مع هذه الطريقة، يمكننا تحديد بدقة عدد الطفرات في خلية جذعية واحدة. ويمكن استخدام هذه الطفرات لفك عمليات الطفرات وتشريح النسب الدموية. طريقتنا يتجنب استخدام تقنيات تضخيم الجينوم كله عن طريق استنساخ الخلايا الجذعية الدموية في المختبر، مما يؤدي إلى انخفاض معدلات الخطأ وفوائد تحليل المصب.
يمكن أن تكشف الأنماط الطفرة الموجودة في جينوم الخلايا الجذعية المسببة للدم عن عمليات إصلاح الطفرات والحمض النووي التي تعرضت لها. ابدأ هذا الإجراء مع إعداد عينة المواد وتلطيخ كما هو موضح في بروتوكول النص، ثم إعداد 25 ملليلتر من الجذعية الدموية وخلية السلف، أو متوسط ثقافة HSPC. ملء خلية ثقافة 384 لوحة جيدة مع 75 ميكرولترات من ثقافة HSPC المتوسطة في كل بئر.
لمنع تبخر المتوسطة في الآبار الخارجية، تعبئة الآبار الخارجية مع 75 ميكرولترات من الماء المعقم أو برنامج تلفزيوني، وعدم استخدام هذه الآبار لفرز الخلايا. الفرز الصحيح لـ HSPCs إشارة قابلة للتطبيق هو الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول. تعيين البوابات لفرز HSPC على أساس عنصر تحكم غير ملوث في 10،000 الخلايا من العينة الملطخة.
بوابة الخلايا المفردة عن طريق رسم بوابة حول ارتفاع التشتت الأمامي الخطي مقابل كسر منطقة التشتت إلى الأمام. استخدم كسر عنصر التحكم غير المُطَرَّط لرسم بوابة لكسر النسب. رسم بوابات لالخلايا الإيجابية CD34 وميز كذلك هذه المجموعة الفرعية عن طريق وضع بوابة محددة لD38 السلبية، CD45RA الخلايا السلبية.
قم بتحميل اللوحة التي تحتوي على 384 بئرًا على جهاز الفاكس وفرز الخلايا المفردة. إذا كان قابلاً للتطبيق على جهاز الفاكس، قم بالتبديل على الخيار للاحتفاظ بفهرسة بيانات الفرز لتمكين تعقب الخلايا التي تم فرزها. إلى الثقافة فرزها بشكل غير معلّم، لف لوحة ثقافة 384 بئرًا مع غطاء في غلاف البولي إيثيلين الشفاف.
نقل لوحة 384-well إلى حاضنة 37 درجة مئوية مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون والحفاظ عليه في الحاضنة لمدة ثلاثة إلى أربعة أسابيع حتى تظهر استنساخ مرئية. بعد أربعة أسابيع من الاستزراع، حدد الآبار التي تحتوي على التقاء بنسبة 30٪ أو أعلى. لكل مخروط، ملء مسبق 1.5 ملليلتر الأنابيب الدقيقة مع ملليلتر واحد من 1٪ BSA وPBS وتسمية الأنبوب وفقا لبرئ المقابلة.
قبل الرطب تلميح ماصة مع 1٪ BSA وBBS لتقليل عدد الخلايا التمسك تلميح ماصة. بقوة ماصة المتوسطة صعودا وهبوطا خمس مرات على الأقل في حين كشط الجزء السفلي من البئر مع ماصة 200 ميكرولتر تعيين في 75 ميكرولترات. جمع تعليق الخلية في microtube المسمى الذي يتوافق مع البئر.
كرر الأنابيب في البئر مع ما يصل إلى 75 ميكرولترات من 1٪ BSA الطازجة وبرنامج تلفزيوني لضمان أقصى قدر من امتصاص الخلايا. يمكن للخلايا المستزرعة كلونالي التمسك إلى الجزء السفلي من البئر. افحص الآبار باستخدام مجهر ضوء مقلوب قياسي للتأكد مما إذا كان قد تم جمع جميع الخلايا.
إذا تم حصاد جميع الآبار التي يزيد التقاءها عن 30٪ ، ضع لوحة 384 بئرًا في الحاضنة. يمكن أن تتكاثر الثقافات التخفية لمدة تصل إلى خمسة أسابيع. تدور أسفل تعليق الخلية لمدة خمس دقائق في 350 مرات ز.
وينبغي أن تكون بيليه صغيرة مرئية. إزالة بعناية كل ما عدا حوالي خمسة ميكرولترات من السوبر. يمكن تجميد كريات الخلايا عند ناقص 20 درجة مئوية وتخزينها لعدة أشهر قبل عزل الحمض النووي.
