Ottenere quantità sufficienti di proteine di membrana per applicazioni a valle rimane una sfida tecnica significativa. Questo protocollo consente la purificazione di diverse proteine di trasporto della membrana all'omogeneità. Un vantaggio chiave di questa tecnica è che Saccharomyces cerevisiae è un sistema di espressione eucariotica a tempo ed economico per proteine di membrana che consente l'ottimizzazione di molte variabili sperimentali chiave.
Inizia inoculando tre colonie di lievito trasformato, in 50 millilitri di mezzo selettivo supplementare completo senza istidina. Integrato con base di azoto di lievito e glucosio al 2% per un'incubazione notturna a 190 rotazioni al minuto e 30 gradi Celsius. Rimuovere le impostazioni cultura il giorno seguente.
Utilizzare uno spettrofotometro per determinare la densità ottica a 600 nanometri o OD 600. E inoculare ciascuno di quattro matrilo da due litri contenente 500 millilitri di mezzo di coltura ad un OD 600 di 0,01. Quindi scuotere le colture a 190 rotazioni al minuto a 30 gradi Celsius per 30 ore per consentire alle cellule di consumare tutto il glucosio e crescere ad alta densità.
Per indurre l'espressione del trasportatore di borato, aggiungere 125 millilitri di mezzo peptone di lievito cinque x, integrato con 10% di galattosio a 190 rotazioni al minuto a 30 gradi Celsius per 16 ore. Quindi raccogliere le cellule di lievito per centrifugazione e rimosogliere il pellet in 100 millilitri di acqua fredda. Ruotare in vortice per rimospendare il pellet di lievito e trasferire serialmente la soluzione per farlo con tutte le bottiglie contenenti pellet.
Per raccogliere le membrane di lievito, in primo luogo, aggiungere 11,25 millilitri di un Tris molare, 0,45 millilitri di EDTA molare 0,5 e 2,25 millilitri di 100 PMSF millimolare alle cellule rimorsidenti. Aggiungere acqua a un volume finale di 225 millilitri e trasferire le cellule in un contenitore perla metallica da 450 millilitri. Completa il volume rimanente con perline di vetro fredde da 0,5 millimetri e assembla la camera di perline con un rotore.
Immergere la camera in un bagno di ghiaccio ed eseguire sei impulsi di un minuto, separati da due periodi di riposo per evitare il surriscaldamento del lisato. Dopo l'ultimo impulso, rimuovere la membrana di filtrazione da un filtro superiore del flacone monouso in plastica avvitato in una bottiglia di vetro e versare il contenuto della camera di perline sull'assieme durante l'applicazione del vuoto. Quindi risciacquare con il tampone di lavaggio delle due x perline aggiungendo alla camera vorticoso e quindi aggiungendo alle perline.
Risciacquare la camera di perline con 225 millilitri di tampone di lavaggio e lavare le perline con il contenuto della camera. Raccogliere il lisato mediante centrifugazione e decantare il supernatante in bottiglie di policarbonato per l'ultracentrifugazione per la raccolta delle membrane. Al termine dell'ultracentrifugazione scartare il supernatante e pesare le bottiglie con i pellet di membrana prima di rimescolare le membrane in circa 35 millilitri di tampone di resopensione della membrana.
Aggiungere le sospensioni a un douncer di vetro, quindi dounce omogeneizzare le membrane un'aliquota dell'omogeneato in un tubo conico da 50 millilitri per una conservazione negativa di 80 gradi Celsius. Pesare le bottiglie di centrifuga vuote per determinare la massa delle membrane raccolte. Per la solubilizzazione e la purificazione delle proteine, aggiungere una barra di agitazione e 150 milligrammi di DDM per grammo di membrana a un becher sul ghiaccio e rimescolare le membrane scongelate ad un volume finale di 15 millilitri di tampone di resopensione della membrana, integrato con un PMSF millimolare e 20 imidazoli millimolari per grammo di membrana.
Aggiungere la soluzione a membrana al becher per un'ora di agitazione in un bagno di ghiaccio. Seguito da centrifugazione per pellet il materiale non solubilizzato. In una stanza fredda di 4 gradi Celsius, filtrare il supernatante attraverso un filtro siringa da cinque micrometri e utilizzare una pompa peristaltica impostata su una portata di un millilitro al minuto per caricare il campione su una colonna di affinità al nichel immobilizzata di un millilitro Quindi lavare la colonna con 10 volumi di colonna di tampone di lavaggio e diluire la proteina in tampone di eluizione.
