JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

بروتوكول الموصوفة هنا يهدف إلى شرح وينتقص من العقبات العديدة في طريق المسار المعقدة مما يؤدي إلى triphosphates نوكليوزيد تعديل. بالتالي، هذا البروتوكول يسهل على حد سواء تركيب هذه بناء كتل تنشيط وتوافرها للتطبيقات العملية.

Abstract

الاستراتيجية التقليدية لإدخال وظائف الكيميائية هو استخدام تركيب الحالة الصلبة بإلحاق السلائف phosphoramidite تعديلها لسلسلة الوليدة. ومع ذلك، فإن الظروف التي استخدمت خلال عملية التوليف وتقييد لمتواليات قصيرة بدلا تعيق تطبيق هذه المنهجية. من ناحية أخرى، يتم تنشيط triphosphates نوكليوزيد تعديل اللبنات التي استخدمت لإدخال خفيف من العديد من المجموعات الوظيفية في الأحماض النووية، وهي الاستراتيجية التي تمهد الطريق لاستخدام الأحماض النووية التي تم تعديلها في لوحة واسعة النطاق من التطبيقات العملية مثل علامات الوظيفية وجيل من الريبوزيمات وDNAzymes. واحدة من التحديات الرئيسية تكمن في تعقيد منهجية تؤدي إلى العزلة وتوصيف هذه نظائرها نوكليوزيد.

في هذه المقالة الفيديو، نقدم بروتوكول مفصلة لتركيب تساه تعديل نظائرها باستخدام الفوسفور الكواشف (III) مقرا لها. بالإضافة إلى ذلك، ويكشف الإجراء لتوصيف بهم الكيمياء الحيوية، مع التركيز بشكل خاص على التمهيدي ردود الفعل الإرشاد وTDT المخلفات البلمرة. وهذا البروتوكول تفصيلا أن تكون ذات فائدة للصياغة من dNTPs تعديل وزيادة استخدامها في البيولوجيا الكيميائية.

Introduction

triphosphates 5'-نوكليوزيد ((د) من هذه البرامج الوطنية) تمثل فئة من الجزيئات الحيوية الحيوية التي تشارك في عمليات ومهام لا تعد ولا تحصى بدءا من كونه العملة العالمية من الطاقة لالمنظمين في استقلاب الخلية. بالإضافة إلى دورها في هذه التحولات البيولوجية الأساسية، تقدمت نظرائهم تعديل كمنصة تنوعا ومعتدل لإدخال مجموعات وظيفية في أليغنوكليوتيد]، وهي المنهجية التي تكمل بشكل جيد توليف المرحلة الصلبة الآلي التي عادة ما يتم تطبيقها 1،2. في الواقع، يمكن أن تقدم (د) من هذه البرامج الوطنية بمثابة ركائز لRNA والحمض النووي بلمرة 3، وثروة من المجموعات الوظيفية بما في ذلك الأحماض الأمينية 4-13، والأحماض boronic 14،15، 16 nornbornene، مثل بقايا الألماسية-17، جنبا إلى سلاسل ل organocatalysis 18، 19 الأحماض الصفراوية، وحتى أليغنوكليوتيد] 20 يمكن إدخالها أليغنوكليوتيد].

_content "> ما وراء تمثل ناقلات مريحة للfunctionalization من الأحماض النووية، dNTPs تعديل يمكن أن تشارك في سيليكس وأساليب اندماجي الأخرى ذات الصلة في المختبر اختيار لتوليد تعديل الأحماض النووية الحفاز 21-30 والأبتامرات للتطبيقات العملية المختلفة 10، 31-36. ويعتقد أن الجانب سلاسل الإضافية التي يتم تقديمها من قبل البلمرة من dNTPs تعديل لزيادة المساحة الكيميائية التي يمكن استكشافها خلال تجربة الاختيار واستكمال الترسانة وظيفية الفقراء بدلا من الأحماض النووية 37. ومع ذلك، على الرغم من هذه الصفات الجذابة والتقدم المحرز مؤخرا في تطوير كل الاصطناعية والأساليب التحليلية، لا يمكن تطبيقها عالميا والإجراءات ذات العائد المرتفع موجود لصياغة من triphosphates نوكليوزيد تعديل 2،38.

الهدف من هذا البروتوكول هو لتسليط الضوء في (في بعض الأحيان) إجراءات معقدة الرائدة رس توليف وتوصيف البيوكيميائية من هذه اللبنات المنشط (الشكل 1B). وسيتم التركيز بشكل خاص على كل التفاصيل الاصطناعية التي غالبا ما يصعب العثور على أو غائبة في أقسام تجريبية ولكن لا يزال حاسما لإنجاز الناجح لمسار الاصطناعية مما أدى إلى عزلة نقية (د) من هذه البرامج الوطنية (الشكل 1).

Protocol

1. تجميع للنوكليوزيد Triphosphates معدلة

النهج الاصطناعية اختار يتبع الإجراء التي وضعتها لودفيغ واكشتاين لأن هذا الأسلوب هو موثوق بها عموما ويؤدي إلى عدد قليل جدا من المنتجات الجانبية (الشكل 1A) 39.

