We thank K. Delaney for comments on the manuscript. This work was supported by the National, Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) Intramural Program.

1. Tessuto Raccolta e dissezione <ol><li> In ogni flacone contenente lievito secco, cultura 10 femmina adulta vola con 10 maschi per 2-3 giorni. Nota: Mantenere le mosche di sesso femminile ben nutriti migliorerà la qualità complessiva e la resa della produzione ovarica e facilitare la dissezione. </li><li> Anestetizzare la femmina vola su un anidride carbonica (CO 2) vola pad. </li><li> Sotto lo stereoscopio, mettere alcune gocce di media RT (media Drosophila Schneider integrato con siero fetale bovino al 10% (FBS)) su un rilievo da dissezione. Condurre tutte le procedure di dissezione nel mezzo per mantenere in vita e in buona salute i tessuti. </li><li> Afferra una femmina ingrassato mosca con una pinza sottile dal naso taglienti al suo torace inferiore. Utilizzare un altro set di pinze per tirare delicatamente all&#39;estremo posteriore del volo fino a quando i tessuti nell&#39;addome sono esposti. Staccare le due ovaie da altri tessuti (ad esempio budella). Nota: ogni display ovaio una struttura opaca che è componed di 16-20 ovarioli allegati. </li><li> Per migliorare la penetrazione dei reagenti, aprire le ovaie tirando loro parte e passando le punte della pinza tra ogni ovariole un paio di volte. Mantenere le ovarioli collegati all&#39;interno di un ovaio per minimizzare la perdita dei tessuti durante le seguenti procedure. </li><li> Trasferire le ovaie subito in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 500 ml di mezzo di Drosophila di Schneider con il 10% FBS. </li><li> Ripetere la dissezione e raccogliere 10-15 ovaie in ogni provetta. </li></ol> 2. EdU Labeling <ol><li> Aspirare il mezzo in ogni tubo, e sostituirlo con 500 ml di mezzo di Drosophila di Schneider con il 10% FBS contenente 7 micron afidicolina. Nota: afidicolina viene utilizzato per bloccare la sintesi del DNA nucleare, inibendo DNA polimerasi α senza influenzare la replicazione del mtDNA 7, 12. È possibile aumentare la concentrazione afidicolina finoa 70 mM per ottenere una migliore inibizione. La soluzione madre di 3-30 mM afidicolina in DMSO può essere conservato al buio a -20 ° C per un massimo di 6 settimane. </li><li> Per mantenere le ovaie sani, in modo che essi sono immersi in soluzioni durante il cambio del mezzo. Utilizzare medio Drosophila Schneider con il 10% FBS fino al passo 2.6. </li><li> Incubare ovaie per 3 ore a temperatura ambiente su una sedia a dondolo da banco con rotazione delicata. <ol><li> Per il trattamento della droga, per esempio, mitocondriale sganciamento carbonile cianuro fenilidrazone 4 trifluoromethoxy (FCCP), aggiungere la concentrazione adeguata di farmaci (ad esempio, 10 micron FCCP) nel mezzo, dopo 2 ore di trattamento afidicolina. Continuare l&#39;incubazione per un altro 1 ora. </li></ol></li><li> Rimuovere il contenente afidicolina mezzo con o senza farmaci. Brevemente risciacquare le ovaie con media (afidicolina non è necessario) due volte. </li><li> Aggiungere 1 ml di mezzo contenente 10 mM EdU e 7 micron afidicolina e continuare incubating a temperatura ambiente per 2 ore. Conservare la soluzione 10 mM EdU disponibile (DMSO) a -20 ° C. </li><li> Rimuovere il terreno contenente EdU e afidicolina. Lavare con medio (senza afidicolina) due volte per 3 minuti ciascuno. </li></ol> 3. Fissazione dei tessuti e permeabilizzazione <ol><li> Preparare una soluzione di paraformaldeide al 4% in tampone fosfato (PBS, pH 7,4). Nota: Abbiamo usato paraformaldeide disponibile commerciale memorizzati in fiale pre-segnato. Aprire una nuova ampolla e diluire al 4% prima dell&#39;uso. ATTENZIONE: La formaldeide è tossica; esso dovrebbe essere gestito in una cappa aspirante con la pelle e protezione per gli occhi. </li><li> Fissare ovaie con 4% paraformaldeide per 20 minuti a RT con rotazione dolce. </li><li> Rimuovere il fissativo e lavare ovaie due volte in 1 ml di 3% BSA in PBS per 5 minuti ogni volta. </li><li> Per permeabilize i tessuti, rimuovere la soluzione di lavaggio e aggiungere 1 ml di 0,5% Triton X-100 in PBS. Incubare a temperatura ambiente per 20 min. </li><li> Rimuovere la soluzione permeabilizzazione e lavare due volte in 1 mldel 3% BSA in PBS. </li></ol> 4. Individuazione EdU Nota: EdU rilevamento si basa sulla chimica &quot;click&quot;, un Cu (I) -catalyzed [3 + 2] cicloaddizione 13, che aggiunge azidi fluorescenti al gruppo alchino terminale EdU, e la molecola fluorescente viene sottoposto a successiva rivelazione. Poiché Cu (I), che è facilmente ossidato a specie non catalitici Cu (II), è necessario per catalizzare la reazione, si raccomanda di ridurre la (II) solfato Cu in situ per ottenere Cu (I). Cioè, Cu (II) solfato viene utilizzato in presenza di un riducente come l&#39;acido ascorbico (qui il &quot;buffer additivo&quot;) per generare il rame (I). <ol><li> Prima dell&#39;esperimento, preparare la