Antitumorali metallo Complessi: Sintesi e citotossicità valutazione da parte del saggio MTT

Un metodo per la sintesi di titanio e vanadio agenti antitumorali-vie sensitive è descritto, insieme con la valutazione della loro attività citotossica verso la linea di cellule di cancro umano dal saggio MTT.

Titanio (IV) e vanadio (V) complessi sono agenti antitumorali molto potenti. Una sfida nella loro sintesi si riferisce alla loro instabilità idrolitica; quindi la loro preparazione deve essere condotta in atmosfera inerte. Valutazione dell'attività antitumorale di questi complessi può essere ottenuto mediante il saggio MTT.

Il saggio MTT è un saggio colorimetrico basato sulla redditività riduzione enzimatica della molecola MTT a formazano quando è esposto a cellule vitali. Il risultato della riduzione è un cambiamento di colore della molecola MTT. Misure di assorbanza relativi a un controllo determinano la percentuale rimanente cellule tumorali vitali dopo il loro trattamento con diverse concentrazioni di un composto in esame, che si traduce per l'attività antitumorale componenti ei valori di IC _50. Il saggio MTT è molto comune negli studi di citotossicità grazie alla sua precisione, rapidità e relativa semplicità.

Qui abbiamo preinviato un protocollo dettagliato per la sintesi di farmaci a base di metallo sensibile dell'aria e la misurazione della vitalità cellulare, compresa la preparazione delle piastre delle celle, incubazione dei composti con le cellule, misure di vitalità usando il saggio MTT, e determinazione dei valori di IC _50.

La chemioterapia è ancora uno dei principali cicli di trattamenti impiegati in clinica per varie malattie tumorali, e quindi grande quantità di ricerca è condotta in tutto il mondo con l'obiettivo di sviluppare nuovi e migliori farmaci antitumorali. Tali studi principalmente iniziano a livello chimico, con la progettazione e la preparazione di composti, seguita da valutazione biologica delle proprietà citotossiche in vitro. La vitalità cellulare può essere valutata da vari saggi che forniscono informazioni sulle attività cellulare ^1-2.

Cisplatino è un esempio di un complesso di platino che è ampiamente utilizzato come farmaco chemioterapico, che è considerato un trattamento efficace soprattutto per testicolari e ovarico ^3-4. Tuttavia, la sua ristretta gamma di attività e di gravi effetti collaterali innescare studi di altri complessi di metalli di transizione potente ^5-8. Tra gli altri, titanio (IV) e vanadio (V) complessi hanno mostrato risultati promettenti alta attività e ridottiTossicità ^9-16. Ti (IV) complessi sono stati i primi ad entrare in studi clinici, dopo cisplatino causa di queste proprietà, tuttavia, hanno fallito le prove a causa delle difficoltà di formulazione e di instabilità idrolitica. Vi è quindi l'esigenza attuale lo sviluppo di nuove derivati ​​di questi complessi metallici che possono combinare elevata attività antitumorale con resistenza all'acqua ^15,17-21.

Una sfida nella preparazione di Ti (IV) e V (V) complessi riferisce alla instabilità idrolitica dei reagenti precursori, pertanto, atmosfera inerte deve essere mantenuta. La preparazione di Ti (IV) e V (V) composti è condotta sotto N ₂ o Ar condizioni in una scatola portaoggetti o utilizzando tecniche di linea Schlenk.

Un metodo comune per valutare l'attività anti-cancro è basato sul MTT (3 - (4,5-dimethylthiazolyl) -2,5-diphenyltetrazolium bromuro) saggio. Questo saggio è un saggio colorimetrico vitalità che è stato presentato nel 1983 da Mosmann^22. È estremamente ben studiato e caratterizzato, ed è considerato molto efficace quando si valuta l'efficacia di nuovi composti citotossici per la sua precisione, rapidità, ed la sua capacità di essere applicato su varie linee cellulari. Questo saggio redditività si basa sul cambiamento di colore della molecola MTT quando è esposto a cellule vitali. Misurazione dell'assorbanza, che è proporzionale al numero di cellule vitali, e rispetto a controlli non trattati, ha la valutazione delle capacità di inibizione della crescita cellulare del composto testato.