  1. Coevaporate في مناسبة نوكليوزيد 3'-شنو المحمية (عادة 0.1 ملمول) مرتين مع البيريدين اللامائية (2 مل) ثم الجافة تحت فراغ بين عشية وضحاها. في نفس الوقت، بيروفوسفات الجافة tributylammonium (0.13 ملمول) تحت فراغ بين عشية وضحاها.
  2. حل النوكليوزيدية في الحد الأدنى من البريدين الجافة (0.2 مل) وإضافة ديوكسان الجافة (0.4 مل) بوصفها cosolvent. أخيرا، إضافة 2-كلورو-1 ،3،2-benzodioxaphosphorin-4-واحد (0.11 ملمول) والسماح للرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
    ملاحظة: تجدر الإشارة إلى أن عناية خاصة يجب أن تؤخذ مع 2 كلورو-1 ،3،2-benzodioxaphosphorin-4-كاشف واحد. في الواقع، وحتى تخزين هذا كاشف تحت جو لغاز خاملهنا ليست كافية لمنع التحلل لها. وبالتالي، فإن الصلبة البيضاء التي تتشكل في هذا التحلل يمكن وينبغي كشطت قبل استخدامها.
  3. يعد حل tributylammonium بيروفوسفات في DMF الجافة (0.17 مل) وtributylamine المقطر حديثا (58 ميكرولتر؛ أبدا إضافة المناخل الجزيئية). إضافة الحل الناتج إلى خليط التفاعل (يظهر راسب أبيض ولكن يختفي بسرعة) والسماح للرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
  4. تحضير محلول اليود (0.16 ملمول) في البيريدين (0.98 مل) وH 2 O (20 ميكرولتر)، ويضاف إلى خليط التفاعل من أجل أكسدة Pα (الثالث) المركز. يسمح الحل الظلام مما أدى لاثارة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  5. استخدام محلول مائي 10٪ من ناس 2 O 3 لإرواء الفائض I 2. إزالة المذيب تحت فراغ (يجب أن تبقى درجة حرارة حمام الماء من المبخر الدوار أقل من 30 درجة مئوية). إضافة H 2 O (5 مل) والسماح للميلxture لتصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ليتحلل من ثلاثي الفوسفات شاردة دوري.
  6. في هذه المرحلة، وعادة ما تكون إزالة مجموعات حماية (أي-شنو 3'والمجموعات على السلاسل الجانبية للnucleobase). بالتالي، إضافة NH 4 OH (30٪ في H 2 O، 10 مل) إلى النفط الخام ويحرك المزيج لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة، وإزالة المذيب تحت فراغ.
  7. إضافة 2 مل من H 2 O وانقسم الى 2 الأنابيب. إضافة 12 مل من محلول 2٪ من NaClO 4 في الأسيتون وأجهزة الطرد المركزي (1،000 x ج) لمدة 30 دقيقة. ويتكرر هذا الإجراء مرة أخرى. هذا يسمح لهطول الأمطار في فصل المذيبات والكواشف المستخدمة في تركيب من ثلاثي الفوسفات (والتي سوف يعجل)، وبالتالي تبسيط تلت ذلك تنقية RP-HPLC بشكل كبير.
  8. بعد تجفيف الهواء من بقايا زيتية، تسجيل 31 P-NMR الطيف من النفط الخام (وفقا للإجراءات القياسية، انظر أيضا قائمة من المواد والشكل 3) وتذوب في 4 مل H 2 O.
    ملاحظة: يركز هذا الإجراء الاصطناعية بشكل رئيسي على جيل من triphosphates deoxynucleoside تعديل، ولكن يمكن تطبيق إجراء مماثل جدا للنظراء لهم الحمض النووي الريبي (ببساطة عن طريق استخدام 2 '، 3'مكرر-O-الأسيتيل السلائف).

2. HPLC تنقية للنوكليوزيد Triphosphates معدلة

  1. إعداد 1 M حل الأوراق المالية من بيكربونات triethylammonium (أكياس، وأك): 40
    1. تحضير محلول 1 مول من الترايثلامين (139 مل) في ≈ 600 مل من المقطر وتصفيتها H 2 O.
    2. فقاعة CO 2 (عبر الثلج الجاف والغاز الفوار) في حل تحت التحريك القوي حتى يتم التوصل إلى درجة الحموضة من 7.6 (وهذا سوف يستغرق 10 ساعة على الأقل). يمكن تخزين هذا الحل الأسهم في البراد لمدة شهر واحد.
  2. تنقية:
    1. إعداد حلين العازلة من المخزون 1 M: L 2 من 50 ملي أكياس، وأك في الماء عالى النقاء (شاطف A) والثانية 1 لتر من 50 ملي أكياس، وأك في 50٪ MeCN (شاطف B). ديغا كلا eluents تحت فراغ والتحريك لمدة 20 دقيقة (مطلوب عناية فائقة حتى لا يغير من درجة الحموضة عن طريق إزالة CO 2 أثناء التفريغ).
    2. إعداد العينة التحليلية عن طريق إذابة 10 ميكرولتر من الفوسفات الخام في 300 ميكرولتر H 2 O المقطر ويحقن نظام HPLC مجهزة عمود RP شبه إعدادي (C18) وباستخدام الانحدار تتراوح بين 0-100٪ B في 40 دقيقة (الشكل 4). ضبط برنامج HPLC وفقا لر R من ثلاثي الفوسفات (التي عادة ما تكون ذروة الرئيسي على اللوني) وثنائي الفوسفات (التي لديها أقل قليلا R ر). تنقية خليط الخام باستخدام هذه الشروط وعن طريق إزالة الأجزاء المبكرة التي قد تحتوي على بعض ثنائي فسفات.
    3. الجمع بين جميع الكسور التي تحتوي على المنتج وتجميد الجافة (الذي فضل أن التبخر في المبخر الدوار من أجل تقليل التحلل إلى diphosph غير مرغوب فيهاأكلت). Coevaporate عدة مرات مع الماء عالى النقاء (لإزالة بقايا الترايثلامين من eluents). تقييم نقاء ثلاثي الفوسفات بواسطة الرنين المغناطيسي (H كلا 1 و 31 ف NMR) وMALDI-TOF بتطبيق البروتوكولات القياسية (انظر الشكل 5). غلة النموذجية التي حصلت عليها تطبيق هذا البروتوكول تكمن عادة في حدود 30-70٪، وهذا يتوقف على الركيزة.

