Questa ricerca è stata sostenuta dal Dipartimento per i Premi Veterans Affairs Award di sviluppo professionale 1IK2BX001701, il premio CTSA UL1TR000445 dal Centro Nazionale per l&#39;Avanzamento delle Scienze Traslazionali, il National Science Foundation Award Numbers 1547757 e 1400969 e NIH concede GM05551. Il suo contenuto è esclusivamente responsabile degli autori e non rappresenta necessariamente una visione ufficiale del Centro Nazionale per l&#39;Avanzamento delle Scienze Traslazionali o degli Istituti Nazionali di Salute.

1. Espressione di S100A12 <ol><li> Trasformare le competenti BL21 DE3 con un plasmide pGEMEX-S100a12 utilizzando un protocollo di scossa termica standard 18 . Aggiungere 1 a 5 μL di plasmide a 50 μL di batteri in un tubo di microcentrifuga sul ghiaccio. Incubare per 20 min. </li><li> Scoppio di calore le cellule a 42 ° C per 30 s. </li><li> Incubare le celle sul ghiaccio per 2 min. </li><li> Aggiungere 500 μL di supporti SOC alle cellule. Incubare a 37 ° C con agitazione a 250 giri / min su un agitatore orbitale per 1 h. </li><li> Piastra 150 μL della reazione di trasformazione sul supporto LB-agar (integrato con 100 μg / mL ampicillina). Incubare per 12-16 h a 37 ° C. </li><li> Scegli una colonia. Inoculare 2 mL di LB (integrato con 100 μg / mL ampicillina). </li><li> Incubare per 4-6 h a 37 ° C su un agitatore orbitale (300 rpm). L&#39;OD 600 dovrebbe leggere tra 1-3 unità di assorbanza. </li><li> Aggiungere 500 μl di coltura d&#39;avviamento a 50 ml di autoinduzione ZYM-5052Cazione media 26 integrata con 100 μg / mL di ampicillina. Per una migliore aerazione e massima espressione, utilizzare un pallone Erlenmeyer confuso da 250 mL. Agitare (300 giri / min) per 24 h, a 37 ° C. </li><li> Trasferire la sospensione batterica in un tubo di centrifuga. Pellet le cellule per centrifugazione (4.000 xg, 10 min) a 4 ° C. </li><li> Decantare il supporto, il campione di registro e memorizzare la pasta cellulare a -80 ° C. Il campione è stabile per anni. </li></ol> 2. Purificazione di S100A12 utilizzando la cromatografia a bassa pressione <ol><li> Riposizionare le cellule in 30 mL di 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Sonicare la sospensione sul ghiaccio per lire le cellule. Usare ~ 20 W uscita, 5 s su e 5 s fuori ciclo per 5 min. </li><li> Trasferire la soluzione ai tubi centrifughi ad alta velocità. Chiarire il lisato cellulare per centrifugazione, 20.000 xg per 30 minuti a 4 ° C. </li><li> Decantare il surnatante e trasferire in un bicchiere da 100 ml di polipropilene pulito. Raffreddare la soluzione posando il bicchiere sul ghiaccio. Aggiungete un agitatoreR e aggiungere lentamente 11,20 g di solfato di ammonio. Lasciare agire la soluzione su ghiaccio per altri 1 h. Questo creerà una soluzione al 60% di solfato di ammonio e precipita la maggior parte delle proteine ​​endogene di E. coli . S100A12 resterà solubile. </li><li> Centrifugare la soluzione a 4 ° C, 20.000 xg per 20 minuti per far pelliccare la proteina precipitata. </li><li> Decantare il surnatante e trasferire in tubo di dialisi (MWCO 3.500 kDa). Dializzare contro 1 L di 20 mM Tris, pH 8,0 a 4 ° C. Cambiare due volte il buffer di dialisi. Permettono 4 ore tra le modifiche. </li><li> Cianografia cromatica anionica <ol><li> Eseguire la cromatografia su un sistema a bassa pressione. La portata tipica è di 1 mL / min. </li><li> Equilibrare una colonna di Sepharose da 5 ml con 10 mi di 20 mM Tris, pH 8,0. </li><li> Caricare la ~ 40 mL di soluzione S100A12 utilizzando la pompa di campionamento (raccogliere il flusso attraverso). </li><li> Lavare la colonna con 10 ml di 20 mM Tris, pH 8. </li><li> Sviluppare la colonna con una gradiente 0-30% (BuFfer B è 20 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl) su 19 volumi di colonna (CV, 95 mL). Raccogliere 5 ml di frazioni. </li><li> Prendere un&#39; aliquota di 10 μl di ciascuna frazione e analizzare utilizzando MES SDS PAGE con la colorazione di Coomassie. Eseguire il gel con tensione costante (20 V / cm) per 30 min. </li><li> Frazioni di pool contenenti S100A12. S100A12 funziona a ~ 10 kDa proteina su un gel di denaturazione. </li><li> Frazioni concentrate a 5 mL utilizzando un dispositivo di ultrasuono (MWCO 10 kDa). Centrifugare a 3.000 xg per ~ 8 min. Prendi la frazione superiore. </li></ol></li><li> Cromatografia di esclusione di dimensioni <ol><li> Equilibrare la colonna S75 con 1 CV (120 mL) di 20 mM Tris pH 8, 100 mM NaCl. </li><li> Iniettare &lt;5 mL di frazioni concentrate S100A12 (dalla cromatografia di scambio ionico). </li><li> Sviluppare la colonna con una portata di 1 mL / m su 120 mL. Raccogliere 5 ml di frazioni. </li><li> Prendere un&#39; aliquota di 10 μl di ciascuna frazione e analizzare usando SDS PAGE con la colorazione di Coomassie. Convalida l&#39;identità di proteine ​​utilizzandoWestern blot o spettrometria di massa (massa molecolare calcolata di subunità monomerica 10.575.0 Da, misurata 10575.4 Da). </li></ol></li><li> Frazioni di pool <ol><li> Misurare l&#39;assorbanza della proteina A 280 utilizzando uno spettrofotometro. Utilizzare il buffer SEC come un vuoto. Il coefficiente di estinzione calcolato per l&#39;omodimero S100A12 è di 5960 M -1 cm -1 . NOTA: Le rese tipiche sono 35-45 mg di S100A12 per 50 ml di coltura. </li><li> Aliquot S100A12 in 1,5 mL di microcentrifuga (1 mg / tubo), congelare in azoto liquido e conservare a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Analisi di attività antimicrobiche <ol><li> Streak H. pylori ceppo G27 su piatti triplici di agar di soia integrati con 5% di sangue di pecora (piastre agarico di sangue). Crescere 2-3 giorni a 37 ° C in aria ambiente integrata con 5% di anidride carbonica. </li><li> Inoculare H. pylori nel brodo Brucella integrato con 1x colesterolo. Cultura oltreScuotendo la notte (250 rpm) a 37 ° C in aria ambiente integrata con 5% di anidride carbonica. </li><li> Diluire H. pylori 1:10 in brodo Brucella al 50%, 50% tampone di calprotectina più 1x colesterolo e coltura in mezzo solo o integrato con 100 μM cloruro di zinco più 0, 100 o 1.000 μg / mL di S100A12 purificato. La cultura si scuota durante la notte (250 rpm) a 37 ° C in aria ambiente integrata con il 5% di anidride carbonica. </li><li> Il giorno successivo, eseguire le diluizioni e la piastra seriali sulle piastre di agar sangue. Lasciare colonie batteriche a crescere per 2-3 giorni a 37 ° C in aria ambiente integrata con 5% di anidride carbonica. Enumerare le unità formanti colonia per calcolare la crescita batterica in presenza o in assenza di S100A12 e / o di zinco esogeno. </li></ol>

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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloperoxidase-dependent+lipid+peroxidation+promotes+the+oxidative+modification+of+cytosolic+proteins+in+phagocytic+neutrophils.">Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils.</a> J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Viene presentato un protocollo efficiente sia per l&#39;espressione che per la purificazione dell&#39;uomo S100A12. Il sistema di espressione E. coli è lo strumento più comune per la produzione di proteine ​​ricombinanti, in particolare quando sono necessari quantitativi di mg per studi biochimici e biofisici. Un valorizzazione chiave della procedura qui descritta è l&#39;uso di mezzi autoinduttivi 26 che aumentano la resa della proteina purificata di un fattore di quasi trenta rispetto all&#39;espressione con i supporti Luria-broth standard 18 . Inoltre, i mezzi auto-induzione semplificano notevolmente il flusso di lavoro di espressione di proteine. Utilizzando mezzi di crescita convenzionali, le colture devono essere monitorate in modo continuo in modo che un agente induttivo possa essere aggiunto durante la fase di crescita esponenziale. Non è necessario monitorare i tempi di raddoppiamento quando si utilizzano supporti autoinduttivi. Le culture sono autorizzate a crescere fino alla saturazione. Durante le fasi iniziali di crescita con auto-inductiSul supporto, E. coli usa il glucosio come fonte di carbonio. Una volta che il glucosio è esaurito, i batteri passano al lattosio come fonte di carbonio che induce l&#39;espressione proteica 26 . La composizione dei mezzi di auto-induzione è perfettamente sintonizzata per consentire la crescita di colture ad alta densità e quindi una maggiore espressione di proteine ​​ricombinanti. Nella nostra esperienza con S100A12, i mezzi di auto-induzione aumentano notevolmente la quantità di proteine ​​espresse, tuttavia citiamo che questo possa essere dipendente dalla proteina e dovrebbe essere verificato sperimentalmente. S100A12 è espresso nella frazione citoplasmatica di E. coli che suggerisce che sia solubile e ben piegato. La prima fase della purificazione comporta l&#39;aggiunta di una percentuale elevata di solfato di ammonio che precipita molte delle proteine ​​endogene di E. coli . Questo passo sfrutta l&#39;elevata stabilità e la solubilità della famiglia di proteine ​​S100. S100A12 è moderatamente acido (pI 5.81). Così S100A12 viene purificato ulteriormente con una forte resina di scambio di anioni. L&#39;ultima fase del processo di purificazione è una colonna di cromatografia di esclusione di dimensioni che assicura che S100A12 sia monodispersa e dimerica. Questa fase del protocollo è cruciale poiché S100A12 è stato dimostrato di formare oligomeri solubili 15 e non è noto che cosa influenza l&#39;oligomerizzazione può avere sulla sua attività antimicrobica. Poiché i membri della classe S100 condividono l&#39;alta sequenza e l&#39;omologia strutturale, le loro proprietà fisiche sono simili 27 . Quindi questo metodo di purificazione di S100A12 può essere generalmente applicabile a tutte le proteine ​​S100 che sono espresse nella frazione solubile di E. coli. Precedenti lavori hanno dimostrato che le proteine ​​S100, come la calprotectina, hanno un&#39;attività antimicrobica contro gli agenti patogeni batterici come H. pylori e che questa attività dipende dall&#39;attività di legame di zinco 25 . L&#39;antimicrobL&#39;attività di S100A12 è anche dipendente da zinco, ma l&#39;inibizione della crescita dimostrata nei test di crescita batterica rivela che è necessariamente più S100A12 per inibire la crescita rispetto ad altre proteine ​​della famiglia S100 come la calprotectina. Pertanto, è fondamentale utilizzare concentrazioni superiori di S100A12 rispetto alla calprotectina per ottenere fenotipi simili (inibizione della crescita o alterazioni della virulenza). Le applicazioni future di questo protocollo potrebbero essere applicate per determinare le variazioni globali nell&#39;espressione genica batterica, alterazioni metabolomiche o proteomiche in risposta al sequestro metallico imposto da S100A12.

Le proteine ​​S100 sono una classe della famiglia EF di proteine ​​legate al calcio con una varietà di funzioni 1 . Essi vengono espressi in maniera specifica per tessuti e cellule e regolano un ampio spettro di funzioni cellulari 2 , 3 . Uniche alle proteine ​​legate al calcio, le proteine ​​S100 presentano sia funzioni intracellulari che extracellulari 4 , 5 . All&#39;interno della cellula, il legame Ca 2+ induce un cambiamento conformazionale che espone una superficie idrofobica che specifica targeting partner legati alla proteina 6 . Questo meccanismo intracellulare regola processi importanti come la proliferazione cellulare, la differenziazione e il metabolismo energetico. Nell&#39;ambiente extracellulare, le proteine ​​S100 presentano due funzioni 7 . In uno, agiscono come proteine ​​del modello molecolare associate a danni (DAMP) e iniziano un pro-inflammRisposta immunitaria atorica attraverso l&#39;interazione con i recettori di riconoscimento del pattern 8 , 9 . Inoltre, diversi membri dei metalli di transizione sequenziali delle proteine ​​S100, una funzione che serve a morire di fame gli agenti patogeni microbiali in un processo chiamato immunità nutrizionale 10 , 11 . S100A12 (noto anche come calgranulina C e EN-RAGE) è altamente espresso in macrofagi e neutrofili ed è stato identificato come potenziale biomarker per le malattie infiammatorie 12 , 13 . Oltre a legare il calcio nei suoi siti EF-Hand, S100A12 presenta due siti di rilascio di metallo di transizione ad alta affinità situati alle estremità opposte dell&#39;interfaccia dimerica 14 , 15 . Ogni sito di legame è costituito da tre residui di istidina e un residuo di acido aspartico e può chelare zinco o rameSup class = &quot;xref&quot;&gt; 16 , 17 . Recentemente, abbiamo riportato che la fame di zinco dipendente da S100A12 è importante per la regolazione della crescita di Helicobacter pylori e l&#39;attività dei fattori di virulenza pro-infiammatoria 18 . H. pylori infetta lo stomaco di circa la metà della popolazione umana del mondo; Rendendo probabilmente uno dei patogeni batterici più riusciti 19 . L&#39;infezione con H. pylori può portare a risultati significativi della malattia gastrica, tra cui gastrite, ulcera peptica e duodenale, linfoma associato a linfoma associata alla mucosa (MALT) e adenocarcinoma gastrico invasivo (tumore dello stomaco). Il cancro allo stomaco è la causa principale della morte associata a cancro non cardiaca nel mondo e il più grande fattore di rischio associato per il cancro allo stomaco è l&#39;infezione da H. pylori . H. pylori persiste nella nicchia gastrica nonostante un robuSt rispondendo alla risposta immunitaria al patogeno sottolineando la necessità di una migliore comprensione dei meccanismi immunitari di controllo di questa infezione batterica 20 , 21 , 22 , 23 . L&#39; infiammazione associata a H. pylori è caratterizzata da una profonda infiltrazione di cellule polimorfonucleari, o neutrofili, che depositano un repertorio di proteine ​​antimicrobiche, tra cui S100A12, nel sito dell&#39;infezione 18 , 24 , 25 . Nel tentativo di comprendere il complesso dialogo tra host e agenti patogeni, abbiamo cercato di perfezionare la tecnica per purificare S100A12 e utilizzarlo per studiare l&#39;effetto antimicrobico che esercita su questo patogeno medico rilevante. Il protocollo sottostante descrive una tecnica migliorata per la purificazione del S100A12 nel suo stato biologicamente attivo; Capace di legare metalli nutrienti ad alta affiniChe li ha allontanati dai microrganismi invasori. Inoltre, i metodi sottostanti evidenziano l&#39;utilità di questa proteina come reagente critico per studiare il meccanismo in base alle quali le innate molecole antimicrobiche restringono la crescita di patogeni batterici. Le proteine ​​della famiglia S100A hanno guadagnato l&#39;apprezzamento come un importante gruppo di molecole innate del sistema immunitario che partecipano al segnalamento immunitario e alla difesa dell&#39;ospite 27 . Il più ben studiato di questi è la calprotectina (MRP-8/14, calgranulina A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . La calprotectina è una proteina associata a neutrofili che forma un eterodimero delle sottounità S100A8 e S100A9 che lega i metalli di transizione all&#39;interfaccia dimerica 31 . La calprotectina ha dimostrato di possedere due siti di legame metallico: il sito 1 può legare Zn 2+ , Mn 2+ o Fe 2+ e il sito 2 può<html> Lega Zn 2+ 31 , 32 . Numerose relazioni hanno dimostrato che la calprotectina ha attività antimicrobiche contro diversi agenti patogeni tra cui Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli e H. pylori e che gli effetti inibitori sono dovuti all&#39;attività di chelazione metallica della calprotectina 25,28 , 29 . Il lavoro precedente ha dimostrato che la calprotectina esercita numerose attività su H. pylori, tra cui alterare la struttura lipidica A nella membrana esterna, reprimendo il sistema di secrezione cag -Type IV (che è un fattore importante della virulenza di proinfiammazione all&#39;interno di H. pylori ), inducendo la formazione del biofilm e reprimendo La crescita e la vitalità di H. pylori in modo dose-dipendenteClass = &quot;xref&quot;&gt; 25 , 33 . Inoltre, i test genetici e biochimici hanno rivelato l&#39;attività antibatterica della calprotectina contro H. pylori è stata in gran parte derivata dalla sua capacità di legare lo zinco nutrizionale 25 . H. pylori richiede lo zinco, come è stato determinato dalla ricerca precedente che ha utilizzato un mezzo chimicamente definito per accertare i requisiti micronutrienti per questo patogeno per crescere e proliferare 34 . Inoltre, la calprotectina era altamente abbondante nei tessuti H. pylori- infettati e associata a infiltrati neutrofili, indicando che l&#39;ospite può impiegare calprotectina come strategia antimicrobica durante l&#39;infezione e successiva infiammazione 25 , 35 . Recenti evidenze da tecniche di screening proteomiche impareggiabili suggeriscono che in condizioni in cui le specie reattive di ossigeno sono abbondanti, calprotecLa stagna subisce modificazioni post-traslazionali che alterano il sito di legame ad esa-istidina, inibendo così l&#39;attività legante del metallo della proteina 36 . Come tale, abbiamo ipotizzato che altre proteine ​​della famiglia S100A tra l&#39;ampio repertorio di queste molecole potrebbero potenzialmente agire come chelatori metallici ausiliari. Abbiamo selezionato S100A12 per ulteriori studi perché non è stato identificato nello schermo di cui sopra per la modifica post-traslatoria, ha la capacità di legare lo zinco ed è altamente abbondante nei tessuti umani derivanti da individui infetti da H. pylori . Il nostro lavoro indica che S100A12 può inibire la crescita e la vitalità di H. pylori in maniera dose-dipendente nel ceppo G27 di H. pylori e che l&#39;attività antimicrobica di questa proteina può essere invertita con l&#39;aggiunta di zinco in eccesso di nutrienti. Questo lavoro completa il nostro precedente lavoro che indica l&#39;attività antimicrobica S100A12 contro PMSS1 e 7.13 ceppi di H. pylori , dimostrando la sua vasta attività antibatterica contro numerosi isolati clinici e ceppi adattati al laboratorio di H. pylori 18 . Insieme, questi risultati confermano l&#39;importanza di S100A12 come meccanismo di controllo della crescita batterica e della proliferazione attraverso l&#39;immunità nutrizionale. Studi futuri di questa importante interazione batterica possono includere lo sfruttamento dell&#39;attività di S100A12 per ridurre il carico batterico nei tessuti dell&#39;host, o determinare il contributo di questa proteina alla segnalazione immunitaria nel contesto dell&#39;infezione da H. pylori .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>S100A12 Expression</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expression cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL 21 (DE3) competent cells</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C25271</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoinduction medium components</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>Y20020-250.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23020-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60060-250.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeCl3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2877</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>M65240-100.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S23100-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>P41200-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A20424-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2SO4</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>S25150-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G22020-1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>G32040-500.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2643</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Selection agent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>A40040-5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100A12 Purification</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA Start Chromatography System</td>
			<td>GE</td>
			<td>29-220-94</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiTrap Q Sepharaose Fast Flow</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-5156-01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiPrep 16/60 S-200 HR</td>
			<td>GE</td>
			<td>17-1166-01</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop lite spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Research Products International</td>
			<td>T60040-1000.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H. pylori Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood agar plates</td>
			<td>Lab Supply Company</td>
			<td>BBL221261</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brucella broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B3051</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol (250X)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12531018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>793566</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, purification, and antimicrobial activity of s100a12

Le proteine ​​di Calgranulina sono importanti mediatori dell&#39;immunità innata e sono membri della classe S100 della famiglia EF di proteine ​​legate al calcio. Alcune proteine ​​S100 hanno la capacità di legare i metalli di transizione con elevata affinità e di bloccarli in modo efficace dagli invasori di patogeni microbici in un processo chiamato &quot;immunitario nutrizionale&quot;. S100A12 (EN-RAGE) lega sia lo zinco che il rame ed è altamente abbondante nelle cellule immunitarie innate come macrofagi e neutrofili. Riconosciamo un metodo raffinato per l&#39;espressione, l&#39;arricchimento e la purificazione di S100A12 nella sua attiva configurazione metallica. L&#39;utilizzo di questa proteina in analisi della crescita batterica e della vitalità rivela che S100A12 ha un&#39;attività antimicrobica contro il patogeno batterico , Helicobacter pylori . L&#39;attività antimicrobica è basata sull&#39;attività di legame di zinco di S100A12, cheelato lo zinco nutritivo, affamando così H. pylori che richiede zinco per la crescita e proliferation.

