けを含む数多くの実用的なアプリケーションのために重要である、と遺伝アルファベット44〜46を拡張するための努力において。化学的改変及び官能基は、通常、標準および自動固相合成プロトコルを適用することにより核酸中に導入される。しかし、ホロアミダイトビルディングブロックは、順番に化学官能47の性質に厳しい制限を課して、この方法論によって課せられたという過酷な条件に弾力性である必要があります。唯一の制限は、彼らがポリメラーゼ1,2の基質として作用することがあるので、その代わりに、変更されたヌクレオシド三リン酸の酵素媒介重合は、機能性のより広い範囲の導入を可能にする。 GENの顕著な不足しているにもかかわらず、公正妥当該当する方法論、信頼性が高く堅牢な合成および分析方法論は修正されたdNTPの合成のために開発されてきた。また、それらの固有の性質のため、変更された三リン酸は、さまざまな外部条件（ 例えば pH、温度）にかなり敏感であり、従って、それらの合成及び特性評価のための詳細なプロトコルは非常に有益である。

本明細書に提示されるワークフローは、これらのヌクレオシド類似体の生化学的特徴付けのための修飾dNTP、RP-HPLC精製、NMR分析および酵素アッセイの化学合成を含む。修飾dNTPの合成に成功し、特性評価のための最も重要なステップは、（NMRによる）の粗生成物の分析、徹底したHPLC精製、精製された物質の分析、および適切なDNA（RNA）ポリメラーゼの選択です。

修飾dNTPの合成のために私たちは、ルートヴィヒと​​エックによって開発された方法を適用副生成物が少なく歴ジョッキ39は 、わずかに長い合成経路を犠牲にしてではあるが、他の手順と比較して形成されている。それはしばしば強くDNAを阻害し、RNAポリメラーゼは、48ヌクレオシド二リン酸（dNDPs）の分離を可能にするので、RP-HPLC精製により、確実に全体の合成経路の旋回ステップを表す。合成および精製を達成した後、得られた三リン酸の純度は、ポリメラーゼを阻害する二リン酸が存在しないことを確実にするためにNMRとMALDI-TOFの両方によって評価することが必要である。

図6に示す取り込みアッセイは、明らかに、このアプローチの有用性を強調している。ノー速くより小さな断片に対応するバンドが観察できたので、実行されている-実際に、この代表的な実施例で用いた全てのdNTP（）は、この特定の場合には、エキソ （ベント）DNAポリメラーゼのための良好な基質であることが明らかになった。 BESIDEは、酵素は、カルボン酸残基（dUをさt Pの TP（3）およびdCのヴァル TP（7））と、以上39追加の負電荷を有するオリゴヌクレオチドの両方でのdNTP結果の重合で飾られた二つの基板を許容する。他の顕著な特徴は、修飾dNTPの取り込みに起因するバンドは、多くの場合、自然のコントロール（ 例えばレーン11と12を比較）より遅い電気泳動移動度を示すことである。このように、プライマー伸長反応は、修飾dNTPの基板の受け入れを評価するための強力かつシンプルな方法を表しています。

さらに、一本鎖オリゴヌクレオチドの3 '末端に三リン酸のTdT媒介重合は、高機能核酸49-52の生成のための魅力的な戦略である。 図7に示す代表的な例は、明らかセレクチンための手順を示していG の Co 2 +依存性のTdT 53によって許容される機能性。実際、dUをc の P は TP（1）およびdUのFP TP（3）、そのα-フェニルアラニン-Proを、それぞれのTdTための最良の基質であるタンパク質構成アミノ酸L-プロリンジペプチドを装備しを生じたされているでも、10μMという低濃度で、変更されていないのdTTPコントロールに引けを取らない効率をテーリング（レーン1および4）。多分散より長いサイズのオリゴヌクレオチドが高いだけで観察されているので、驚くべきことに、アナログのdU さt Pの TP（2）プロリン残基が遊離のカルボン酸と比較して、 トランスでのリンカーアームに接続されている場合、そのシス相手ほど良好な基質ではないのdNTP濃度（> 100μM、レーン2）。さらに、スルホンアミド修飾されたdNTP 5劣化ウランへのTdTと同等のための適度な基質である T P TP（2）（レーン3）。また、強固な水素結合供与性のモチーフを負いdUをBPU-TP（4）は 、、のTdTにはむしろ貧弱な基質および重合反応が変更されたdNTPの濃度に無関心であると思われます。 dUをC P TP（1）、dUをFP TP（3）>のdU のt P TP（2）、dUをイン·TP（5）> dUをBPU TP（4：これにより、基板受け入れの次の順序は、 図7から解釈することができる）。

最後に、修飾類似体を用いたPCR条件下で重合反応​​について記載した手順は、天然のdNTPを含むものとかなり類似している。しかしながら、これらの条件下でのポリメラーゼによる修飾dNTPの相溶性が高密度functionaliの生成のために決定的に重要である特にインビトロ選択実験におけるそれらの使用に関してのゼット核酸7。

要約すると、変更されたヌクレオシド三リン酸の合成と特性評価のための方法が強調され、このようなプロトコルの確立は、確かに新たな類似体の開発とクラフトのに役立つだろう。同時に、そのような新規なdNTPの出現は、官能化オリゴヌクレオチドの生成を促進する;特に、触媒核酸。

開示事項

利害の対立が宣言されていません。

謝辞

この作品は、スイス国立科学財団（助成N°PZ00P2_126430 / 1およびPZ00P2_144595）によってサポートされていました。教授C.ロイマンは感謝ラボスペースと設備を提供するためだけでなく、彼の一定のサポートのために認められている。さんスークネヒトは実りある議論のために認められている。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Tributylammonium pyrophosphate Sigma AldrichP8533Hygroscopic solid, keep under Ar
2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one Sigma Aldrich324124Moisture sensitive
PyridineSigma Aldrich82704Under molecular sieves
DioxaneSigma Aldrich296309Under molecular sieves
Dimethylformamide (DMF)Sigma Aldrich40248Under molecular sieves
Acetonitrile Fisher ScientificHPLC grade
TriethylamineSigma Aldrich90342
TributylamineSigma Aldrich90781
ddH2OMilli-Qdeionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)
Diethylpyrocarbonate (DEPC)Sigma Aldrich159220
D2OCambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-25
γ-[32P]-ATPHartmann AnalyticsFP-301
Natural dNTPsPromegaU1420
Vent (exo-) DNA polymeraseNEBM0257S
DNA polymerase I, Large (Klenow) FragmentNEBMO210S
9°Nm DNA polymeraseNEBMO260S
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT)PromegaM828A
Pwo DNA polymerasePeqlab01 01 5010
T4 PNKThermo ScientificEK0032
Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%)Serva10679.01
AgaroseApollo ScientificBIA1177
G10 SephadexSigmaG10120
UreaApollo ScientificBIU4110
Jupiter semipreparative RP-HPLC column (5μ C18 300 Å)Phenomenex
Gene Q Thermal CyclerBioconceptBYQ6042E
PCR vialsBioconcept3220-00
HPLC systemAmersham Pharmacia BiotechÄkta basic 10/100
All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE
5'-CAAGGACAAAATAC
CTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGA
CATCGCCTCTGGGCTA
ATAGGACTACTTCTAAT
CTGTAAGAGCAGATCC
CTGGACAGGCAAGGAA
TACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330
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