3. ردود الفعل ملحق التمهيدي وTDT البلمرة

  1. وضع العلامات 5'-نهاية التمهيدي
    1. مزيج 30 بمول من التمهيدي المناسب (على سبيل المثال P1، قائمة المواد) مع 4 ميكرولتر من 10X عديد النوكليوتيد كيناز (PNK) العازلة، 3 ميكرولتر من γ [32 ف]-ATP، 1 ميكرولتر من PNK، وده 2 O (ل وحجم رد الفعل مجموعه 40 ميكرولتر). احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ثم حرارة تنشيط كيناز (10 دقيقة عند 70 درجة مئوية).
    2. خلال رد فعل التوسيم إعدادعمود G10 Sephadex عن طريق توصيل طرف ماصة 1 مل مع الصوف الزجاجي silanized وملء غيض مع حل G10 (10٪ في DDH 2 O، تعقيمها). تدور باستمرار ويغسل ثلاث مرات مع 500 ميكرولتر DDH 2 O وغسل النهائي واحد مع 50 ميكرولتر ده 2 O. تشغيل خليط التفاعل من خلال G10 (لإزالة التسمية المشعة مجانا).
    3. هلام تنقية (PAGE 20٪) التمهيدي رديولبلد واستعادة بتطبيق سحق ونقع طريقة (أي شطف مع 500 ميكرولتر من محلول مائي يحتوي على 1٪ LiClO 4 و 1 ملم صافي 3 (الرقم الهيدروجيني 8) عند 72 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة). راسب الايثانول وG10 desalt قليل النوكليوتيد مزال.
  2. رد فعل تمديد التمهيدي
    1. يصلب 1 بمول من رديولبلد التمهيدي P1، 10 بمول التمهيدي P1، و 10 بمول من قالب T1 (قائمة المواد) في رد فعل العازلة 10X (التي قدمها المورد من البلمرة لاستخدامها) عن طريق وضع ريوب في (90-95 درجة مئوية) الماء الساخن وعن طريق السماح لتبرد تدريجيا إلى درجة حرارة الغرفة (أكثر من 45 دقيقة).
    2. وضع أنبوب على الجليد وإضافة (بدوره) كوكتيل dNTP (التي تحتوي على كل من تعديل وtriphosphates الطبيعية، و 100 ميكرومتر تركيز النهائي) و 1 U من بوليميريز الحمض النووي (تنفيس (إكسو -)، Klenow، PWO أو 9 ° N م) وكاملة مع الماء (لحجم رد الفعل مجموعه 20 ميكرولتر). يحضن في درجة الحرارة المثلى عمل انزيم (على سبيل المثال 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة عندما تنفيس (إكسو - يتم استخدامه)).
    3. إضافة 20 ميكرولتر من الحل محطة (الفورماميد (70٪)، وحمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA، و 50 ملم)، برموفينول الأزرق (0.1٪)، الزيلين cyanol (0.1٪))، حرارة العينات (95 درجة مئوية، 5 دقائق)، بارد إلى أسفل (0 ° C)، وحل عن طريق تغيير طبيعة بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام. تصور من قبل phosphorimager.
  3. TDT البلمرة
    1. تمييع 7 بمول من الذين تقطعت بهم السبل واحد، غير المسماة التمهيدي P2 (قائمة المواد)، 1 بمول من التمهيدي رديولبلد في 1 ميكرولتر TDT العازلة 10X.
    2. وضع أنبوب على الجليد وإضافة (بدوره) كوكتيل dNTP (في تركيز كاف تضم ما بين 10 و 200 ميكرومتر) والبلمرة TDT (4 U). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. إضافة 10 ميكرولتر من الحل توقف، تسخين العينات (95 درجة مئوية، 5 دقائق)، يبرد (0 ° C)، وحل عن طريق تغيير طبيعة بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام (PAGE 15٪). تصور من قبل phosphorimager.

4. PCR مع التعديل نوكليوزيد Triphosphates

  1. مزيج 8 بمول كل من الأمام وعكس الاشعال مع 0.5 بمول من القالب ليتم تضخيمها. إضافة 10X العازلة رد فعل والكوكتيل dNTP (لتركيز النهائي من 200 ميكرومتر) ووضع أنبوب على الجليد. إضافة 1 U من بوليميريز الحمض النووي وكاملة مع H 2 O للوصول إلى الحجم النهائي من 20 ميكرولتر. نقل الخليط في قارورة PCR وتنفيذ 30 دورات PCR.
  2. تمييع 6 ميكرولتر مع 6 ميكرولتر من 2X العازلة تحميل السكروز وحلها عن طريق الاغاروز 2٪ (ملطخة بروميد إيثيديوم) الكهربائي. تصور من قبل phosphorimager.

النتائج

triphosphates نوكليوزيد تعديل ومغرية الأهداف الاصطناعية لأنها تسمح لإدخال السهل من مجموعة واسعة من المجموعات الوظيفية في الأحماض النووية 41. ومع ذلك، غالبا ما يتم الكشف عن العزلة وتوصيف هذه اللبنات تفعيلها لتكون شاقة. وبالتالي، يعتقد أن النتائج أظهرت هنا لتقديم يد العون لمتابعة الخطوات المختلفة في إطار إجراءات الاصطناعية والبيوكيميائية المذكورة آنفا (الشكل 1B).