soluzione di lavoro del azide Alexa Fluor (Alexa Fluor 488 azide, Alexa Fluor 555 azide o altri, a seconda del fluoroforo preferita, che prendono il nome di &quot;dye azide&quot; di seguito), tampone di reazione EdU e tampone EdU additivo secondo il fornitore diistruzioni. <ol><li> Ricostituire il colorante azide in 70 ml di DMSO. Conservare la soluzione di lavoro a -20 ° C fino a 1 anno. </li><li> Preparare tampone fresco reazione EdU diluendo il tampone di reazione 10x EdU con acqua deionizzata. Nota: Dopo l&#39;uso, conservare qualsiasi soluzione 1x rimanendo a 4 ° C. La soluzione 1x è stabile per un massimo di 6 mesi. </li><li> Fare una soluzione 10x magazzino del buffer additivo EdU sciogliendo completamente la polvere in 2 ml di acqua deionizzata. Nota: Questa soluzione madre è stabile fino a 1 anno a -20 ° C. Se la soluzione si sviluppa un colore marrone, si è degradato e deve essere scartato. </li></ol></li><li> Preparare il cocktail reazione EdU nuovo ogni volta, ed utilizzare entro 15 minuti dalla preparazione. Per ottenere risultati riproducibili, assicurarsi che i componenti della reazione sono mantenuti agli stessi rapporti. <ol><li> Fare fresco 1x EdU tampone soluzione additiva diluendo la soluzione di 10x magazzino (preparata al punto 4.1.3) 1:10 in acqua deionizzata. Utilizzare questo soluzione lo stesso giorno. </li><li> Preparare 1 ml di EdU cocktail reazione combinando i seguenti ingredienti in ordine: 860 microlitri di buffer 1x EdU reazione, 40 microlitri CuSO 4, 2,5 ml di tintura azide, 100 ml 1x EdU buffer di additivo. Nota: È importante che gli ingredienti vengono aggiunti al fine di garantire prestazioni ottimali. </li></ol></li><li> Rimuovere il PBS con il 3% di BSA e aggiungere 0,5 ml di cocktail reazione EdU ad ogni provetta. Incubare a temperatura ambiente per 30 min con rotazione dolce. Mantenere i campioni al riparo dalla luce. </li><li> Rimuovere il cocktail reazione EdU e lavare una volta con 1 ml di 3% di BSA in PBS. </li><li> Lavare i campioni una volta con 1 ml di PBS. </li></ol> 5. anticorpo etichettatura Nota: eseguire l&#39;etichettatura degli anticorpi dopo EdU colorazione. Se nessuna colorazione aggiuntiva si desidera, si può procedere al montaggio e di imaging direttamente. È importante che i campioni siano protetti dalla luce in tutte le seguenti procedure. <ol><li> Rimuovere la soluzione di lavaggio. Bloccare le ovaie in 1 ml di soluzione bloccante contenente 0,2% di BSA e 0,1% Triton X-100 in PBS per 30 min. </li><li> Rimuovere la soluzione di saturazione e sostituirlo con l&#39;anticorpo primario diluito in soluzione bloccante (ad esempio, il mouse ATP sintetasi subunità α anticorpi, 1: 1000 diluizione). Incubare al buio a 4 ° CO / N. </li><li> Lavare i campioni di 1 ml di soluzione bloccante 3 volte, 10 minuti ogni volta. Per ridurre al minimo lo sfondo, lavare altre due volte per 30 minuti ciascuno. Rimuovere la soluzione di saturazione. </li><li> Incubare con anticorpo secondario diluito in soluzione bloccante (per esempio, di capra anti-topo Alexa Fluor 568 anticorpo secondario, diluizione 1: 200) per 2 ore a temperatura ambiente. Nota: Utilizzare un colore diverso da quello accoppiato ad edu. </li><li> Ripetere le fasi di lavaggio eseguiti in fase 5.3. </li><li> Lavare con 1 ml di PBS, una volta per rimuovere il detergente. </li></ol> 6. Montaggio e Imaging <ol><li> Rimuovere con attenzione tutto il PBS e immediatamente coprire le ovaie con 50 ml mezzo di montaggio (con o senza DAPI). Nota: utilizzare un mezzo di montaggio che non indurisce mentre i ovarioli vengono separati l&#39;uno dall&#39;altro. Ovaie possono essere memorizzati in un mezzo di montaggio a 4 ° C per una settimana. </li><li> Tagliare l&#39;estremità di un puntale e utilizzarlo per trasferire accuratamente ovaie su un vetrino da microscopio. </li><li> Completamente separata ogni ovariole con una pinza sottile dal naso taglienti allo stereomicroscopio. Rimuovere i tessuti che collegano alla fine posteriore e la fase 14 o camere uovo maturo. I giovani camere uova sono alla fine anteriore e trasparente. </li><li> Allineare le camere d&#39;uovo con una pinza in modo che non si sovrappongano tra loro. </li><li> Lentamente abbassare vetrino coprioggetti # 1.5 sulla cima dei campioni. Lasciare che il mezzo di montaggio per polimerizzare per diverse ore a temperatura ambiente. Sigillare con smalto trasparente. </li><li> Immagine scivola il giorno dopo, o conservare a 4 ° C prima di imaging. </li><li> Visualizza sotto a mi confocalecroscope con un obiettivo ad immersione in olio 63X. Cattura immagini tridimensionali z-stack. Nota: Vi è una forte EdU segnale in camere d&#39;uovo in seguito allo stadio e fluorescenza di fondo nella guaina epiteliale. Nell&#39;esaminare etichettatura EdU in un particolare germarium, si dovrebbe evitare germariums che si sovrappongono da o vicino ad altri tessuti o camere d&#39;uovo in seguito allo stadio. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