Il saggio colorimetrico MTT è condotto in un formato di piastra da 96 pozzetti ^23. Le cellule possono richiedere preincubazione nei pozzetti prima dell'aggiunta del farmaco testato. I tempi di preincubazione possono variare 0-24 ore secondo le proprietà della linea cellulare. Cellule sono solitamente esposte al farmaco per 24-96 ore a seconda dell'attività farmaco. Soluzione di MTT è quindi aggiunta alle cellule trattate, dove il urlanoow MTT è ridotto a formazano viola da una varietà di enzimi mitocondriali e citosolici che sono operativi in cellule vitali (Figura 1) ^24. La molecola MTT non è diminuito di cellule morte o globuli rossi (cellule metabolicamente inattivi), cellule della milza (cellule di riposo) e di linfociti A-stimolata concanavalina (cellule attivate) ^22. Dopo 3-4 ore di incubazione con MTT precipitati formazano. La formazione del formazano inizia dopo 0,5 ore di incubazione, ma per ottenere risultati ottimali è meglio esporre le cellule ad MTT per almeno 3 ore ^22. Di conseguenza, il terreno di coltura viene rimosso e il formazano viene disciolta in un solvente organico, preferibilmente isopropanolo ^25, sebbene DMSO può anche essere utilizzato ^26. L'eliminazione del mezzo è fondamentale per ottenere risultati accurati da rosso fenolo, che è molto comune nel terreno di coltura, e precipitando proteine ​​possono interferire con la misurazione dell'assorbanza ^25. Quando la formasoluzione zan raggiunge omogenea, l'assorbanza della soluzione viene misurata utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre. L'assorbanza a 550 nm è direttamente proporzionale al numero di celle in serie di 200-50,000 cellule per pozzetto, e quindi molto piccole quantità di cellule può essere rilevata ^22. L'assorbanza indica la quantità di cellule vitali residuo dopo il trattamento con il farmaco, e viene confrontato con l'assorbanza di cellule di controllo che non sono stati esposti al farmaco. Analisi dei risultati per il software corretto prevede l'(concentrazione di inibizione; 50%) IC ₅₀ valori ei loro errori statistici basati su diverse ripetizioni della misura.

Il saggio MTT è molto comune negli studi di citotossicità per lo screening di nuovi composti antitumorali, grazie alla sua precisione e la relativa semplicità. Tuttavia, quando si utilizza il saggio MTT, che è dipesa reazione enzimatica, si deve considerare che i vari inibitori enzimatici possono influenzare la riduzione di un MTTd portare a falsi risultati ^27. Inoltre, il saggio MTT non fornisce alcuna informazione sul meccanismo molecolare dell'attività citotossica del farmaco ^2.