على وجه الخصوص، ويبين الشكل 3 نموذجي الخام 31 P-NMR الطيف من dNTP تعديل (في هذه الحالة بالذات، دو حدة حراسة الحدود TP (4) 18، الشكل 2)، حيث يمكن ملاحظة إشارات مميزة من المراكز الفوسفور (أي صدرة ضيقة في -5.02 (P γ)، وهو صدرة في -10.44 (P α)، والثلاثي في -20.55 (P β) جزء في المليون). بالإضافة إلى ذلك، قويلاحظ ignals الناجمة عن ثنائي فسفات (اثنان في الحلل -4.84 -10.63 وجزء في المليون) وأحادي (-0.18 القميص في جزء في المليون) المنتجات الجانبية جنبا إلى جنب مع الفوسفات أعلى (إشارات في -21.02 -23.19 وجزء في المليون) دائما في هذه المرحلة. ويرد أول تحليل RP-HPLC من الخليط الخام في الشكل 4 (لDU حدة حراسة الحدود TP (4)) حيث ذروة الرئيسي (R ر = 30.78 دقيقة) يتوافق مع 5'-ثلاثي الفوسفات، في حين أن ثانوية الرئيسية، و5 'فسفات، يعرض على انخفاض طفيف الوقت الاحتفاظ (R ر = 30.03 دقيقة). أخيرا، وبعد تنقية RP-HPLC دقيق، يحتاج dNTP تعديل تتسم NMR-TOF MALDI و(الشكل 5). كل من 1-H NMR و 31 P-NMR أطياف حاسمة لتقييم نقاء dNTPs تعديل، حيث إن وجود غير مرغوب فيها ثنائي وأحادي الفوسفات يعطي إشارات مميزة.

بعد إنشاء نقاء nucleosالتماثلية بيئة تطوير متكاملة وتقييم تركيز محلول المخزون إما من الكتلة أو بواسطة التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية، وdNTP تعديل يمكن استخدامها في التفاعلات تمديد التمهيدي من أجل تقييم قدرة القبول الركيزة عن طريق بلمرة مختلفة الشكل 6 يوضح نتائج التفاعلات تمديد التمهيدي مع دو ر ف TP (2)، دا النظام المنسق (6) TP، وتيار مستمر فال TP (7) تستخدم إما التعديلات وحيد (الممرات 5-7)، ومجموعات من اثنين dNTPs تعديل (الممرات 8-10)، أو معا جنبا إلى جنب مع dGTP الطبيعية وحيد (حارة 11).

أخيرا، ويبين الشكل 7 ممثل تفاعلات البلمرة TDT بوساطة مع مختلف نظائرها dUTP تعديل. في هذا السياق، دو ج ف TP (1) و du TP FP (3) هي أفضل ركائز للTDT (حارات 1 و 4) منذ الكفاءة المخلفات قابلة للمقارنة أو تتجاوز تلك من dTTP الطبيعية (حارة 6). بدلا من ذلك، دو حدة حراسة الحدود TP (4) (حارة 5) هو الركيزة الفقراء إلى حد ما في هذا السياق منذ polydisperse قليلا أليغنوكليوتيد] الحجم يعد يمكن ملاحظتها.

figure-results-3133
الشكل 1. أ) نهج ودفيغ اكشتاين لتركيب (قاعدة) تعديل triphosphates نوكليوزيد 39. B) تمثيل تخطيطي لجميع الخطوات المطلوبة لتوليف وتوصيف البيوكيميائية من dNTPs تعديل قبل استخدامها في تطبيقات مثل سيليكس. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

"FO: محتوى العرض =" 5IN "FO: SRC =" / files/ftp_upload/51385/51385fig2highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51385/51385fig2.jpg "العرض =" 600px ل"/>
الشكل 2. البنى الكيميائية للtriphosphates نوكليوزيد تعديل: دو ج ف TP (1)، دو ر ف TP (2)، دو FP TP (3)، دو حدة حراسة الحدود TP (4)، دو الإفطار TP (5)، 18 دا النظام المنسق TP ( 6)، وتيار مستمر فال TP (7) 13. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

figure-results-4608
الرقم 3 31 P-NMR الطيف (121 .4 ميغاهيرتز، D 2 O) من خليط التفاعل الخام من دو حدة حراسة الحدود TP (4). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

figure-results-5164
الشكل 4. RP-HPLC الشخصي من النفط الخام دو حدة حراسة الحدود TP (4): 3.5 مل / دقيقة (شاطف A: 0-100٪ شاطف B في 40 دقيقة، ومعدل التدفق 50 ملي أكياس، وأك في H 2 O؛ شاطف B: 50 ملي أكياس، وأك في H 2 O / CH 3 CN (1/1)). اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

