MTTアッセイにより合成と細胞毒性の評価：抗がん金属錯体

空気に敏感チタン及びバナジウム抗癌剤の合成のための方法は、MTTアッセイによるヒト癌細胞株に対するそれらの細胞傷害活性の評価と共に、記載されている。

チタン（IV）とバナジウム（V）錯体は、非常に強力な抗癌剤である。それらの合成における課題は、それらの加水分解不安定性を意味するので、それらの調製は、不活性雰囲気下で行われるべきである。これらの複合体の抗癌活性の評価はMTTアッセイにより達成することができる。

MTTアッセイは、それが生存可能な細胞に曝露されたときにMTTホルマザンに分子の酵素的還元に基づく比色生存率アッセイである。還元の結果は、MTT分子の色変化である。対照と比較して吸光度測定は、化合物の抗癌活性とそのIC ₅₀値に変換される試験した化合物、様々な濃度の彼らの治療後の生癌細胞を残りの割合を決定。 MTTアッセイはその正確性、迅速性、および比較的単純による細胞毒性試験で広く一般的です。

ここに、我々は事前に細胞プレートの調製、細胞と化合物のインキュベーション後、MTTアッセイを用いて生存率を測定し、IC ₅₀値の決定を含む空気に敏感な金属系薬物および細胞生存率の測定、の合成のための詳細なプロトコルを送った。

化学療法は、依然として様々な癌疾患の診療所で採用治療の主なコースの一つであり、研究のこのよう膨大な量の新しい改良抗がん剤の開発を目的とした世界的に行われている。このような研究は、主にin vitroでの細胞毒性の特性の生物学的評価に続いて、化合物の設計と準備して、化学的なレベルで開始します。細胞生存率は、細胞活性^1〜2についての情報を提供する様々なアッセイにより評価することができる。

シスプラチンは、広く精巣および卵巣癌^3-4向けに効率的な治療法と考えられている化学療法薬として使用される白金錯体の一例である。しかしながら、狭い活性範囲および重篤な副作用は、他の強力な遷移金属錯体^5-8の研究を誘発する。中でも、チタン（IV）とバナジウム（V）錯体は、高活性の有望な結果を示し、減少し毒性^9月16日 。 TI（IV）錯体は、これらの特性のために、シスプラチンの後に臨床試験に入ることが最初でしたが、それらは、製剤の困難や加水分解不安定に試験を失敗している。耐水性^15,17-21高い抗癌活性を組み合わせることができるこれらの金属錯体の改善された誘導体を開発するための電流が必要とされている。

チタン（IV）およびV（V）錯体の調製における課題は、前駆体試薬の加水分解不安定性を指し、従って、不活性雰囲気が維持されるべきである。チタン（IV）およびV（V）化合物の調製は、グローブボックス内またはシュレンクライン技術を用いて、N ₂またはAr条件下で行われる。

アッセイ - 抗癌活性を評価するための一つの一般的な方法は、MTT（（4,5 - ジメチルチアゾリ）-2,5 - ジフェニルテトラゾリウムブロミド3）に基づいている。このアッセイは、モスマンによって1983年に発表された比色生存率アッセイである^22。それは非常によく研究され特徴付けられ、そして、その精度、迅速性、および種々の細胞株に適用されるその能力に新たな細胞毒性化合物の有効性を評価する際には非常に効率的と考えられているされている。この生存率アッセイは、それが生細胞に曝露されるMTT分子の色の変化に基づいている。生存細胞の数、および未処理の対照との比較に比例した吸光度の測定は、試験した化合物の細胞増殖阻害能力の評価を可能にする。