1. Preparazione del V (V) complesso (Figura 2); ¹⁸ condotta passaggi 1.1-1.4 in un glove-box, se un glove-box non è disponibile, passare alla alternativa passaggi 2 (2.1-2.6).
   1. Sciogliere 0,42 mmol dei leganti H ₂ L in THF anidro e aggiungerlo a una soluzione sotto agitazione di quantità equivalenti di VO (O i Pr) ₃ in THF.
   2. Mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per 15 min, e rimuovere le sostanze volatili sotto vuoto.
   3. Aggiungere esano freddo e rimuoverlo sotto vuoto. Una polvere viola scuro deve essere ottenuta con una resa quantitativa.
   4. Pesare 8 mg del composto ottenuto in una fiala Eppendorf. Passare al punto 3.
2. Preparare il complesso V (V) usando una linea Schlenk.
   1. Sciogliere 0,42 mmol del legante H ₂ L in THF anidro in un pallone Schlenk secco con un coperchio a diaframma, subordinare una linea Schlenk e diffusa alternata vuoto / gas inerte (N ₂ o Ar) ambienti, si raccomanda di applicare tre sale turni e aspettare 2-5 minuti sulle fasi di vuoto.
   2. Aggiungere THF anidro tramite siringa attraverso il coperchio a diaframma.
   3. Aggiungere quantità equivalenti di VO (O i Pr) ₃ in una soluzione di THF, che era stato preparato in modo simile agganciando un pallone Schlenk secco propria della linea, applicando un ambiente inerte e aggiungendo i reagenti attraverso una siringa dalla soluzione vanadio a quella di il ligando.
   4. Mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per 15 minuti e rimuovere le sostanze volatili sotto vuoto, se c'è una preoccupazione di prodotti instabili, effettuare tipo Schlenk distillazione di sostanze volatili in atmosfera inerte; utilizzare il flusso di gas inerte per fissare la vetreria necessaria che era stato Pre-essiccata .
   5. Aggiungere esano freddo e rimuoverlo sotto vuoto. Una polvere viola scuro deve essere ottenuta con una resa quantitativa.
   6. Pesare 8 mg del composto ottenuto in una fiala Eppendorf.
3. Preparazione del Ti (IV) complesso (Figura 2); ²⁸ condotta passaggi 3.1-3.3 in un glove-box, se un glove-box non è disponibile, regolare le fasi alternative discusse per l'analogo vanadio (passaggio 2) che impiegano una linea Schlenk invece.
   1. Sciogliere 0,35 mmol del legante H ₂ L in THF anidro e aggiungerlo a una soluzione sotto agitazione di quantità equivalenti di Ti (O i Pr) ₄ in THF.
   2. Mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per 2 ore. Rimuovere le sostanze volatili sotto vuoto per dare un prodotto giallo in una resa quantitativa.
   3. Pesare 8 mg del composto ottenuto in Eppendorf flaconcino.
4. Preparazione di HT-29 cellule piastra a 96 pozzetti
   1. Culture HT-29 cellule in un pallone 75 centimetri ² con mezzo RPMI-1640 contenente 1% di penicillina / streptomicina antibiotici, 1% di L-glutammina e 10% siero bovino fetale (FBS), a 37 ° C con 5% di CO ₂ .
   2. Rimuovere il mezzo quando il HT-29 cellule raggiungono la confluenza massima (90-100%, ogni 3-4 giorni senza sottocultura). Lavare con 1 mlsoluzione di tripsina (0,25%) / EDTA (0,05%) e rimuoverlo.
   3. Aggiungere 1 ml di tripsina (0,25%) in soluzione / EDTA (0,05%) e incubare per 5 min.
   4. Staccare le HT-29 cellule dal pallone e aggiungere 10 ml del mezzo per disabilitare l'attività tripsina. Trasferire 5 ml della miscela cellule in una provetta.
   5. Usare la pipetta per trasferire alcune gocce della miscela cellule nella camera del contatore. La camera di contatore include 5 x 5 caselle.
   6. Contare le cellule in 5 quadrati rappresentativi utilizzando un microscopio: i 4 quadrati negli angoli e quello che è nel mezzo.
   7. Calcolare la quantità stimata di cellule presenti. Sommare le celle nelle 5 piazze rappresentative e dividere per 20.
   8. Dividere 0.6 dal risultato del punto 4.7. Il numero ricevuto è la quantità di miscela di cellule necessario per piastra. Questo calcolo si riferisce ad una piastra contenente 0,6 x 10 ⁶ cellule (9.000 cellule per pozzetto).
   9. Usare la pipetta per trasferire la quantità di miscela di cellule necessarie per pin ritardo (come calcolato nel paragrafo 4.8) e aggiungere 13,2 ml di terreno (200 microlitri per pozzetto × 66 pozzetti).
   10. Aggiungere la miscela di piastra a 96 pozzetti con una pipetta 11 canali (200 microlitri per pozzetto, 6 linee, 66 pozzetti in totale). Un bene di ogni riga dovrebbe rimanere vuoto per il controllo del vuoto.
   11. Incubare la piastra a 37 ° C con 5% di CO ₂ per 24 ore per permettere alle cellule di attaccarsi alla piastra.
5. Inserimento dei composti
   1. Aggiungere 200 microlitri (o quantità differente a seconda del campo di concentrazione desiderata) di THF anidro a 8 mg di ciascun composto pesato come descritto al punto 1.4 (o 2.6) o 3.3. Pesare 8 mg del legante H ₂ L, anche.
   2. Diluire ogni soluzione mescola ulteriormente con l'aggiunta di 60 ml di THF in 9 diverse fiale Eppendorf.
   3. Con una pipetta 60 microlitri della miscela nel paragrafo 5.1 al primo flaconcino Eppendorf, risospendere e trasferire 60 microlitri all'altra fiala, e così via fino a 10 differenti concentrazioni sono obtained (compresa la miscela madre nel paragrafo 5.1).
   4. Diluire 20 ml di ciascuna concentrazione in THF con 180 ml di mezzo.
   5. Preparare una soluzione di controllo con un solo THF, 20 ml di THF con 180 ml di mezzo in ogni misurazione.
   6. Aggiungere 10 microlitri della soluzione risultante (compreso il controllo THF), a ciascun pozzetto contenente già 200 microlitri della soluzione citata delle cellule nel mezzo di ottenere concentrazioni finali del composto di fino a 200 mg / L (intervallo di concentrazione può essere modificato secondo l'attività composto).
   7. Si può osservare una certa precipitazione alla concentrazione massima applicata a seconda della solubilità composto.
   8. Ripetere ogni misurazione dei composti 3x (3 linee nella piastra dello stesso composto); ciascuna riga contiene: cellule trattate con il composto in 10 differenti concentrazioni, 1 pozzetto contenente cellule trattate con solvente solo per 1 pozzetto senza cellule per vuoto controllo.
   9. Incubare la piastra caricata per 3 giorni a 37 ° C in 5% CO ₂ nell'atmosfera.
6. Misurazione citotossicità usando il saggio MTT
   1. Preparare la soluzione MTT aggiungendo 1 g di polvere MTT ad una soluzione di mezzo RPMI-1640 200 ml senza rosso fenolo. La soluzione madre può essere diviso per provette da 15 ml e conservato a -20 ° C.
   2. Aggiungere 20 ml di soluzione di MTT ad ogni pozzetto con una pipetta 11 canali (tranne che per i pozzetti di controllo in bianco, senza le cellule dal punto 4.10), e incubare la piastra per ulteriori 3 ore.
   3. Rimuovere la soluzione intermedia, da ogni pozzetto.
   4. Aggiungere 200 ml di isopropanolo a ciascun pozzetto per sciogliere formazano. Mescolare la piastra per 0,5 ore fino a raggiungere omogeneità.
   5. Misurare l'assorbanza a 550 nm per 200 microlitri della soluzione citata da uno spettrofotometro per micropiastre.
   6. Ripetere ogni misurazione (che include 3 ripetizioni, vedere il punto 5.8) per 3 giorni diversi.
   7. Calcola tegli percentuale di vitalità cellulare detraendo il valore di assorbanza del bianco di controllo dal valore misurato, dividendo il risultato per l'assorbanza del valore di controllo solvente THF e moltiplicando per 100%.
   8. Calcola IC ₅₀ valori utilizzando il software GraphPad Prism (o equivalente).
   9. La IC ₅₀ è riportata la media di tutti i valori di IC ₅₀ raccolti su almeno tre diversi giorni, e il valore di errore è la deviazione standard.