/ 51385fig5.jpg "العرض =" 600px ل"/>
الرقم 5. توصيف ثلاثي الفوسفات نوكليوزيد تعديل DU الإفطار TP (5): أ) 31 P-NMR الطيف (121.4 ميغاهيرتز، D 2 O، 128 ​​بالاشعة)؛ 18 B) 1 H-NMR الطيف (300 ميغاهيرتز، D 2 O، 128 ​​بالاشعة ؛) C) MALDI-TOF الطيف اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

figure-results-6434
الرقم 6. صورة هلام ممثل (PAGE 15٪) من ردود الفعل التمهيدي التمديد مع قاعدة تعديل مختلف نظائرها dNTP لين 1: التمهيدي؛ 2 لين: dNTPs الطبيعية دون dUTP؛ حارة 3: dNTPs الطبيعية دون dATP؛ حارة 4: dNTPs الطبيعية دون dCTP؛ حارة 5: دو <م> ر P TP (2)؛ حارة 6: دا النظام المنسق TP (6)؛ لين 7: العاصمة فال TP (7)؛ حارة 8: دا النظام المنسق TP (6) ودو ر ف TP (2)؛ لين 9: دا النظام المنسق TP (6) والعاصمة فال TP (7)؛ لين 10: دو ر ف TP (2) والعاصمة فال TP (7)؛ لين 11: دو ر ف TP (2)، دا النظام المنسق (6) TP، وتيار مستمر فال TP (7)؛ لين 12: dNTPs الطبيعي اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

figure-results-7768 الشكل 7. صورة هلام (PAGE 20٪) من تفاعلات البلمرة TDT مع قاعدة تعديل مختلف نظائرها dUTP لين 1: دو ج ف TP (1)؛ 2 لين: دو ر ف TP (2)؛ حارة 3: DU الإفطار TP (5)؛ حارة 4: DU FP TP (3)؛ حارة 5: دو حدة حراسة الحدود TP (4)؛ 6 حارات: dTTP؛ لين 7: التمهيدي. تركيزات: 10 ميكرومتر، ميكرومتر 25، 50 ميكرومتر، ميكرومتر 75، و 100 ميكرومتر اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

Discussion

إدراج التعديلات في الأحماض النووية هو من مصلحة للعديد من التطبيقات العملية بما في ذلك تطوير العقاقير وكلاء antigene 42،43، ووضع العلامات الجغرافية والوظيفية للأليغنوكليوتيد] 41، والجهود الرامية إلى توسيع الأبجدية الجينية 44-46. عادة يتم إدخال التعديلات الكيميائية والمجموعات الوظيفية في الأحماض النووية من خلال تطبيق البروتوكولات تركيب الحالة الصلبة القياسية والآلي. ومع ذلك، فإن اللبنات phosphoramidite تحتاج إلى أن تكون مرنة لظروف قاسية بدلا تفرضها هذه المنهجية، والتي بدورها تفرض قيود شديدة على طبيعة وظيفة الكيميائية 47. بدلا من ذلك، البلمرة بوساطة الإنزيم من triphosphates نوكليوزيد تعديل يسمح لإدخال مجموعة أوسع من الوظائف، منذ التقييد الوحيد هو أنها بمثابة ركائز للبلمرة 1،2. على الرغم من وجود نقص ملحوظ في جنرالوقد تم تطوير منهجية قابلة للتطبيق erally، الاصطناعية متينة وموثوق بها ومنهجيات تحليلية لتركيب dNTPs تعديل. علاوة على ذلك، نظرا لطبيعتها المتأصلة، triphosphates تعديل حساسة بدلا لظروف مختلفة الخارجية (مثل درجة الحموضة، ودرجة الحرارة)، وبالتالي، بروتوكول مفصلة لتخليق وتوصيف مفيد للغاية.

سير العمل الواردة في هذه الوثيقة تتضمن التركيب الكيميائي للdNTPs تعديل وتنقية RP-HPLC، تحليل NMR، والمقايسات الأنزيمية لتوصيف البيوكيميائية هذه نظائرها نوكليوزيد. الخطوات الأكثر أهمية بالنسبة لتوليفة ناجحة وتوصيف dNTPs تعديل هي تحليل للمنتج الخام (بواسطة NMR)، وتنقية HPLC شامل، وتحليل المواد النقية، واختيار من الحمض النووي المناسب (RNA) البلمرة.

لتركيب وتعديل dNTPs طبقنا الطريقة التي وضعتها لودفيغ وإيكشتاين 39، منذ أقل من المنتجات تتشكل بالمقارنة مع غيرها من الإجراءات، وإن كان ذلك على حساب لأطول قليلا الاصطناعية الطريق. وعلاوة على ذلك، وتنقية RP-HPLC يمثل بالتأكيد خطوة محورية للمسار الاصطناعية بأكمله لأنه سيسمح للفصل diphosphates نوكليوزيد (dNDPs) والتي غالبا ما تمنع بقوة الحمض النووي والحمض النووي الريبي بلمرة 48. بعد تحقيق التوليف وتنقية، نقاء ثلاثي الفوسفات الناتج يحتاج إلى تقييم كل من NMR-TOF MALDI وإلى ضمان عدم وجود ثنائي فسفات المثبط البلمرة موجودا.

مقايسة التأسيس هو مبين في الشكل (6) يؤكد بوضوح مدى فائدة هذا النهج. في الواقع، كل من dNTPs المستخدمة في هذا المثال ممثل تكشف أن تكون ركائز جيدة للبوليميريز الحمض النووي (في هذه الحالة بالذات تنفيس (إكسو -)) منذ يمكن ملاحظة فرق المقابلة لشظايا أصغر أي أسرع قيد التشغيل. بيزايديس، الانزيم تتسامح مع اثنين من ركائز مزينة مخلفات الأحماض الكربوكسيلية (دو ر ف TP (3) وتيار مستمر فال TP (7)) والبلمرة كل النتائج dNTPs في نيوكليوتيدات دقيقة تحمل ما لا يقل عن 39 الشحنات السالبة إضافية. الملامح البارزة آخر هو أن العصابات الناتجة عن دمج dNTPs تعديل في كثير من الأحيان عرض التنقلات الكهربي أبطأ من الضوابط الطبيعية (قارن على سبيل المثال الممرات 11 و 12). وبالتالي، ردود فعل تمديد التمهيدي تمثل وسيلة قوية وبسيطة للتقييم قبول ركيزة من dNTPs تعديل.