MTT比色アッセイは、96ウェルプレート形式²³で行われる。細胞は、試験した薬剤を添加する前に、ウェル中のプレインキュベーションが必要な場合があります。プレインキュベーション時間は細胞株の特性に応じて0〜24時間と異なる場合があります。細胞は、通常、薬物活性に応じて24〜96時間薬物に曝露される。 MTT溶液を、次いで、エール処理した細胞に添加されOW MTTは生細胞（ 図^1）24で動作しているミトコンドリアと細胞質ゾルの酵素の様々な紫色のホルマザンに還元される。 MTT分子は、死細胞又は赤血球（代謝的に不活性な細胞）、脾臓細胞（休止細胞）およびコンカナバリンAで刺激されたリンパ球（活性化細胞^）22によって低減されない。 MTTホルマザン沈殿物とのインキュベーションの3〜4時間後。ホルマザンの形成は、インキュベーションの0.5時間後に開始されますが、最適な結果を得るためには、少なくとも3時間²² MTTに細胞を曝露することをお勧めします。その結果、成長培地を除去し、DMSOでも^26を使用することができるホルマザンは、有機溶媒、好ましくはイソプロパノール²⁵に溶解する。媒体の除去は、増殖培地中に広く一般的であるフェノールレッド、以降正確な結果を達成し、そしてタンパク質は²⁵吸光度測定に干渉する可能性が沈殿のために重要である。ときはフォーマ恐山溶液が均質に達すると、溶液の吸光度をマイクロプレートリーダー分光光度計を用いて測定される。 550nmでの吸光度は、ウェルあたりの細胞200-50,000の範囲で細胞数に直接比例し、したがって、細胞の非常に少量の^22を検出することができる。吸光度は、薬物による治療後に残った生存細胞の量を示し、薬物に曝露されなかった対照細胞の吸光度と比較される。適切なソフトウェアによる結果の分析は、IC _50（阻害濃度を、50％）を提供した値と測定のいくつかの繰り返しに基づいて統計誤差。

MTTアッセイはその正確性や比較的単純による新しい抗がん化合物をスクリーニングするための細胞毒性研究で広く一般的です。酵素反応に依存しているMTTアッセイを用いて、ただし、1は、様々な酵素阻害剤は、AN MTTの還元に影響を与えることができることを考慮しなければならない誤った結果²⁷につながるdは。また、MTTアッセイは、薬物²の細胞傷害活性の分子メカニズムのあらゆる情報を提供しない。