etichettatura EdU è un nuovo metodo ed efficiente per rilevare la sintesi del DNA in cellule proliferanti, che si basa sulla costituzione e la colorazione di analoghi nucleosidici nel DNA di nuova sintesi. Questo metodo è superiore al metodo di etichettatura BrdU in quanto è più veloce e altamente sensibile. Ancora più importante, permette di buona conservazione strutturale e penetrazione edu-dye efficiente di tutto il montaggio tessuti 9, 10. Storicamente, come un&#39;alternativa superiore per l&#39;etichettatura BrdU, etichettatura EdU è stato utilizzato per studiare la replicazione del DNA nucleare durante la fase S del ciclo cellulare. Afidicolina è un inibitore della DNA polimerasi α, che è la polimerasi principale per la replicazione del DNA nucleare in fase S 12 15. replicazione del mtDNA viene effettuata da DNA polimerasi γ, che è insensibile ai afidicolina trattamento. Quindi, il trattamento con afidicolina prima e durante l&#39;incubazione EdU significativamente inibito EdU incorporazione nel DNA nucleare. Dovrebbenotato che afidicolina può essere stabile per diverse settimane se opportunamente conservato, e l&#39;efficacia di afidicolina nell&#39;inibire la replicazione del DNA nucleare era variabile nelle nostre mani. I ovarioli o camere d&#39;uovo con una forte etichettatura DNA nucleare dovrebbero essere esclusi dalla analisi di ulteriori dati. replicazione del mtDNA può essere facilmente visualizzato come puncta nel citoplasma, che offre anche un modo semplice per quantificare il livello di replicazione del mtDNA contando il numero di EdU puncta, normalizzata al volume totale di citoplasma. software di imaging può essere applicato a identificare automaticamente EdU puncta nelle immagini microscopiche, il che è particolarmente utile per le analisi computazionali di grandi insiemi di dati. Tuttavia, dovrebbero essere prese precauzioni, in quanto l&#39;inibizione incompleta della replicazione del DNA nucleare può portare alla costituzione EdU in loci distinti sul cromosoma e visualizzare come puncta all&#39;interno del nucleo. Anche in altri casi, l&#39;intensità della EdU incorporazione in replicolata mtDNA potrebbe essere debole, mentre lo sfondo e il rumore potrebbe essere elevato. Pertanto, i singoli parametri per analisi automatica delle immagini devono essere attentamente definiti. Si raccomanda inoltre che le immagini devono essere esaminati con gli occhi addestrati per fare in modo che una corretta puncta EdU sono identificati. Visualizzazione di nuova sintesi mtDNA durante Drosophila oogenesis offre l&#39;opportunità di indagare come la replicazione del DNA mitocondriale è regolata in condizioni fisiologiche o patologiche, svolgendo l&#39;esperimento in mosche sottoposti a una serie di perturbazioni farmacologici o genetici. In uno studio precedente, saggio di incorporazione EdU è stato eseguito in un mtDNA mutante Drosophila mt: COI T300I 11. Inoltre, per interrompere il potenziale di membrana mitocondriale, ovaie sono state trattate con varie concentrazioni di mitocondriale FCCP disaccoppiatore o 2,4-dinitrofenolo (DNP) prima EdU incorporazione. A seconda dei fini sperimentalie le caratteristiche di droga, metodi diversi potrebbero essere adottate per la consegna efficace. Per mosche adulte, farmaci possono essere presentati in forma di vapore (per esempio, etanolo e cocaina) 16,17 o farmaci possono essere iniettati nell&#39;addome, dove diffonde rapidamente in tutto il corpo 18. La pratica più comune è che i farmaci siano aggiunti all&#39;alimento mosca o una carta da filtro di saccarosio / farmaco-saturo. Ad esempio, l&#39;inibitore di assemblaggio dei microtubuli, colchicina, è stato alimentato a mosche per 2-3 giorni prima della dissezione ovaio 19. Quindi, è importante valutare il metodo drug delivery e selezionate concentrazioni appropriate. Per garantire il successo di imaging di replicazione del mtDNA in ovaie di Drosophila, diversi passaggi critici devono essere eseguiti con cura. Primo, preservando la vitalità e la salute delle ovaie durante la dissezione e EdU incorporazione è essenziali (punti 1 e 2). Medio Drosophila della Schneider con FBS ha bisogno di essere riscaldato a RTprima dell&#39;uso. Uno dovrebbe ridurre al minimo il contatto diretto tra le camere d&#39;uovo e strumenti di dissezione o puntali delle pipette. Le ovaie dovrebbero essere immerso sotto soluzioni tutti i tempi per evitare la disidratazione. Cattiva gestione i tessuti possono facilmente portare a svenire o segnali fluorescenti. Durante la fase di montaggio dei tessuti, ovarioli dovrebbero essere separati l&#39;uno dall&#39;altro e sparsi sul vetrino da microscopio. Assicurarsi che le camere di uova non sono impilati uno sopra l&#39;altro. Abbiamo notato che le camere a base di uova al di là di fase 14 visualizzati po &#39;incorporazione edu. Inoltre, a causa delle grandi dimensioni, le camere di uovo fase avanzata spesso causano vicine camere uovo più giovani di essere fuori fuoco. Pertanto si raccomanda che le camere fase tardiva uovo essere scartati. Qui forniamo un protocollo dettagliato per l&#39;etichettatura replicare mtDNA in Drosophila ovaie adulte. Questo metodo consente la semplice quantificazione di replicazione del mtDNA sotto varie perturbazioni genetiche e farmacologiche,e sarà utile per la dissezione meccanismi alla base dello sviluppo biogenesi mitocondriale e mtDNA eredità.