الطفرات الموجودة في الفروع الأولى من lineagery ستكون أيضا تحت كلونالي موجودة في العينة السائبة. يتم تعريف أنساب المتفرعة اللاحقة بواسطة الطفرات المشتركة بين HSPCs فقط. لتحديد الطفرات الموجودة في مجموعة فرعية من المستنسخات و تحت كلينا موجودة في الجزء الأكبر ، أول مرشح للطفرات الجسدية المشتركة بين المستنسخين.
في محطة طرفية Unix المستندة، تحرير filtersomatic. ني ملف لضبط الربتات وضبط المعلمات الأخرى. تشغيل filtersomatic.
بي النصي. تصفية للطفرات التي هي subclonaly موجودة في الجزء الأكبر باستخدام تحديد lowVAF الجزء الأكبر. r البرنامج النصي في محطة Unix المستندة.
سيؤدي ذلك إلى إنشاء ملفات vcf منفصلة لمتغيرات النيوكليوتيدات المفردة المشتركة والفريدة. تحديد جميع الطفرات المشتركة بين المستنسخين غير الموجودة في عينة الجزء الأكبر، عن طريق تداخل جميع مواضع الطفرات. استبعاد الإيجابيات الكاذبة عن طريق التفتيش اليدوي باستخدام عارض الجينوم التكاملي، مختصر IGV.
تعتبر الطفرات زائفة عندما لا تكون موجودة عندما تكون الطفرة موجودة في الخط الجرثومي في جميع المستنسخات أو عندما تكون موجودة في مناطق غير مرسومة بشكل سيئ. يمكن أن تكون مشتركة الطفرات الحقيقية بين اثنين من المستنسخين أو أن تكون موجودة subclonaly في الجزء الأكبر. إعادة إنشاء كافة loci المشتركة بشكل مستقل باستخدام تسلسل المستهدفة أو sanger.
استخدم الطفرات المشتركة لبناء جدول ثنائي من الطفرات مقابل المستنسخات المتسلسلة، مع عدم الإشارة إلى أن الطفرة غير موجودة وواحدة تشير إلى وجود الطفرة. إخراج الجدول الثنائي الطفرة كخريطة حرارية مع dendrogram تشير إلى علاقات النسب بين الخلايا باستخدام وظائف R أساس. تشير الخريطة الحرارية إلى حالة الطفرة لكل خلية.
تظهر كـ مثال إخراج تحليل رقم نسخة التي تم إنشاؤها بواسطة عنصر التحكم ثلاثة c للتحقق من التعديلات رقم نسخة. البديل أليل جزء مؤامرة التي أنشأتها تصفية متغير وحيد النيوكليوتيد، هو مدرج التكرار من ترددات آليل البديل في العينة. تشير الذروة في قطعة الكثافة عند 0.5 إلى أن العينة غير مُتَنَكَة.
يصور هنا هو نموذجي تحليل أنماط الطفرات إنتاج مؤامرة ثلاثية النوى 96. بالإضافة إلى القياس الكمي لأنواع الطفرات المختلفة، يمكن أيضًا إجراء استخراج التوقيع باستخدام هذه الأداة. يتم التحقق من الطفرات المشتركة بين المستنسخين أو الموجودة في استنساخ في عنصر التحكم في الخط الجرثومي باستخدام IGV.
وتعتبر الطفرات صحيحة عندما تكون موجودة في العينة وليس عند مستويات تردد آليل متغيرة عالية في الخط الجرثومي. تعتبر الطفرات كاذبة عندما لا تكون موجودة في IGV ، والتي يمكن أن تحدث في المناطق التي تم تعيينها بشكل سيئ. وفي حالات أخرى، تكون الأحداث التي تم الكشف عنها بواسطة تصفية متغير النيوكليوتيد المفردة متغيرات جرثومية مفتقدة.
ويوصى بشدة بإعادة التسييل المستقل للطفرات عن طريق إعادة التسييل المستهدف لهذه الطفرات في استنساخ مختارة. بعد الكشف عن الطفرات الجسدية المشتركة بين المستنسخين، يتم إنشاء مصفوفة ثنائية، يتم إنشاء خريطة حرارية تحتوي على خلايا مع وبدون الطفرات المشتركة A من خلال شجرة النسب التنموي M.The. كخطوة تالية للميتا المعروض هنا، يمكن تحديد العمليات الطفرة النشطة في الخلايا الجذعية الهموبويتية باستخدام تحليل التوقيع الطفرة.