1. V（V）錯体（ 図2）の製造^、18の行為は、グローブボックス内の1.1から1.4を繰り返し、グローブボックスが使用できない場合は、2（2.1から2.6）の手順の代替に進んでください。
   1. リガンドの0.42ミリモルの乾燥THF中のH ₂ Lを溶解し、THF中のVO等量の撹拌溶液（O I _PR）3に追加します。
   2. 15分間室温で反応混合物を撹拌し、そして真空下で揮発物を除去。
   3. 冷ヘキサンを加え、真空下でそれを削除します。濃い紫色の粉末を定量的収率で得られるべきである。
   4. エッペンドルフバイアル中で得られた化合物8mgを秤量する。 3に進みます。
2. シュレンクラインを使用して、V（V）錯体を準備します。
   1. セプタムキャップで乾燥シュレンクフラスコに乾燥THF中の配位子のH ₂ Lを0.42ミリモルを溶かし、シュレンクラインに接続し、真空/不活性ガス（N ₂またはAr）環境を交互に適用され、それが3秒を適用することを推奨しますラウンドをUCHと真空段階で2〜5分間待ってください。
   2. セプタムキャップを通して注射器を経由して乾燥THFを追加します。
   3. 、ラインに適切な乾燥シュレンクフラスコに掛け不活性環境を塗布およびそれにバナジウム溶液からのシリンジを介して試薬を添加することによって同様に調製したTHF溶液にVOの等量（O 私の_Pr）3を追加リガンド。
   4. 15分間室温で反応混合物を撹拌し、真空下で揮発性物質を除去し、不安定な生成物の懸念がある場合には、不活性雰囲気下での揮発物のシュレンク型蒸留を行い、予備乾燥された必要なガラス器具を取り付けるために不活性ガス流を使用。
   5. 冷ヘキサンを加え、真空下でそれを削除します。濃い紫色の粉末を定量的収率で得られるべきである。
   6. エッペンドルフバイアル中で得られた化合物8mgを秤量する。
3. チタン（IV）錯体（ 図2）の調製; ²⁸ 行為はグローブボックス内の3.1〜3.3を繰り返し、グローブボックスが利用できない場合は、代わりにシュレンクラインを採用バナジウムアナログ（ステップ2）のための議論の代替手順を調整します。
   1. 乾燥THF中の配位子のH ₂ Lを0.35ミリモルを溶解し、THF中のTi（O I _PR）4等量の撹拌溶液に追加します。
   2. 2時間室温で反応混合物を撹拌した。定量的収率で黄色の生成物を得、真空下で揮発性物質を除去する。
   3. エッペンドルフバイアル中で得られた化合物8mgを秤量する。
4. HT-29細胞を96ウェルプレートの調製
   1. 1％ペニシリン/ストレプトマイシン抗生物質、1％L-グルタミン、および37℃で10％ウシ胎児血清（FBS）、5％CO ₂を含有するRPMI-1640培地で75cm ^2のフラスコ内の培養HT-29細胞。
   2. HT-29細胞は、（サブカルチャーずに3〜4日ごとに90から100パーセント、）最大コンフルエントに達したときにメディアを削除します。 1ミリリットルで洗浄のトリプシン（0.25％）/ EDTA（0.05％）溶液で、それを削除してください。
   3. 1mlのトリプシン（0.25％）/ EDTA（0.05％）溶液を添加し、5分間インキュベートする。
   4. フラスコから、HT-29細胞を剥離し、トリプシン活性を無効にする培地10mlを加える。チューブに細胞混合物の5ミリリットルを転送します。
   5. カウンタチャンバーに細胞混合物の数滴を転送するためにピペットを使用する。カウンター室は5×5の正方形が含まれています。
   6. コー​​ナーで4広場や中央にある1：顕微鏡を用いて5代表の正方形のセルを数える。
   7. 存在する細胞の見込額を計算します。 5代表正方形のセルを合計し、20で割る。
   8. ステップ4.7の結果によって0.6を割る。受信された番号は、プレート当たりに必要な細胞混合物の量である。この計算は、0.6×10 ⁶細胞（ウェルあたり9,000細胞）を含有するプレートを意味する。
   9. のpごとに必要な細胞混合物の量を転送するためにピペットを使用して後半（セクション4.8で計算される）と、媒体の13.2ミリリットル（66ウエル×ウェルあたり200μL）を追加します。
   10. 11チャンネルピペット（ウェルあたり200μL、6行、計66ウエル）で96ウェルプレートに混合物を添加。各行の1つのウェルは、ブランクコントロールのために空のままにしてください。
   11. 細胞がプレートに付着させ24時間、5％CO _2、37℃でプレートをインキュベートする。
5. 化合物の挿入
   1. ステップ1.4（または2.6）または3.3で説明したように各化合物8 mgまでの乾燥THF（所望の濃度範囲に応じて、異なる量）200μl加え圧迫した。あまりにも、配位子H ₂ L 8mgの秤量する。
   2. 9別のエッペンドルフバイアル中のTHF 60μLを加えることによって、さらに、各化合物溶液を希釈する。
   3. 10の異なる濃度がOになるまで、というように最初のエッペンドルフバイアルに5.1節での混合物からピペットで60μLを移し、再懸濁し、次のバイアルに60μLを転送し、（セクション5.1で親の混合物を含む）btai​​ned。
   4. 培地を180μlのTHF中に各濃度の20μlの希釈する。
   5. 唯一のTHFでコントロール溶液を調製し、各測定中の培地180μlのでTHFを20μL。
   6. すでに濃度範囲ができます（最大200 mg / Lでの化合物の最終濃度を与えるために培地中の細胞の上述の溶液200μlを含む各ウェルに、（THF制御を含む）を得られた溶液から10μLを追加）化合物の活性に応じて変更することができる。
   7. あなたは、化合物の溶解度に応じて適用される最高濃度でい​​くつかの降水量を観測することがあります。
   8. 化合物3倍（同じ化合物のプレートの3行）の各測定を繰り返し、それぞれの行が含まれています：10の異なる濃度での化合物で処理した細胞、ブランクのセルなしでうまく制御のみと1の溶媒で処理1を含むウェルの細胞をコントロール。
   9. 5％CO ₂雰囲気中で37℃で3日間、ロードされたプレートをインキュベートします。
6. MTTアッセイを用いて細胞毒性の測定
   1. フェノールレッドを含まないRPMI-1640培地200ml溶液にMTT粉末1gを添加してMTT溶液を調製する。ストック溶液を15 mlチューブに分け、-20℃で保存することができる
   2. ウェル（ス​​テップ4.10から細胞を含まないブランクの対照ウェルを除き）11チャンネルピペットを用いて、それぞれに、MT​​T溶液20μlを追加し、さらに3時間静置します。
   3. 各ウェルから培地溶液を除去。
   4. ホルマザンを溶解するために、各ウェルにイソプロパノール200μLを加える。均質性に到達するまで0.5時間プレートを攪拌する。
   5. マイクロプレートリーダー分光光度計による上記の溶液200μl、550 nmの吸光度を測定します。
   6. 3別の日に（つまり、3回の繰り返しが含まれ、ステップ5.8を参照）、各測定を繰り返します。
   7. Tを計算するTHF溶媒対照値の吸光度で除した結果を、測定値からブランクコントロールの吸光度値を控除し、100％を掛けることによって、細胞生存率のパーセンテージは、彼。
   8. グラフパッドプリズムソフトウェア（または同等品）を用いてIC ₅₀値を計算します。
   9. 報告されたIC _50は、少なくとも3つの異なる日に収集したすべてのIC ₅₀値の平均であり、誤差値は標準偏差である。