علاوة على ذلك، البلمرة TDT بوساطة من triphosphates على 3'-تيرميني من أليغنوكليوتيد] الذين تقطعت بهم السبل واحد هو استراتيجية مغرية لتوليد الأحماض النووية بين functionalized غاية 49-52. المثال ممثل هو مبين في الشكل 7 يدل بوضوح على إجراءات selectinز وظائف التي يتم التسامح مع من الرئيسين 2 + التي تعتمد على TDT 53. في الواقع، دو ج ف TP (1) و du TP FP (3)، والتي هي مجهزة proteinogenic الأحماض الأمينية L-البرولين وثنائي الببتيد α-الفنيل ألانين برو، على التوالي، هي أفضل ركائز للTDT وأدت إلى المخلفات الكفاءة التي تضاهي لسيطرة dTTP معدلة، حتى بتركيزات منخفضة تصل إلى 10 ميكرومتر (حارات 1 و 4). من المستغرب، دو ر ف TP التماثلية (2) حيث يتم توصيل بقايا البرولين إلى الذراع رابط في غير المشبعة مقارنة مع حمض الكربوكسيلية الحرة، ليست جيدة باعتبارها الركيزة مثل نظيرتها رابطة الدول المستقلة منذ أليغنوكليوتيد polydisperse الحجم أطول ويلاحظ فقط في أعلى تركيزات dNTP (> 100 ميكرومتر، 2 لين). وعلاوة على ذلك، فإن المعدلة السلفوناميد dNTP 5 هو الركيزة معتدلة لTDT وقابلة للمقارنة لDU ر P TP (2) (حارة 3). بالإضافة إلى ذلك، دو حدة حراسة الحدود TP (4)، والذي يحمل فكرة قوية الهيدروجين السندات التبرع، هو الركيزة الفقراء بدلا عن TDT ويبدو أن رد فعل البلمرة أن يكون غير مبال لتركيز dNTP تعديل. وبالتالي، يمكن أن يفسر الترتيب التالي القبول الركيزة من الشكل 7: دو ج ف TP (1)، دو FP TP (3)> دو ر ف TP (2)، دو الإفطار TP (5)> DU حدة حراسة الحدود TP (4 ).

وأخيرا، فإن الإجراء الموضح لتفاعلات البلمرة تحت ظروف PCR باستخدام نظائرها تعديل مشابه إلى حد ما أن تنطوي dNTPs الطبيعية. ومع ذلك، فإن توافق مع dNTPs تعديل بلمرة في ظل هذه الظروف هو من الأهمية بمكان لتوليد عالية الكثافة functionaliالأحماض النووية زد 7، وخاصة فيما يتعلق استخدامها في التجارب في المختبر الاختيار.

باختصار، تم التشديد على طريقة لتوليف وتوصيف triphosphates نوكليوزيد تعديل وسوف إنشاء مثل هذا البروتوكول يساعد بالتأكيد في تطوير وصياغة الرواية من نظائرها. وفي نفس الوقت، فإن ظهور مثل هذه الرواية dNTPs تسهيل توليد أليغنوكليوتيد بين functionalized؛ بشكل خاص، الأحماض النووية الحفاز.

Disclosures

أعلن عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (المنح رقم PZ00P2_126430 / 1 وPZ00P2_144595). ومن المسلم البروفيسور جيم Leumann بامتنان لتوفير مساحة ومعدات المختبرات، فضلا عن دعمه المستمر. ومن المسلم به السيدة سو KNECHT لإجراء مناقشات مثمرة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Tributylammonium pyrophosphate Sigma AldrichP8533Hygroscopic solid, keep under Ar
2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one Sigma Aldrich324124Moisture sensitive
PyridineSigma Aldrich82704Under molecular sieves
DioxaneSigma Aldrich296309Under molecular sieves
Dimethylformamide (DMF)Sigma Aldrich40248Under molecular sieves
Acetonitrile Fisher ScientificHPLC grade
TriethylamineSigma Aldrich90342
TributylamineSigma Aldrich90781
ddH2OMilli-Qdeionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)
Diethylpyrocarbonate (DEPC)Sigma Aldrich159220
D2OCambridge Isotope Laboratories, Inc.DLM-4-25
γ-[32P]-ATPHartmann AnalyticsFP-301
Natural dNTPsPromegaU1420
Vent (exo-) DNA polymeraseNEBM0257S
DNA polymerase I, Large (Klenow) FragmentNEBMO210S
9°Nm DNA polymeraseNEBMO260S
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT)PromegaM828A
Pwo DNA polymerasePeqlab01 01 5010
T4 PNKThermo ScientificEK0032
Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%)Serva10679.01
AgaroseApollo ScientificBIA1177
G10 SephadexSigmaG10120
UreaApollo ScientificBIU4110
Jupiter semipreparative RP-HPLC column (5μ C18 300 Å)Phenomenex
Gene Q Thermal CyclerBioconceptBYQ6042E
PCR vialsBioconcept3220-00
HPLC systemAmersham Pharmacia BiotechÄkta basic 10/100
All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE
5'-CAAGGACAAAATAC
CTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGA
CATCGCCTCTGGGCTA
ATAGGACTACTTCTAAT
CTGTAAGAGCAGATCC
CTGGACAGGCAAGGAA
TACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F