Raccogliere l'eluato in dieci frazioni millilitri. Eseguire le frazioni di gel preparate raccolte su un gel di pagina SDS tris-glicina da quattro a 20% insieme a frazioni di lisato solubilizzato e lavaggio a temperatura ambiente, tirando il picco raccolto frazioni eluse per la concentrazione a un volume di 500 micro litri o meno in un concentratore di cutoff da 50 kilo datone in una centrifuga da banco a quattro gradi Celsius. Filtrare la proteina concentrata attraverso un filtro a colonna di spin da 0,2 micrometri e iniettare il filtrato su una colonna di esclusione delle dimensioni equilibrata in un tampone S-200.
Dopo aver esato le frazioni di picco su un secondo gel di pagina SDS da quattro a 20%Tris-Glycine, macchiare il gel e raccogliere le frazioni di picco puro per la concentrazione in un concentratore cutoff Daton da 50 chili a quattro gradi Celsius come appena dimostrato. Quindi misurare l'assorbanza del campione proteico a una lunghezza d'onda di 280 nanometri per determinare la concentrazione prima di immagazzinare il campione indefinitamente a -80 gradi Celsius. Per eseguire un saggio di cross-linking glutaraldeide, in primo luogo, aggiungere 0,5 milligrammi per millilitro di proteine scongelate in tre microlitri di tampone S-200 a cinque microlitri di tampone S200.
Completare la reazione di controllo negativo con l'aggiunta di un microlitro di dodecil solfato di sodio al 20% e di un microlitero dell'1,5% di glutaraldeide. Completare i campioni sperimentali con l'aggiunta di un micro litro d'acqua e un micro litro di glutaraldeide all'1,5%. Dopo 30 minuti a temperatura ambiente terminare la reazione con cinque microlitri di 3x SDS pagina gel carico da morire contenente un eccesso di tampone Tris per spegnere la glutaraldeide e caricare tutti i 15 micro litri della soluzione su un gel di pagina 4-20%Tris-Glycine SDS.
Quindi, eseguire il gel a 200 volt per 30 minuti prima della colorazione per determinare l'estensione del reticolare del dimero come evidenziato da una banda che corre a una dimensione doppia del monomero denaturato. Macchiare il gel scuotendo uno shaker orbitale lento con macchie di gel aggiunte al gel. Qui i gel tipici per le frazioni eluse dalla cromatografia di affinità al nichel mostrano tre proteine parzialmente purificate con le frazioni di glisato che non dimostrano una banda significativa corrispondente al trasportatore di borati come previsto per le proteine che non esprimono troppo bene.
La corsia di lavaggio ad millimolare in ogni gel mostra una perdita minima della proteina taggata a dieci istidina nonostante la loro vecchia concentrazione di emettitori relativamente alti. Mentre le bande corrispondenti ai trasportatori di borati sono facilmente visibili nelle frazioni eluse. Prima dell'iniezione di colonna S200, le proteine non sono sufficientemente purificate per molte applicazioni a valle come indicato dalle bande extra in ogni campione.
Dopo la loro iniezione in colonne di esclusione delle dimensioni, tuttavia, si possono osservare frazioni eluse di elevata purezza. Il collegamento incrociato dimostra che i trasportatori omomerici purificati potrebbero avere il loro assemblaggio in soluzione facilmente valutabile con l'entità del collegamento incrociato dipendente dal numero di residui di lisina in prossimità l'uno dell'altro È importante ricordare che una volta iniziata la raccolta cellulare, la proteina deve essere mantenuta sempre fredda. O sul ghiaccio in una stanza di quattro gradi Celsius o in una gastronomia.
Seguendo questa procedura, le proteine della membrana possono essere ulteriormente caratterizzate da metodi biofisici, biochimici o strutturali tra cui la cristallografia a raggi X o la microscopia crioeletnica. Consentendo la purificazione delle quantità di milligrammo di proteine omogenee, queste tecniche sono state utilizzate per determinare la struttura cristallina dell'Arabidopsis thaliana un trasportatore.