I complessi sono stati preparati sulla base delle procedure stabilite ^18,28 e la loro purezza può essere valutata mediante analisi NMR ed elementare.

I dati ricevuti dal saggio MTT viene analizzata per valutare la citotossicità del composto ^18,21. In primo luogo, viene eseguita la sottrazione del valore di assorbanza del bianco di controllo da tutti gli altri valori. In secondo luogo, il valore del controllo del solvente THF è impostato su 100% vitalità, come è stato aggiunto alcuna crescita inibendo composto. Tutti gli altri valori vengono trasformati in percentuale di vitalità secondo il controllo. Le concentrazioni applicate e il tasso di vitalità relativo calcolato vengono poi inseriti nel software GraphPad Prism (o equivalente) per determinare i valori di IC ₅₀ basato su una regressione non lineare di una pendenza variabile (quattro parametri) modello (Figura 4, Tabella 1) ^29.

Le misurazioni devono essere effettuate su una gammadi concentrazioni che produrranno un grafico visualizzando una distribuzione uniforme punto: almeno tre punti di ciascun plateau e tre punti per definire la pendenza (Figura 3, grafico A). Misure insufficienti ad alte concentrazioni o basse concentrazioni (Figura 3, grafico B) compromettono la vestibilità regressione non lineare della curva necessaria per la determinazione dei valori di IC _50, e di conseguenza, diminuire la loro accuratezza.

Relativi valori di IC _50, come determinata dalla regressione lineare misura ^29, corrispondono alle concentrazioni conducono al 50% di inibizione della crescita cellulare possibile dal composto in esame, che viene calcolato come il punto intermedio tra i valori massimo e minimo misurato vitalità cellulare (non necessariamente 100% e 0%, rispettivamente, vedi figura 3, grafico C, a). Per esempio, se un composto inibisce solo il 60% della crescita cellulare rispetto al controllo (e 0% a bassa concentraziones), la sua relativa _IC50 è la concentrazione che porta al 30% di inibizione rispetto al controllo. I valori di errore dovrebbero riflettere la deviazione dei risultati ottenuti per ripetizioni differenti dalla media _IC50 valore riportato, considerate le MST. Inoltre, i valori massima inibizione della crescita cellulare (%) devono essere riportati, come calcolato sottraendo dal 100% la redditività minima misurata.

Un'analisi alternativa può comprendere la determinazione di assoluto IC ₅₀ valori. Queste corrispondono alle concentrazioni conducono al 50% di inibizione della crescita cellulare rispetto al controllo al 100%, indipendentemente dalla vitalità cellulare massima e minima misurata. Tali valori possono anche essere derivati ​​da un modello di regressione non lineare. Poiché questi valori sono assoluti, riportando i valori di inibizione della crescita cellulare massimali è facoltativo. Come illustrato nella Figura 3, il grafico C, un composto può avere un'attività relativamente bassa in termini di massima cella gproprietà di inibizione rescita (curva A) e comunque mostrare una relativa _IC50 valore che è inferiore non solo rispetto al suo assoluto, ma anche quello di un composto che ha quasi raggiunto il 100% di inibizione della crescita (curva b). È quindi estremamente importante per presentare la curva insieme ai riportati valori di IC ₅₀ di qualsiasi tipo.

Ispezionando i risultati degli esperimenti descritti nel protocollo (Figura 4, Tabella 1), è chiaro che cisplatino e complessi LTi (O i Pr) ₂ e VO (O i Pr) sono altamente attivi. E 'anche evidente che quanto più il valore di inibizione massima di un dato composto è al 100%, più il relativo valore IC ₅₀ è a quello assoluto. Quando si confrontano i valori di IC ₅₀ tra i diversi composti, la (IV) Ti complesso ha la più alta citotossicità e suoi valori di IC ₅₀ sono inferiori a quelle del cisplatino e del V (V) complesso. Tuttavia, la free mostre ligando marcatamente ridotta attività, dal momento che dopo l'aggiunta del legante a diverse concentrazioni, la vitalità cellulare non diminuisce in modo significativo come fa per i suoi complessi. Questo assicura che l'alta attività antitumorale dei complessi si basa sui centri metallici. Dal momento che il ligando libero raggiunge a malapena il 50% di inibizione della crescita cellulare, un assoluto _IC50 valore non può essere ricavata con precisione. Infatti, un valore relativo anche non poteva essere adeguatamente calcolata dal software dovuti all'attività minore e corrispondenti valori di errore elevato. Tuttavia, è chiaro che anche se un parente _IC50 valore potrebbe essere derivato per H ₂ L, non sarebbe riflessa un'attività apprezzabile, rendendo il rapporto del valore di inibizione massima con relativi valori di IC ₅₀ (e la rappresentazione della curva) essenziale.

Tabella 1. Risultati di citotossicità per i composti testati: relativo e assoluto IC ₅₀ (micron) e valori massimi di inibizione della crescita cellulare verso HT-29 cellule a seguito di un periodo di incubazione di tre giorni con la V (V) LVO complesso (O i Pr), Ti (IV ) complesso LTi (O i Pr) _2, il legante libero H ₂ L e cisplatino; ^18,21 IC ₅₀ valori sono espressi come media di l est tre volte tre ripetizioni con valori di errore come le malattie sessualmente trasmissibili.

Figura 1. La riduzione del MTT da parte degli enzimi mitocondriali e citosolici di formazan. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. Preparazione di V (V) e Ti (IV) Complessi ^18,28. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 4. Curve dose-dipendente citotossicità dei composti testati: dipendenza delle HT-29 vitalità cellulare sulla concentrazione somministrata della V (V) LVO complesso (O i Pr) (blu), il Ti (IV) complesso LTi (O i Pr) ₂ ( rosso), ligando libero H ₂ L (nero) e cisplatino (verde), dopo un periodo di incubazione di tre giorni, come Obtained da almeno tre volte tre ripetizioni come riflesso dall'errore valori ^18,21.