錯体はNMRおよび元素分析によって評価することができる確立された方法^18,28およびそれらの純度に基づいて調製した。

MTTアッセイから受信されたデータは、化合物^18,21の細胞毒性を評価するために分析される。最初に、すべての他の値からブランク対照吸光度値の減算が行われる。阻害化合物は増殖を添加しないように、第2の、THF溶媒対照値を100％生存に設定される。他のすべての値は、制御に応じて実行可能性のパーセンテージに変換されます。濃度が適用され、算出された相対生存率は次いで可変勾配（4変数）モデル（ 図4、表^1）29の非線形回帰に基づいて、IC ₅₀値を決定するために、グラフパッドプリズムソフトウェア（または同等のもの）に挿入される。

測定範囲に対して行われるべきである各台地上の少なくとも3点、3点をスロープ（ 図3、グラフA）を定義するには、次の分岐点の分布を示すグラフを生成します濃度。高濃度または低濃度で不十分測定（ 図3、グラフB）は、IC ₅₀値の決定のために必要な曲線の非線形回帰適合を損ない、その結果、その正確性を減少させるであろう。

非線形回帰により決定される相対的な IC ₅₀値は、測定された最大および最小細胞生存率との間の中間点として計算される被験化合物による可能な細胞増殖阻害の50％をもたらす濃度に相当する^、29に適合（図示必ずしも100％と0％、それぞれ、 図3を参照して、グラフCであり、a）。例えば、化合物が低濃度で対照細胞増殖に対するわずか60％（0％を阻害する場合単数または複数）、その相対IC _50は、対照に対する30％阻害率をもたらす濃度である。エラー値は、性感染症として報告された平均のIC ₅₀値とは異なる繰り返し、得られた結果の偏りを反映する必要があります。また、最大の細胞増殖阻害（％）の値が最小の生存率を測定し、100％から差し引くことによって計算して、報告されるべきである。

別の分析は、 絶対 IC ₅₀値の決定を含んでもよい。これらには関係なく、測定された最大および最小細胞生存率100％の防除50％細胞増殖阻害につながる相対的な濃度に相当する。このような値は、非線形回帰モデルにより導出することができる。これらの値は絶対的であるので、最大細胞増殖の阻害値を報告することは任意である。 図3に示されるように、グラフCは、化合物は最大の細胞gの点で比較的低い活性を有していてもよいrowth阻害特性（曲線a）であり、さらにその絶対的なものよりもなく、100％の成長阻害（曲線b）の近くに到達する化合物よりも低いだけでなく、相対IC ₅₀値を示す。それはどんな種類の報告されたIC ₅₀値と一緒に曲線を提示することは非常に貴重である。

プロトコールに記載された実験の結果（ 図4、表1）を検査する場合は、シスプラチンとの複合体LTi社（O 私の_Pr）2およびVO（O iの Prが）高度に活性であること。明らかであるこれは、所与の化合物の近い最大阻害値は100％に近い相対IC ₅₀値は絶対的なものになることも顕著である。異なる化合物のうち、IC ₅₀値を比較する場合、チタン（IV）錯体が最も高い細胞毒性を有し、そのIC ₅₀値は、シスプラチンおよびV（V）錯体のものよりも低い。しかし、周波数Eリガンドの展示が著しく、活性が低下し、その複合体の場合と異なる濃度でリガンドの添加に続いているため、細胞の生存率は、大幅に低下しない。これは複合体の高い抗癌活性が金属中心に依存していることを保証する。遊離リガンドはかろうじて50％細胞増殖阻害に達したので、絶対IC ₅₀値を正確に導出することができません。実際には、相対値も適切にマイナー活性に起因するソフトウエアによって計算され、高いエラー値に対応することができなかった。それにもかかわらず、相対IC ₅₀値はH ₂ Lに対して導出されていたとしても、それはこのように相対的なIC ₅₀値（および描写と共に最大阻害値のレポートを表示する、かなりの活性を反映していないことは明らかであるカーブの）不可欠。