References

  1. Hocek, M., Fojta, M. Cross-coupling reactions of nucleoside triphosphates followed by polymerase incorporation. Construction and applications of base-functionalized nucleic acids. Org. Biomol. Chem. 6, 2233-2241 (2008).
  2. Hollenstein, M. Nucleoside Triphosphates - Building Blocks for the Modification of Nucleic Acids. Molecules. 17, 13569-13591 (2012).
  3. Lauridsen, L. H., Rothnagel, J. A., Veedu, R. N. Enzymatic Recognition of 2'-Modified Ribonucleoside 5'-Triphosphates: Towards the Evolution of Versatile Aptamers. ChemBioChem. 13, 19-25 (2012).
  4. Roychowdhury, A., Illangkoon, H., Hendrickson, C. L., Benner, S. A. 2'-Deoxycytidines Carrying Amino and Thiol Functionality: Synthesis and Incorporation by Vent (Exo-) Polymerase. Org. Lett. 6, 489-492 (2004).
  5. Dewey, T. M., Mundt, A. A., Crouch, G. J., Zyzniewski, M. C., Eaton, B. E. New Uridine Derivatives for Systematic Evolution of RNA Ligands by Exponential Enrichment. J. Am. Chem. Soc. 117, 8474-8475 (1995).
  6. Kuwahara, M., et al. Direct PCR amplification of various modified DNAs having amino acids: Convenient preparation of DNA libraries with high-potential activities for in vitro selection. Bioorg. Med. Chem. 14, 2518-2526 (2006).
  7. Jäger, S., Famulok, M. Generation and Enzymatic Amplification of High-Density Functionalized DNA Double Strands. Angew. Chem. Int. Ed. 43, 3337-3340 (2004).
  8. Thum, O., Jäger, S., Famulok, M. Functionalized DNA: A New Replicable Biopolymer. Angew. Chem. Int. Ed. 40, 3990-3993 (2001).
  9. Jäger, S., et al. A versatile toolbox for variable DNA functionalization at high density. J. Am. Chem. Soc. 127, 15071-15082 (2005).
  10. Vaught, J. D., et al. Expanding the Chemistry of DNA for in Vitro Selection. J. Am. Chem. Soc. 132, 4141-4151 (2010).
  11. Sakthivel, K., Barbas, C. F. Expanding the Potential of DNA for Binding and Catalysis: Highly Functionalized dUTP Derivatives That Are Substrates for Thermostable DNA Polymerases. Angew. Chem. Int. Ed. 37, 2872-2875 (1998).
  12. Raindlová, V., Pohl, R., Hocek, M. Synthesis of Aldehyde-Linked Nucleotides and DNA and Their Bioconjugations with Lysine and Peptides through Reductive Amination. Chem. Eur. J. 18, 4080-4087 (2012).
  13. Hollenstein, M. Deoxynucleoside triphosphates bearing histamine, carboxylic acid, and hydroxyl residues – Synthesis and biochemical characterization. Org. Biomol. Chem. 11, 5162-5172 (2013).
  14. Cheng, Y., et al. Synthesis, and Polymerase-Catalyzed Incorporation of Click-Modified Boronic Acid-TTP Analogues. Chem. Asian J. 6, 2747-2752 (2011).
  15. Lin, N., et al. Design and synthesis of boronic-acid-labeled thymidine triphosphate for incorporation into DNA. Nucleic Acids Res. 35, 1222-1229 (2007).
  16. Schoch, J., Jäschke, A. Synthesis and enzymatic incorporation of norbornenemodified nucleoside triphosphates for Diels–Alder bioconjugation. RSC Adv. 3, 4181-4183 (2013).
  17. Biomol Chem, O. rg 9, 7482-7490 (2011).
  18. Hollenstein, M. Synthesis of deoxynucleoside triphosphates that include proline, urea, or sulfamide groups and their polymerase incorporation into DNA. Chem. Eur. J. 18, 13320-13330 (2012).
  19. Ikonen, S., Macíčková-Cahová, H., Pohl, R., Šanda, M., Hocek, M. Synthesis of nucleoside and nucleotide conjugates of bile acids, and polymerase construction of bile acid-functionalized DNA. Org. Biomol. Chem. 8, 1194-1201 (2010).
  20. Baccaro, A., Steck, A. -L., Marx, A. Barcoded Nucleotides. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 254-257 (2012).
  21. Santoro, S. W., Joyce, G. F., Sakthivel, K., Gramatikova, S., Barbas, C. F. RNA cleavage by a DNA enzyme with extended chemical functionality. J. Am. Chem. Soc. 122, 2433-2439 (2000).
  22. Sidorov, A. V., Grasby, J. A., Williams, D. M. Sequence-specific cleavage of RNA in the absence of divalent metal ions by a DNAzyme incorporating imidazolyl and amino functionalities. Nucleic Acids Res. 32, 1591-1601 (2004).
  23. Perrin, D. M., Garestier, T., Hélène, C. Bridging the gap between proteins and nucleic acids: A metal-independent RNAseA mimic with two protein-like functionalities. J. Am. Chem. Soc. 123, 1556-1563 (2001).
  24. Hollenstein, M., Hipolito, C., Lam, C., Dietrich, D., Perrin, D. M. A highly selective DNAzyme sensor for mercuric ions. Angew. Chem. Int. Ed. 47, 4346-4350 (2008).
  25. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A self-cleaving DNA enzyme modified with amines, guanidines and imidazoles operates independently of divalent metal cations (M2). Nucleic Acids Res. 37, 1638-1649 (2009).
  26. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. A DNAzyme with Three Protein-Like Functional Groups: Enhancing Catalytic Efficiency of M2+-Independent RNA Cleavage. ChemBioChem. 10, 1988-1992 (2009).
  27. Hollenstein, M., Hipolito, C. J., Lam, C. H., Perrin, D. M. Toward the Combinatorial Selection of Chemically Modified DNAzyme RNase A Mimics Active Against all-RNA Substrates. ACS Comb. Sci. 15, 174-182 (2013).