Inoltre genoma nucleare, ogni cellula eucariotica contiene anche migliaia di copie di DNA circolare piccolo nella matrice mitocondriale. Mentre il DNA mitocondriale (mtDNA) codifica subunità essenziali della catena di trasporto degli elettroni, la maggioranza del proteoma mitocondriale, compresi tutti i fattori per la replicazione e trascrizione del mtDNA sono codificati dal genoma nucleare. In contrasto con il genoma nucleare che segue le leggi di Mendel dell&#39;ereditarietà, il genoma mitocondriale animale viene ereditato esclusivamente attraverso la linea materna. Pertanto, la comprensione di come mtDNA è proliferato e trasmessa da una generazione a quella successiva attraverso l&#39;ovocita femminile è di fondamentale importanza. Tuttavia, vi è continuo dibattito su come replicazione del mtDNA è regolata nella linea germinale femminile. Inoltre, la teoria collo di bottiglia mtDNA ampiamente accettata per la trasmissione del mtDNA suggerisce che la popolazione di mtDNA in cellule germinali primordiali è un sotto-campione di un numero relativamente piccolo during di sviluppo 1 2. Ciò implica anche che la replicazione del DNA mitocondriale è temporalmente e spazialmente regolamentato durante oogenesis. Quindi, il rilevamento in situ di replicazione del mtDNA durante lo sviluppo germline faciliterà la comprensione del meccanismo di mtDNA ereditarietà. Drosophila oogenesi fornisce un sistema geneticamente trattabili per studiare la replicazione del DNA mitocondriale e la trasmissione. In ciascuna delle due ovaie Drosophila, ci sono 16-20 stringhe indipendenti di camere uovo chiamati ovarioli 3, che sono le unità funzionali di produzione di uova (vedere Figura 1A). Ogni ovariole contiene un&#39;organizzazione lineare progressiva dell&#39;oogenesi, dove la punta anteriore è composto da una struttura chiamata germarium. Il germarium è ulteriormente suddiviso in quattro regioni che contengono le cellule germinali in fasi di sviluppo differenti. Nella regione 1, le cellule staminali germinali passare attraverso la divisione asimmetrica per produrre cellule figlie noto come cystoblasts. Regione 2a contiene i cystoblasts che hanno completato la loro divisione finale. Cystoblasts sottoposti a quattro cicli di divisione che produce gruppi di 16 cellule. I 16 cellule rimangono collegati tra loro da ponti citoplasmatici chiamati canali anello. Solo una delle celle impegna a differenziazione ovocita, mentre l&#39;altro 15 sviluppano come cellule infermiere poliploidi. Una struttura essenziale citoplasmatica, noto come fusome, si propone di agevolare la formazione di canali anello, determinare la polarità cisti e l&#39;infermiera interazioni cellula-ovociti 4,5. Poiché le cisti muovono verso regione 2b, le strutture cisti coprono l&#39;intera larghezza della germarium, e diventano più associati con cellule follicolari. Le strutture germarium terminano con la regione 3 contenente la prima camera uovo in erba. Successivamente, le camere d&#39;uovo vengono assemblate alla fine posteriore della germarium, che il progresso attraverso il ovariole in 14 tappe morfologicamente distinte. La crescita di ovociti dipende dalle cellule infermiere, which proteine di trasporto, mRNA e strutture endomembrane (ad esempio, Golgi) tramite i canali ad anello nel citoplasma dell&#39;ovocita. Durante Drosophila oogenesi, si è constatato che una frazione dei mitocondri all&#39;interno di ogni cisti di 16 cellule sono stati associati con il fusome, mosso attraverso i canali ad anello e sono stati consegnati nel singolo ovocita in una grande massa chiamato Balbiani corpo 6. Questo fenomeno è stato proposto di contribuire al controllo della qualità di eredità mitocondriale attraverso ovaie femminili. Rilevazione della sintesi del DNA mitocondriale si basa sulla costituzione dei precursori del DNA marcati nel DNA cellulare. Tradizionalmente, un analogo nucleosidico della timidina 5-bromo-2&#39;-deossiuridina (BrdU) è stato utilizzato per etichettare la replicazione del mtDNA in cellule di coltura dei tessuti 7,8. Tuttavia, l&#39;etichettatura BrdU a base di anticorpi presenta diverse limitazioni, soprattutto per tutto il montaggio colorazione dei tessuti. Uno dei principali svantaggi di etichettatura BrdU è che richiede denaturazione del DNA per esporrel&#39;epitopo BrdU, in modo che possa essere rilevato dal anticorpo anti-BrdU. Il campione deve essere trattato in condizioni denaturanti duri quali sostanze chimiche (ad esempio, acido cloridrico o miscele di metanolo e acido acetico), calore o digestione con DNasi che potrebbero interrompere la struttura del campione e complicare la seguente procedura di colorazione 9, 10. Qui, in alternativa timidina analogico 5-etinil-2&#39;-deossiuridina (EdU) viene utilizzato per etichettare il DNA mitocondriale replicare in Drosophila ovaie adulte. Questo metodo è più veloce e altamente sensibile. EdU è facilmente incorporato nel DNA cellulare durante la replicazione del DNA. La seguente rilevamento si basa su una reazione &quot;click&quot;, un Cu (I) -catalyzed reazione covalente tra il gruppo alchino terminale e una azide fluorescente 10. Poiché la reazione non richiede la denaturazione del campione, permette una buona conservazione strutturale. Inoltre, la dimensione di colorante unZide è soltanto 1/500 di quella di una molecola anticorpale 10, che consente la penetrazione veloce ed efficiente dei tessuti tutto il montaggio. Abbiamo usato questo metodo per rilevare la replicazione del mtDNA durante Drosophila oogenesis e ha trovato un modello spaziale sorprendente nella regione germarium di Drosophila dell&#39;ovaio 11, che ci portano a proporre un meccanismo di ereditarietà del mtDNA selettivo replica-dipendente. Presentiamo qui un protocollo dettagliato sull&#39;etichettatura EdU di replicazione del mtDNA in ovaie di Drosophila. Per dimostrare l&#39;applicazione del protocollo, abbiamo provato anche la replicazione del mtDNA in un mtDNA mutante Drosophila (mt: COI T300I) 11, nonché con il trattamento diversificato di uncouplers mitocondriali, che dissipano il potenziale di membrana mitocondriale e potenzialmente interrompono replicazione del mtDNA.

<table><tbody><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s Drosophila medium</td><td>Invitrogen</td><td>21720-024</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10100-147</td><td></td></tr><tr><td>Pair of Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Aphidicolin</td><td>Sigma</td><td>A0781</td><td>Aliquot after dissolving in DMSO. Avoid repetitive thawing and freezing. Protect from light. May be used within 6 weeks after dissolving.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% EM grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Formaldehyde is toxic; it should be handled in a fume hood with skin and eye protection.</td></tr><tr><td>PBS</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3190</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging Kit</td><td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>EdU, CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, Alexa Fluor 488 azide, EdU reaction buffer and Edu buffer additive are included</td></tr><tr><td>Mouse ATP synthase subunit &amp;alpha; antibody, (15H4C4)</td><td>MitoSciences</td><td>Ab14748</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>Mouse Hts antibody (clone RC)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>hts RC</td><td>1:1,000 dilution</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse Alexa Fluor 568 secondary antibody</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslips, #1.5 22 mm x 22 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-103</td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td>Elf</td><td></td><td>Many of the pigments used in nail polishes are fluorescent and leach into specimens. Only clear nail polish should be used.</td></tr></tbody></table>

in situ labeling of mitochondrial dna replication in drosophila adult ovaries by edu staining

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and transmitted from one generation to the next through the female oocyte is of fundamental importance. Because of the genetic tractability, and the elegant, ordered simplicity by which oocyte development proceeds, Drosophila oogenesis has become an invaluable system for mitochondrial study. An EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) labeling method was utilized to detect mitochondrial DNA (mtDNA) replication in Drosophila ovaries. This method is superior to the BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) labeling method in that it allows for good structural preservation and efficient fluorescent dye penetration of whole-mount tissues.
Here we describe a detailed protocol for labeling replicating mitochondrial DNA in Drosophila adult ovaries with EdU. Some technical solutions are offered to improve the viability of the ovaries, maintain their health during preparation, and ensure high-quality imaging. Visualization of newly synthesized mtDNA in the ovaries not only reveals the striking temporal and spatial pattern of mtDNA replication through oogenesis, but also allows for simple quantification of mtDNA replication under various genetic and pharmacological perturbations.

Il protocollo di cui sopra permette la visualizzazione delle strutture puntiformi associate con i mitocondri (Figura 1B-C), che indicano la replicazione del DNA mitocondriale durante Drosophila oogenesis. Il puncta EdU localizzato con mitocondri segnati da macchie di ATP sintetasi subunità alfa (Figura 2). I segnali osservati erano assenti in ovaie trattati con bromuro di etidio 11, un inibitore per la replica mtDNA 14, convalidando che questi puncta effettivamente etichetta replicare mtDNA.Aphidicolin stato usato per inibire la colorazione del DNA nucleare senza influire replicazione del mtDNA (Figura 2). Senza trattamento afidicolina, intensi segnali EdU etichettare i nuclei, e mtDNA puncta erano appena rilevati (Figura 3). Tuttavia, in presenza di afidicolina, incorporazione nucleare fu drasticamente ridotto e sono stati osservati numerosi puncta associati mitocondri. (Figura 1B). Tuttavia, in particolare, la replicazione del mtDNA visualizzato un modello spaziale nel germarium. Come indicato dal numero di EdU puncta, c&#39;è un livello moderato di replicazione del mtDNA nella regione 1 del germarium, ma quasi nessun EdU incorporazione nella regione 2A (Figura 1C). Come la cisti muove verso il basso a regione 2B in germarium, replicazione del mtDNA ripreso e il numero di EdU puncta nella cisti posteriore della regione 2B è molto superiore a quello della regione 2A (Figura 1C). In particolare, intensa incorporazione EdU si è concentrata intorno ai canali ad anello e le strutture fusome, come macchiato dal hu li tai shao proteine ​​(HTS). mtDNA mantenuto replica ad un livello elevato nella regione 3 della germarium (Figura 1C) Per dimostrare l&#39;associazione di specifgeni o il trattamento con la proliferazione mtDNA ic, ovaie Drosophila potrebbero essere sottoposti a manipolazione genetica o di trattamento farmacologico. Abbiamo trattato ovaie con differenti concentrazioni di FCCP, un protonophore mitocondriale classico, che dissipa potenziale di membrana mitocondriale. Come controllo, DMSO non ha effetto sulla replicazione del mtDNA (Figura 4A). Alte dosi di FCCP (10 micron) quasi esaurite replicazione del mtDNA interamente in tutto il germarium (Figura 4D). Tuttavia, la concentrazione più bassa di FCCP (2 o 5 mM) ha avuto un impatto minimo sulla replicazione del mtDNA nella regione 1 ma la replica inibito nelle regioni 2B e 3 (Figura 4B-C), suggerendo regioni 2B e 3 sono più sensibili alle perturbazioni mitocondriale, o mantengono relativi cinetica di replica più lenti. I risultati di cui sopra hanno indicato che la replicazione del DNA mitocondriale è associata con l&#39;attività mitocondriale. In particolare, diverse regioni del germarium risposto diversamente a imp mitocondrialeairment. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig1.jpg" /> Figura 1. replicazione del mtDNA durante Drosophila oogenesis. (A) Schema di un ovariole Drosophila e una vista ingrandita del germarium. Il ovariole illustra da sinistra a destra, anteriore a posteriore, successive fasi di sviluppo di camere di uovo. Nel germarium, il fusome (rosso), le cellule staminali germinali (blu), i mitocondri (verdi), ovocita futuro (linea tratteggiata, riconosciuto dal posizionamento, la struttura fusome e cluster mitocondriali), lo sviluppo di cisti (pesca) e quattro regioni di sviluppo sono mostrati . (B) Rappresentante proiezione z-stack di una wild-type ovariole etichettati da EdU e anticorpi contro HTS-RC, un marker per i canali ad anello e fusome. In presenza di afidicolina, EDU è stata incorporata nel DNA mitocondriale (punte di freccia) e nuclei (frecce). barra della scala, 10 micron.(C) Visualizzazione ingrandita della germaria delineati nella regione scatola in B. Le quattro regioni di sviluppo sono indicati. Barra della scala, 5 micron 11. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54516/54516fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig2.jpg" /> Figura 2. replicazione del mtDNA nel germarium Drosophila visualizzato da Edu incorporazione con trattamento afidicolina (A) -. Sezione confocale rappresentante di un tipo germarium selvaggio che mostra EdU incorporazione (D) (verde, b), i mitocondri, segnata da ATP sintetasi subunità alfa colorazione (rosso, C), e nuclei, marcato con colorazione DAPI (blu, D) con pre-incubazione con DNA polimerasi inibitore-α afidicolina. (A &amp;# 39 ;-D &#39;) un&#39;immagine ingrandita della zona in scatola in (A) mostrando EdU incorporazione (B&#39;), i mitocondri (C &#39;) e nuclei (D&#39;). In presenza di afidicolina, incorporazione nucleare (frecce) si riduce e molti puncta sono stati localizzati all&#39;interno dei mitocondri (punte di freccia). Barre di scala, 10 micron. Il dato è stato modificato da 11. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54516/54516fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig3.jpg" /> Figura 3. replica del DNA mitocondriale è appena rilevato nel germarium Drosophila senza trattamento afidicolina (A) -. (D) Sezione confocale rappresentante di un tipo germarium selvaggio che mostra EdU incorporazione (verde), i mitocondri, segnata daATP sintasi subunità alfa colorazione (rosso), e nuclei, marcato con colorazione DAPI (blu) in assenza del afidicolina DNA polimerasi inibitore-α. &#39;Immagine A ingrandita della zona in scatola in (A) mostra EdU incorporazione (B (A&#39;-D)&#39;), mitocondri (C &#39;) e nuclei (D&#39;). Senza afidicolina, intensi segnali EdU etichetta nuclei (frecce), e mtDNA puncta erano appena rilevati. Barre di scala, 10 micron. Il dato è stato modificato da 11. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54516/54516fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54516/54516fig4.jpg" /> Figura 4. mitocondriale sganciamento danneggia la replicazione del mtDNA. Progetti z-stack rappresentativi mostrano wild-type germarium trattati con DMSO(A) o il FCCP disaccoppiatore mitocondriale a concentrazioni di 2 mM (B), 5 mM (C), 10 mM (D) durante EdU incorporazione. Si noti l&#39;etichettatura EdU alterata nella regione 2B trattati con 2 mM FCCP (B), e in entrambi regione 2B e 3 trattati con 5 micron FCCP (descritto in scatole). Quattro regioni di sviluppo sono mostrati. Frecce, DNA nucleare; punte di freccia, mtDNA. barra della scala, 10 micron. Il dato è stato modificato da 11. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54516/54516fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

In Situ etichettatura di DNA mitocondriale di replica in Drosophila adulti ovaie di Edu colorazione

The mitochondrial genome is inherited exclusively through the maternal line. Understanding of how the mitochondrion and its genome are proliferated and ...

in-situ-labeling-mitochondrial-dna-replication-drosophila-adult

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

In Situ Labeling of Mitochondrial DNA Replication in Drosophila Adult Ovaries by EdU Staining

9.0K Views.  National Institutes of Health. Drosophila oogenesis continues to be exceptionally useful in the study of mitochondrial proliferation and inheritance. This manuscript describes a detailed protocol used to label the replicating mitochondrial DNA (mtDNA) in Drosophila adult ovaries with 5-ethynyl-2´-deoxyuridine (EdU), which facilitates uncovering mechanisms associated with mitochondrial inheritance that were previously debatable.

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Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic region is replicated at a distinct time during S phase through the simultaneous activation of multiple origins of replication. Time of replication (ToR) correlates with many genomic and epigenetic features and is linked to mutation rates and cancer. Comprehending the full genomic view of the replication program, in health and disease is a major future goal and challenge.
This article describes in detail the &#34;Copy Number Ratio of S/G1 for mapping genomic Time of Replication&#34; method (herein called: CNR-ToR), a simple approach to map the genome wide ToR of mammalian cells. The method is based on the copy number differences between S phase cells and G1 phase cells. The CNR-ToR method is performed in 6 steps: 1. Preparation of cells and staining with propidium iodide (PI); 2. Sorting G1 and S phase cells using fluorescence-activated cell sorting (FACS); 3. DNA purification; 4. Sonication; 5. Library preparation and sequencing; and 6. Bioinformatic analysis. The CNR-ToR method is a fast and easy approach that results in detailed replication maps.

We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.

Determinazione genoma a livello di timing di replicazione del DNA dei mammiferi da contenuti di misura

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Ricerca

Genetica

Visualization of Mitochondrial DNA Replication in Individual Cells by EdU Signal Amplification

Mitochondria are key regulators of cellular energy and mitochondrial biogenesis is an essential component of regulating mitochondria numbers in healthy cells1-3. One approach for monitoring mitochondrial biogenesis is to measure the rate of mitochondrial DNA (mtDNA) replication4. We developed a sensitive technique to label newly synthesized mtDNA in individual cells in order to study mtDNA biogenesis. The technique combines the incorporation of 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU)5-7 with a tyramide signal amplification (TSA)8 protocol to visualize mtDNA replication within subcellular compartments of neurons. EdU is superior to other thymidine analogs, such as 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU), because the initial click reaction to label EdU5-7 does not require the harsh acid treatments or enzyme digests that are required for exposing the BrdU epitope. The milder labeling of EdU allows for direct comparison of its incorporation with other cellular markers9-10. The ability to visualize and quantify mtDNA biogenesis provides an essential tool for investigating the mechanisms used to regulate mitochondrial biogenesis and would provide insight into the pathogenesis associated with drug toxicity, aging, cancer and neurodegenerative diseases. Our technique is applicable to sensory neurons as well as other cell types. The use of this technique to measure mtDNA biogenesis has significant implications in furthering the understanding of both normal cellular physiology as well as impaired disease states.

We developed a sensitive technique to label newly synthesized mitochondrial DNA (mtDNA) in individual cells in order to study mtDNA biogenesis. The technique combines the incorporation of EdU together with a tyramide signal amplification (TSA) protocol to visualize mtDNA replication within subcellular compartments of neurons.

Visualizzazione della replicazione del DNA mitocondriale in singole celle da amplificazione del segnale EdU

Mitochondria are key regulators of cellular energy and mitochondrial biogenesis is an essential component of regulating mitochondria numbers in healthy ...

Neuroscienze

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases of the cell cycle, or the incorporation of nucleoside analogs. During S-phase, DNA polymerases incorporate thymidine analogs such as EdU or BrdU into chromosomal DNA, marking the cells for analysis. For C. elegans, the nucleoside analog EdU is fed to the worms during regular culture and is compatible with immunofluorescent techniques. The germline of C. elegans is a powerful model system for the studies of signaling pathways, stem cells, meiosis, and cell cycle because it is transparent, genetically facile, and meiotic prophase and cellular differentiation/gametogenesis occur in a linear assembly-like fashion. These features make EdU a great tool to study dynamic aspects of mitotically cycling cells and germline development. This protocol describes how to successfully prepare EdU bacteria, feed them to wild-type C. elegans hermaphrodites, dissect the hermaphrodite gonad, stain for EdU incorporation into DNA, stain with antibodies to detect various cell cycle and developmental markers, image the gonad and analyze the results. The protocol describes the variations in the method and analysis for the measurement of S-phase index, M-phase index, G2 duration, cell cycle duration, rate of meiotic entry, and rate of meiotic prophase progression. This method can be adapted to study the cell cycle or cell history in other tissues, stages, genetic backgrounds, and physiological conditions.

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

An imaging-based method is described that can be used to identify S-phase and analyze cell cycle dynamics in the C. elegans hermaphrodite germline using the thymidine analog EdU. This method requires no transgenes and is compatible with immunofluorescent staining.

Analisi del ciclo cellulare nella linea germinale di c. elegans con la timidina analogico EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

Biologia dello sviluppo

Quantificazione ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells produce most of their ATP in the mitochondria by oxidative phosphorylation. Mitochondria are unique organelles because they have their own genome that is replicated and passed on to the next generation of cells. In contrast to the nuclear genome, there are multiple copies of the mitochondrial genome in the cell. The detailed study of the mechanisms responsible for the replication, repair, and maintenance of the mitochondrial genome is essential for understanding the proper functioning of mitochondria and whole cells under both normal and disease conditions. Here, a method that allows the high-throughput quantification of the synthesis and distribution of mitochondrial DNA (mtDNA) in human cells cultured in vitro is presented. This approach is based on the immunofluorescence detection of actively synthesized DNA molecules labeled by 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) incorporation and the concurrent detection of all the mtDNA molecules with anti-DNA antibodies. Additionally, the mitochondria are visualized with specific dyes or antibodies. The culturing of cells in a multi-well format and the utilization of an automated fluorescence microscope make it easier to study the dynamics of mtDNA and the morphology of mitochondria under a variety of experimental conditions in a relatively short time.

Autore in primo piano: Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale  

A procedure for studying the dynamics of mitochondrial DNA (mtDNA) metabolism in cells using a multi-well plate format and automated immunofluorescence imaging to detect and quantify mtDNA synthesis and distribution is described. This can be further used to investigate the effects of various inhibitors, cellular stresses, and gene silencing on mtDNA metabolism.

Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Biochimica

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these mechanisms is crucial for developing neural regenerative therapies. Drosophila melanogaster is a leading model for studies of neural development but historically has not been exploited to investigate adult brain regeneration. This is primarily because the adult brain exhibits very low mitotic activity. Nonetheless, penetrating traumatic brain injury (PTBI) to the adult Drosophila central brain triggers the generation of new neurons and new glia. The powerful genetic tools available in Drosophila combined with the simple but rigorous injury protocol described here now make adult Drosophila brain a robust model for neural regeneration research. Provided here are detailed instructions for (1) penetrating injuries to the adult central brain and (2) dissection, immunohistochemistry, and imaging post-injury. These protocols yield highly reproducible results and will facilitate additional studies to dissect mechanisms underlying neural regeneration.

Stimulating and Analyzing Adult Neurogenesis in the Drosophila Central Brain

This article provides detailed protocols for inflicting Penetrating Traumatic Brain Injury (PTBI) to adult Drosophila and examining the resulting neurogenesis.

Stimolare e analizzare la neurogenesi adulta nel cervello centrale della Drosophila

The molecular and cellular mechanisms underlying neurogenesis in response to disease or injury are not well understood. However, understanding these ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

Approcci sperimentale per lo studio mitocondriale localizzazione e funzione di un nucleare di cellule ciclo chinasi, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Biologia

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Studying Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Studiare mitocondriale Struttura e funzione in<em&gt; Drosophila</em&gt; ovaie

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial ...

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell imaging studies. Methods for detecting RNAs have expanded greatly since seminal studies linked site-specific mRNA localization to gene expression regulation. Dynamic mRNA processes can now be visualized via approaches that detect mRNAs, coupled with microscopy set-ups that are fast enough to capture the dynamic range of molecular behavior. The molecular beacon technology is a hybridization-based approach capable of direct detection of endogenous transcripts in living cells. Molecular beacons are hairpin-shaped, internally quenched, single-nucleotide discriminating nucleic acid probes, which fluoresce only upon hybridization to a unique target sequence. When coupled with advanced fluorescence microscopy and high-resolution imaging, they enable one to perform spatial and temporal tracking of intracellular movement of mRNAs. Although this technology is the only method capable of detecting endogenous transcripts, cell biologists have not yet fully embraced this technology due to difficulties in designing such probes for live cell imaging. A new software application, PinMol, allows for enhanced and rapid design of probes best suited to efficiently hybridize to mRNA target regions within a living cell. In addition, high-resolution, real-time image acquisition and current, open source image analysis software allow for a refined data output, leading to a finer evaluation of the complexity underlying the dynamic processes involved in the mRNA&#39;s life cycle.
Here we present a comprehensive protocol for designing and delivering molecular beacons into Drosophila melanogaster egg chambers. Direct and highly specific detection and visualization of endogenous maternal mRNAs is performed via spinning disc confocal microscopy. Imaging data is processed and analyzed using object detection and tracking in Icy software to obtain details about the dynamic movement of mRNAs, which are transported and localized to specialized regions within the oocyte.

Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers

Here, we present a protocol for the visualization, detection, analysis and tracking of endogenous mRNA trafficking in live Drosophila melanogaster egg chamber using molecular beacons, spinning disc confocal microscopy, and open-source analysis software.

Visualizzazione e monitoraggio di mRNA endogeni nelle camere uovo di Drosophila melanogaster dal vivo

Fluorescence-based imaging techniques, in combination with developments in light microscopy, have revolutionized how cell biologists conduct live cell ...

In Situ etichettatura di DNA mitocondriale di replica in Drosophila adulti ovaie di Edu colorazione

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Determinazione genoma a livello di timing di replicazione del DNA dei mammiferi da contenuti di misura

Visualizzazione della replicazione del DNA mitocondriale in singole celle da amplificazione del segnale EdU

Analisi del ciclo cellulare nella linea germinale di c. elegans con la timidina analogico EdU

Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale

Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale

Quantificazione basata su immagini ad alto rendimento della sintesi e della distribuzione del DNA mitocondriale

Stimolare e analizzare la neurogenesi adulta nel cervello centrale della Drosophila

Approcci sperimentale per lo studio mitocondriale localizzazione e funzione di un nucleare di cellule ciclo chinasi, Cdk1

Studiare mitocondriale Struttura e funzione in

Visualizzazione e monitoraggio di mRNA endogeni nelle camere uovo di Drosophila melanogaster dal vivo