Il metodo descritto in questo manoscritto unisce la sintesi chimica con saggio biologico vitalità cellulare. Come con tutti i metodi biologici relativi cellule vitali, è fondamentale per lavorare in una cappa laminare, e mantenere condizioni di sterilità, compreso l'uso di solventi organici sterili. Inoltre, la preparazione e lo stoccaggio di farmaci a base di metallo idroliticamente instabile devono essere effettuate in condizioni inerti, per i quali dovrebbero essere utilizzati tecniche vano portaoggetti o di linea Schlenk.

La scelta della tecnica di lavorare in ambiente inerte dipende principalmente dalla disponibilità di un glove-box. Se disponibile, tutti sintesi che richiedono condizioni di temperatura ambiente sono estremamente conveniente effettuare ivi. Sintesi che richiedono riscaldamento sono prese dalla scatola in un pallone Schlenk e sono collegati alla linea di Schlenk. Qualora un glove-box non è disponibile, tutte le manipolazioni possono essere effettuate con vetreria accuratamente selezionato su un Schlelinea nk, mentre utilizzando il vuoto / gas inerte (N ₂ o Ar) manipolazioni per mantenere un'atmosfera secca.

Nel processo di valutazione citotossicità, è necessario esaminare l'aspetto delle cellule in tutto l'esperimento. Prima dell'inizio dell'esperimento, il mezzo di crescita di cellule aderenti sane dovrebbe essere chiaro. Una cultura contaminato apparirà torbido. Inoltre, dopo l'incubazione delle cellule con tripsina-EDTA, le celle devono staccarsi dalla beuta e immergerla nel terreno. Se la maggior parte delle cellule rimangono attaccati al pallone, il pallone deve essere ulteriormente incubate per diversi minuti.

La lunghezza di una tale misurazione è di cinque giorni. È consentito un solo giorno per le cellule aderenti per fissare e acclimatare alla piastra di cella, e tre giorni per l'incubazione delle cellule con i farmaci testati per consentire alle cellule di procedere ad apoptosi. È necessario un giorno in più per l'incubazione con MTT. L'intero MeasureMent dovrebbe essere ripetuto almeno altre due volte in giorni diversi a partire da colture di cellule diverse, in modo che le misurazioni siano indipendenti.

La tecnica come qui descritto è applicato su tipi di cellule aderenti. Per applicare questo metodo su tipi di cellule non aderenti devono essere effettuate diverse regolazioni. Non è più necessario dedicare una giornata per le cellule per fissare e acclimatare alla piastra di cella, e quindi la preparazione della piastra e il supplemento dei farmaci testati può essere realizzato nello stesso giorno. Inoltre, nella fase finale della misurazione, appena dopo l'incubazione delle cellule con MTT, la soluzione deve essere centrifugata prima della rimozione del mezzo e l'aggiunta di isopropanolo.

È anche possibile sostituire l'utilizzo di MTT come marcatore di cellule vitali con un metodo alternativo per l'inibizione della crescita cellulare, in cui il tempo di incubazione delle cellule con il marcatore di lunghezza inferiore tcappello con MTT ^30. Un altro fattore da considerare quando si sceglie il marcatore è il possibile meccanismo di azione del farmaco testato ^27. Il saggio MTT fornisce informazioni sui mitocondri attività metabolica, e poiché è dipendente da reazioni enzimatiche, può essere influenzato dagli inibitori enzimatici.

La combinazione di preparazione della droga con la valutazione della sua citotossicità mediante il saggio MTT rappresenta un metodo efficace per lo sviluppo di nuovi farmaci citotossici base metallica. Tuttavia, questo metodo non fornisce alcuna informazione sul meccanismo di morte cellulare, la fase del ciclo cellulare che è influenzata dal farmaco e sue possibili bersagli biologici. Per questi scopi metodi aggiuntivi, come ad esempio ioduro di propidio (PI) Assorbimento Assay e analisi del ciclo cellulare devono essere eseguite ^31.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il finanziamento è stato ricevuto dal Consiglio europeo della ricerca nell'ambito del Settimo programma quadro della Comunità europea (FP7/2007-2013) / ERC accordo di sovvenzione no [239603]