表1。試験した化合物についての細胞毒性の結果：相対および絶対IC _50（μM）およびV（V）錯体LVO（O iの Pr）などのTi（IVを有する3日間のインキュベーション期間の後にHT-29細胞に対する最大細胞増殖阻害値）錯体LTi社（O 私の_Pr）2、遊離配位子H ₂ Lおよびシスプラチン; ^18,21 IC ₅₀値は、lの平均として与えられる性感染症などのエラー値を持つ東3回3回繰り返し。

図1。ホルマザンへのミトコンドリアおよび細胞質酵素によるMTTの減少。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。

図2のVの調製（V）およびTi（IV）は^18,28の複合体。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。

図4。試験した化合物についての用量依存性細胞傷害曲線：Vの投与濃度にHT-29細胞生存率（V）錯体LVO（O 私のPr）（青）のTi（IV）錯体LTi社（O 私の_Pr）2（依存性赤）、遊離配位子H ₂ L（黒）およびシスプラチン（緑）、三日間のインキュベーション期間後、例えばoエラーによって反映されるように、少なくとも3回3回繰り返しからbtained ^18,21値 。

本稿に記載された方法は、生物学的細胞生存率アッセイによる化学合成を組み合わせる。生存細胞に関する任意の生物学的方法と同様に、層流フード内で作業し、滅菌有機溶媒の使用を含む無菌状態を維持することが重要である。また、加水分解に不安定な金属系薬物の製造及び貯蔵は、グローブボックス又はシュレンクライン技術が利用されるべき、不活性条件下で行われるべきである。

不活性環境下で動作するための技術の選択は、グローブボックスの可用性に主に依存している。利用可能な場合、室温条件を必要とするすべての合成は、その中に実行することは非常に便利である。加熱を必要とする合成は、通常のシュレンクフラスコに、箱から取り出され、シュレンクラインに取り付けられている。グローブボックスが利用できない場合には、すべての操作はSchleに厳選されたガラス製品を用いて実施することができるnkのライン、乾燥雰囲気を維持する真空/不活性ガス（N ₂またはAr）の操作を使用している。

細胞傷害性評価プロセスでは、実験を通して細胞の出現を検討する必要がある。実験の開始前に、健康な接着細胞の増殖培地は明らかであろう。汚染された文化が濁って表示されます。また、トリプシン-EDTAで細胞をインキュベートした後、細胞をフラスコから剥離べきであり、培地中に浸す。ほとんどの細胞をフラスコに付着している場合は、フラスコをさらに数分間インキュベートする必要があります。

1このような測定の長さは5日間です。接着細胞がアポトーシスに進むために、細胞を可能にするために試験薬剤と細胞のインキュベーションのために添付し、セルプレートに順応し、3日間のために我々は1日に可能にします。追加の一日は、MTTとのインキュベーションのために必要である。この全体のmeasureme測定値は独立であるために、異なる細胞培養物から出発して、異なる日に少なくとも2回以上繰り返されるべきヌクレオチド。

本明細書に記載される技術は、接着細胞タイプに適用される。非付着性の細胞型にこの方法を適用するためにいくつかの調整がなされるべきである。これは、もはや、細胞が付着し、セルプレートに順応するため一日専用に必要とされないので、プレートの調製および試験薬剤のサプリメントは、同じ日に達成することができる。また、測定の最後の工程で、ちょうどMTTによる細胞のインキュベーション後に、溶液を媒体とイソプロパノールの添加を除去する前に遠心分離されるべきである。

それは、細胞成長阻害のための代替アッセイで生体細胞のマーカーとしてのMTTの使用を置き換えることも可能であり、ここでマーカーを有する細胞のインキュベーション時間がtより短いMTT ³⁰帽子。マーカーを選択する際に考慮すべきもう一つの要因は、試験薬²⁷の作用の可能なメカニズムである。 MTTアッセイは、ミトコンドリアの代謝活性に関する情報を提供し、それは酵素反応に依存しているので、酵素阻害剤によって影響され得る。

MTTアッセイを介して、その細胞毒性の評価の薬剤調製物の組み合わせは、新たな金属ベースの細胞毒性薬の開発のための有効な方法を表す。それにもかかわらず、この方法は、細胞死の機構は、薬物およびその可能な生物学的標的によって影響される細胞周期の位相に関する情報を提供しない。これらの目的のために、例えばヨウ化プロピジウム（PI）取り込みアッセイおよび細胞周期分析のような追加の方法は^、31を実施すべきである。

著者は、彼らが競合する金融利害関係はありません宣言します。

資金は、欧州共同体のセブンス枠組み計画（FP7/2007-2013）/ ERCグラント契約がない[239603]の下で、欧州研究評議会から受け取った