Con questo metodo, possiamo determinare con precisione il numero di mutazioni in una singola cellula staminale ematopoietica. Queste mutazioni possono essere usate per decifrare processi mutazionali e sezionare lignaggi ematopoietici. Il nostro metodo evita l'uso di tecniche di amplificazione dell'intero genoma clonando le cellule staminali ematopoietiche in vitro, il che si traduce in tassi di errore più bassi e beneficia dell'analisi a valle.
I modelli mutazionali presenti nei genomi delle cellule staminali ematopoietiche possono rivelare i processi mutageni e di riparazione del DNA a cui sono state esposte. Iniziare questa procedura con la preparazione del materiale campione e la colorazione come descritto nel protocollo di testo, quindi preparare 25 millilitri di gambo ematopoietico e cellula progenitrice, o mezzo di coltura HSPC. Riempire una piastra di coltura cellulare 384 con 75 microlitri di mezzo di coltura HSPC in ogni pozzo.
Per evitare l'evaporazione del mezzo nei pozzi esterni, riempire i pozzi esterni con 75 microlitri di acqua sterile o PBS e non utilizzare questi pozzi per la cernita cellulare. L'ordinamento corretto degli HSPC di segnale validi è il passaggio più critico di questo protocollo. Impostare i gate per l'ordinamento HSPC in base a un controllo non macchiato in 10.000 celle del campione macchiato.
Cancello di singole celle disegnando un cancello attorno all'altezza di dispersione in avanti lineare rispetto alla frazione dell'area di dispersione in avanti. Utilizzare la frazione di controllo non macchiata per disegnare un cancello per la frazione di lignaggio. Disegnare gate per le celle positive CD34 e caratterizzare ulteriormente questo sottoinsieme impostando un gate specifico per le celle negative CD38, CD45RA.
Caricare la piastra da 384 po' sul fax e ordinare singole celle. Se applicabile al fax, attivare l'opzione per mantenere i dati di ordinamento dell'indice per consentire il ritrascimento delle celle ordinate. Per la coltura degli HSC ordinati singolarmente, avvolgere la piastra di coltura a 384 polietilene con coperchio in involucro di polietilene trasparente.
Trasferire la piastra da 384 po 'in un incubatore umidificato di 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica e tenerlo nell'incubatrice per tre o quattro settimane fino a quando non compaiono cloni visibili. Dopo quattro settimane di ristrutturazione, determinare quali pozzi hanno una confluenza del 30% o superiore. Per ogni cono, precompittare microtubi da 1,5 millilitri con un millilitro di 1%BSA e PBS ed etichettare il tubo in base al pozzo corrispondente.
Pre-bagnare una punta di pipetta con 1%BSA e PBS per ridurre al minimo il numero di celle che si attaccano alla punta della pipetta. Pipettare vigorosamente il mezzo su e giù almeno cinque volte raschiando il fondo del pozzo con la pipetta da 200 microlitri impostata a 75 microlitri. Raccogliere la sospensione cellulare nel microtubo etichettato che corrisponde al pozzo.
Ripetere la tubazione nel pozzo con un massimo di 75 microlitri di fresco 1%BSA e PBS per garantire il massimo assorbimento delle cellule. Le cellule coltivate clonally possono attaccarsi al fondo del pozzo. Ispezionare i pozzi utilizzando un microscopio a luce invertito standard per assicurarsi che tutte le cellule siano state raccolte.
Se tutti i pozzi con una confluenza superiore al 30% sono stati raccolti, riposizionare la piastra di 384 pozzi nell'incubatore. Le colture clonali possono proliferare fino a cinque settimane. Far girare la sospensione cellulare per cinque minuti a 350 volte g.
Dovrebbe essere visibile un piccolo pellet. Rimuovere con cura tutti tranne circa cinque microlitri del supernatante. I pellet cellulari possono essere congelati a meno 20 gradi Celsius e conservati per più mesi prima dell'isolamento del DNA.
Le mutazioni presenti nei primi rami della lineageria saranno presenti anche nel campione sfuso. I lignaggi di ramificazione successivi sono definiti solo da mutazioni condivise tra gli HSPC. Per identificare le mutazioni presenti in un sottoinsieme dei cloni e sottoclonaly presenti in massa, primo filtro per mutazioni somatiche condivise tra cloni.
In un terminale basato su Unix, modificate il filtersomatic. ne per impostare i pats e regolare gli altri parametri. Eseguire il filtersomatic.
pi greco script. Filtrare le mutazioni che sono sottoclonaly presenti in blocco utilizzando la massa lowVAF determinare. r in un terminale basato su Unix.
In questo modo verranno generati file vcf separati per varianti nucleotidiche singole condivise e univoche. Determinare tutte le mutazioni condivise tra cloni che non sono presenti nel campione di massa, sovrapponendo tutte le posizioni di mutazione. Escludere i falsi positivi mediante ispezione manuale utilizzando Integrative Genomic Viewer, abbreviato IGV.
Le mutazioni sono considerate false quando non sono presenti quando la mutazione è presente nella linea germinale in tutti i cloni o quando sono presenti in regioni scarsamente mappate. Le vere mutazioni possono essere condivise tra due cloni o essere sottoclonaly presenti nella massa. Risequenza tutti i loci condivisi in modo indipendente utilizzando il sequenziamento mirato o sanger.
Usa le mutazioni condivise per costruire una tabella binaria di mutazioni rispetto ai cloni sequenziati, con zero che indica che la mutazione non è presente e una che indica la presenza della mutazione. Produrre la tabella binaria della mutazione come mappa termica insieme a un dendrogramma che indica le relazioni di lignaggio tra le cellule usando funzioni basate su R. La mappa termica indica lo stato di mutazione per ogni cellula.
Mostrato come output di esempio dell'analisi del numero di copia generata dal controllo tre c per verificare la presenza di modifiche al numero di copia. Il grafico a frazione allele variante creato dal filtro a variante nucleotidica singola, è un istogramma delle frequenze alleliche varianti nel campione. Un picco nel grafico di densità a 0,5 indica che il campione è clonale.
Qui è raffigurata una tipica analisi dei modelli mutazionali che produce una trama di 96 trinucleotide. Oltre alla quantificazione di diversi tipi di mutazione, l'estrazione della firma può essere eseguita anche con questo strumento. Le mutazioni condivise tra cloni o presenti in un clone nel controllo della linea germinale vengono convalidate utilizzando IGV.
Le mutazioni sono considerate vere quando presenti nel campione e non ad alti livelli di frequenza allele variante nella linea germinale. Le mutazioni sono considerate false quando non sono presenti nell'IGV, il che può verificarsi in regioni scarsamente mappate. In altri casi, gli eventi rilevati dal filtro a variante nucleotidica singola sono varianti di linea germinale perse.
La resequenza indipendente delle mutazioni mediante resequenza mirata è altamente raccomandata per queste mutazioni in cloni selezionati. Dopo il rilevamento di mutazioni somatiche condivise tra cloni, viene generata una matrice binaria, viene costruita una mappa termica contenente cellule con e senza le mutazioni condivise da A a M.L'albero del lignaggio dello sviluppo è indicato. Come passo successivo per il meta presentato qui, i processi mutazionali attivi nelle cellule staminali emopoietiche possono essere determinati utilizzando l'analisi della firma mutazionale.