  28. Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Lam, C. H., Perrin, D. M. Protein-inspired modified DNAzymes: dramatic effects of shortening side-chain length of 8-imidazolyl modified deoxyadenosines in selecting RNaseA mimicking DNAzymes. Org. Biomol. Chem. 9, 2266-2273 (2011).
  29. Lam, C. H., Hipolito, C. J., Hollenstein, M., Perrin, D. M. A divalent metal-dependent self-cleaving DNAzyme with a tyrosine side chain. Org. Biomol. Chem. 9, 6949-6954 (2011).
  30. Wiegand, T. W., Janssen, R. C., Eaton, B. E. Selection of RNA amide synthase. Chem. Biol. 4, 675-683 (1997).
  31. Battersby, T. R., et al. Quantitative Analysis of Receptors for Adenosine Nucleotides Obtained via In Vitro Selection from a Library Incorporating a Cationic Nucleotide Analog. J. Am. Chem. Soc. 121, 9781-9789 (1999).
  32. Latham, J. A., Johnson, R., Toole, J. J. The application of a modified nucleotide in aptamer selection: novel thrombin aptamers containing -(1-pentynyl)-2'-deoxyuridine. Nucleic Acids Res. 22, 2817-2822 (1994).
  33. Masud, M. M., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Sialyllactose-binding modified DNA aptamer bearing additional functionality by SELEX. Bioorg. Med. Chem. 12, 1111-1120 (2004).
  34. Shoji, A., Kuwahara, M., Ozaki, H., Sawai, H. Modified DNA aptamer that binds the (R)-Isomer of a thalidomide derivative with high enantioselectivity. J. Am. Chem. Soc. 129, 1456-1464 (2007).
  35. Yu, H., Zhang, S., Chaput, J. C. Darwinian Evolution of an Alternative Genetic System Provides Support for TNA as an RNA Progenitor. Nat. Chem. 4, 183-187 (2012).
  36. Davies, D. R., et al. Unique motifs and hydrophobic interactions shape the binding of modified DNA ligands to protein targets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 109, 19971-19976 (2012).
  37. Kuwahara, M., Sugimoto, N. Molecular Evolution of Functional Nucleic Acids with Chemical Modifications. Molecules. 15, 5423-5444 (2010).
  38. Burgess, K., Cook, D. Syntheses of Nucleoside Triphosphates. Chem. Rev. 100, 2047-2059 (2000).
  39. Ludwig, J., Eckstein, F. Rapid and efficient synthesis of nucleoside 5'-0-(1-thiotriphosphates), 5'-triphosphates and 2',3'-cyclophosphorothioates using 2-chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one. J. Org. Chem. 54, 631-635 (1989).
  40. Williams, D. M., Harris, V. H. Chapter 3. Organophosphorus Reagents: A Practical Approach in Chemistry. Murphy, J. 9, Oxford University Press. 237-275 Forthcoming.
  41. Hocek, M., Fojta, M. Nucleobase modification as redox DNA labelling for electrochemical detection. Chem. Soc. Rev. 40, 5802-5814 (2011).
  42. Kurreck, J. Antisense technologies - Improvement through novel chemical modifications. Eur. J. Biochem. 270, 1628-1644 (2003).
  43. Wilson, C., Keefe, A. D. Building oligonucleotide therapeutics using non-natural chemistries. Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 607-614 (2006).
  44. Krueger, A. T., Kool, E. T. Model systems for understanding DNA base pairing. Curr. Opin. Chem. Biol. 11, 588-594 (2007).
  45. Krueger, A. T., Lu, H., Lee, A. H. F., Kool, E. T. Synthesis and Properties of Size-Expanded DNAs: Toward Designed, Functional Genetic Systems. Acc. Chem. Res. 40, 141-150 (2007).
  46. Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Alternative DNA base-pairs: from efforts to expand the genetic code to potential material applications. Chem. Soc. Rev. 40, 5669-5679 (2011).
  47. Weisbrod, S. H., Marx, A. Novel strategies for the site-specific covalent labelling of nucleic acids. Chem. Commun. 30 (44), 5675-5685 (2008).
  48. Lim, S. E., Copeland, W. C. Differential Incorporation and Removal of Antiviral Deoxynucleotides by Human DNA Polymerase γ. J. Biol. Chem. 276, 23616-26623 (2001).
  49. Cho, Y., Kool, E. T. Enzymatic Synthesis of Fluorescent Oligomers Assembled on a DNA Backbone. ChemBioChem. 7, 669-672 (2006).
  50. Hollenstein, M., Wojciechowski, F., Leumann, C. J. Polymerase incorporation of pyrene-nucleoside triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22, 4428-4430 (2012).
  51. Kuwahara, M., et al. Smart conferring of nuclease resistance to DNA by 3'-end protection using 2',4'-bridged nucleoside-5'-triphosphates. Bioorg. Med. Chem. Lett. 19, 2941-2943 (2009).
  52. Horáková, P., et al. Tail-labelling of DNA probes using modified deoxynucleotide triphosphates and terminal deoxynucleotidyl tranferase. Application in electrochemical DNA hybridization and protein-DNA binding assays. Org. Biomol. Chem. 9, 1366-1371 (2011).
  53. Motea, E. A., Berdis, A. J. Terminal deoxynucleotidyl transferase: The story of a misguided DNA polymerase. Biochim. Biophys. Acta. 1804, 1151-1166 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

86 Bioorganic PCR PAGE HPLC triphosphates

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved