С помощью этого метода мы можем точно определить количество мутаций в одной гематопоэтической стволовой клетке. Эти мутации могут быть использованы для расшифровки мутационных процессов и вскрытия гематопоэтических линий. Наш метод позволяет избежать использования методов усиления всего генома путем клонирования гематопоэтических стволовых клеток in vitro, что приводит к снижению уровня ошибок и преимуществам анализа ниже по течению.
Мутационные модели, присутствующие в геномах гематопоэтических стволовых клеток, могут выявить мутагенные и процессы восстановления ДНК, которым они подверглись. Начните эту процедуру с подготовки образца материала и окрашивания, как описано в текстовом протоколе, а затем подготовить 25 миллилитров гематопоэтического ствола и клетки-прародителя, или HSPC культуры среды. Заполните клеточной культуры 384 хорошо пластины с 75 микролитров HSPC культуры среды в каждой хорошо.
Чтобы предотвратить испарение среды во внешних скважинах, заполните внешние скважины 75 микролитров стерильной воды или PBS, и не используйте эти скважины для сортировки клеток. Правильная сортировка жизнеспособных сигналов ГЦП является наиболее важным шагом в этом протоколе. Установите ворота для сортировки HSPC на основе неоплеканного контроля в 10 000 ячеек из окрашенного образца.
Ворота одиночных ячеек, рисуя ворота вокруг линейного вперед рассеяния высоты по сравнению с вперед рассеяния области фракции. Используйте незапачканную контрольную фракцию, чтобы нарисовать ворота для фракции линии. Нарисуйте ворота для положительных ячеек CD34 и дополнительно охлив это подмножество, установив конкретные ворота для отрицательных, CD45RA отрицательных ячеек CD38.
Загрузите пластину 384-колодец на факс и сортив одиночные ячейки. Если это применимо к факсу, переключите на возможность сохранить данные сортировки индекса, чтобы позволить отследить отсортированные ячейки. Чтобы культура отдельно отсортированы HSCs, оберните 384-ну культуры пластины с крышкой в прозрачной полиэтиленовой пленкой.
Перенесите пластину из 384 градусов в увлажненные 37 градусов по Цельсию с 5%-ным углекислым газом и держите ее в инкубаторе в течение трех-четырех недель, пока не появятся видимые клоны. После четырех недель культивирования определите, какие скважины имеют слияние 30% или выше. Для каждого конуса, предварительно заполнить 1,5 миллилитров микротрубки с одним миллилитр 1%BSA и PBS и этикетки трубки в соответствии с соответствующей хорошо.
Предварительно мокрый наконечник пипетки с 1%BSA и PBS, чтобы свести к минимуму количество клеток, прилипащих к кончику пипетки. Энергично пипетки среднего вверх и вниз, по крайней мере пять раз, выскаблив дно хорошо с 200 микролитров пипетки установлен на 75 микролитров. Соберите подвеску ячейки в помеченной микротрубки, которая соответствует колодецу.
Повторите трубы в колодец с до 75 микролитров свежих 1%BSA и PBS для обеспечения максимального поглощения клеток. Клонально культурные клетки могут прилипать к нижней части колодеца. Осмотрите скважины с помощью стандартного, перевернутого светового микроскопа, чтобы убедиться, что все клетки были собраны.
Если были собраны все скважины с более чем 30%-ным слиянием, поместите пластину из 384 скважин обратно в инкубатор. Клональные культуры могут размножаться до пяти недель. Спин вниз клеточной подвески в течение пяти минут при 350 раз г.
Небольшая гранула должна быть видна. Аккуратно удалите все, кроме пяти микролитров супернатанта. Клеточные гранулы могут быть заморожены при температуре минус 20 градусов по Цельсию и храниться в течение нескольких месяцев до изоляции ДНК.
Мутации, присутствующие в первых ветвях линии, также будут суб клонально присутствовать в основной выборке. Более поздние линии ветвлений определяются мутациями, общими только между ГЦП. Для выявления мутаций, присутствующих в подмножестве клонов и подклено присутствующих в массе, первый фильтр для соматических мутаций, разделяемых между клонами.
В терминале на основе Unix отредактировать фильтрсоматику. ne файл для настройки погладить и настроить другие параметры. Запустите фильтрсоматичный.
пи сценарий. Фильтр для мутаций, которые подклеонали присутствуют в основной массе с помощью определить низковаф навалом. r скрипт в терминале на основе Unix.
Это позволит создавать отдельные файлы vcf для общих и уникальных вариантов одного нуклеотида. Определите все мутации, разделяемые между клонами, которые не присутствуют в основной выборке, перекрывая все позиции мутации. Исключите ложные срабатывания путем ручного осмотра с помощью интегративного геномного зрителя, сокращенного IGV.
Мутации считаются ложными, когда их нет, когда мутация присутствует в зародышевой линии во всех клонах или при присутствуют в плохо отображенных регионах. Истинные мутации могут быть разделены между двумя клонами или быть subclonaly присутствует в основной массе. Resequence все общие локусы независимо с помощью целевых или sanger последовательности.
Используйте общие мутации, чтобы построить двоичную таблицу мутаций по сравнению с секвенированием клонов, с нулем, указывающим на то, что мутации нет, и одно, указывающее на наличие мутации. Вывод мутации двоичной таблице в качестве тепловой карты вместе с дендрограммой, указывающей линии отношений между клетками, использующими R-функции. Тепловая карта указывает на состояние мутации для каждой клетки.
Показан в качестве примера вывода анализа числа копий, генерируемых управлением 3 c для проверки изменений номера копии. Вариант аллельного фракционого участка, созданный одноядеротидной фильтрацией варианта, является гистограммой частоты аллелей вариантов в образце. Пик плотности участка в 0,5 указывает на то, что образец клонирован.
Изображенный здесь типичный анализ мутационных моделей, производящий 96 тринуклеотидных сюжетов. В дополнение к количественной оценке различных типов мутаций, удаление подписи также может быть выполнено с помощью этого инструмента. Мутации, разделяемые среди клонов или присутствующие в клоне в контроле зародышевой линии, проверяются с помощью IGV.
Мутации считаются верными при присутствуют в образце, а не при высоких уровнях частоты аллелей в зародышевой линии. Мутации считаются ложными, когда они не присутствуют в IGV, что может произойти в плохо отображенных регионах. В других случаях события, обнаруженные при фильтрации одного нуклеотидного варианта, являются пропущенными вариантами зародышевой линии.
Для этих мутаций в отдельных клонах настоятельно рекомендуется независимое повторное оплодотворение путем целевого повторного секвестрирования. После обнаружения общих соматических мутаций между клонами генерируется двоичная матрица, строится тепловая карта, содержащая клетки с общими мутациями А и без них через дерево линии развития M.The. В качестве следующего шага для мета представлены здесь, мутационные процессы, активные в гемопоэтических стволовых клеток могут быть определены с помощью анализа мутной подписи.