S100A12 espressione e purificazione Una depurazione a tre fasi ha prodotto ~ 40 mg di S100A12 ricombinante da 50 ml di coltura batterica. Il primo passo era una precipitazione di solfato di ammonio di proteine ​​endogene di E. coli . Questa fase è stata seguita da una cromatografia di anion-exchange ( figura 1A ). La proteina è tracciata da una SDS-PAGE macchiata con Coomassie Brilliant Blue ( figura 1B ). L&#39;ultima fase della procedura di purificazione comprendeva le frazioni di raccolta contenenti S100A12 per la cromatografia di esclusione di dimensioni che separa le proteine ​​dal peso e dalla forma molecolare ( Figura 2A ). S100A12 è un omodimero (92 aminoacidi per subunità) e ha un peso molecolare complessivo di circa 21 kDa. Le frazioni raccolte dalla cromatografia di esclusione di dimensioni sono state analizzate mediante SDS-PAGE e visualizzate mediante colorazione di Coomassie ( figura 2B </strong&gt;). S100A12 reprime la crescita batterica attraverso l&#39;attività di chelation della zinco Per studiare l&#39;attività antimicrobica di S100A12, le analisi della vitalità batterica sono state eseguite mediante tecniche di coltura microbiologica quantitativa ( Figura 3 ). L&#39;enumerazione delle cellule batteriche rivela che l&#39;esposizione a 100 μg / mL di S100A12 in presenza o in assenza di una fonte esogena di zinco nutrizionale non inibisce in modo significativo la vitalità batterica rispetto ai controlli senza aggiunta di S100A12 (P&gt; 0,05, ANOVA a senso unico). Tuttavia, l&#39;esposizione a 1000 μg / mL di S100A12 in mezzo solo comporta una diminuzione del 69% rispetto alla sola media (P = 0.0193, Student&#39;s t Test, P&gt; 0.05 One Way ANOVA); Un risultato che è stato invertito con l&#39;aggiunta di una fonte esogena di zinco nutrizionale (P = 0.023, Student&#39;s t Test). Questi risultati deMonstrare l&#39;attività antimicrobica di S100A12 dipende dalla sua attività di sequestro di zinco. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55557/55557fig1.jpg" /> Figura 1: Lysis cellulare e purificazione di S100A12 mediante cromatografia di anion exchange . ( A ) Chromatogramma della depurazione delle scambi di ioni. Traccia di assorbanza UV a 280 nm mostrato in blu, gradiente di sale raffigurato in rosa, frazioni raccolte segnate in rosso. ( B ) SDS PAGE gel di passi di purificazione. Lunghezze: 1) peso molecolare 2) frazioni di lisato solubile 3) pellet di ammonio solfato 4) supernatante di ammonio solfato 5-14) frazioni di cromatografia Q 6-15. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55557/55557fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" srC = &quot;/ files / ftp_upload / 55557 / 55557fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2: Risultati di cromatografia di esclusione di dimensione della purificazione di S100A12. ( A ) Cromatogramma dei risultati di esclusione di dimensioni. Tracce di assorbanza UV a 280 nm mostrate in blu, frazioni raccolte segnate in rosso. ( B ) SDS PAGE gel di cromatografia di esclusione di dimensioni. Lunghezze: 1) marker di peso molecolare 2) carico campione 3-15) frazioni 10-21. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55557/55557fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55557/55557fig3.jpg" /> Figura 3: Analisi della cultura quantitativa della vitalità batterica in risposta all&#39;esposizione alla chelazione zinco-dipendente S100A12. I batteri sono stati esposti a 0, 100 o 100 μg / mL di S100A12 in sola media (barre grigie), o mezzo aggiunto con cloruro di zinco da 100 μM(Barre nere). L&#39;esposizione a 1.000 μg / mL in assenza di una sorgente esogena di zinco nutriente determina una inibizione significativa della vitalità batterica (* P &lt;0.05, test t dello studente rispetto allo stato medio + zinco). <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55557/55557fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Qui, presentiamo un metodo per esprimere e purificare S100A12 (calgranulina C). Descriviamo un protocollo per misurare la sua attività antimicrobica contro il patogeno umano H. pylori .

Espressione, purificazione e attività antimicrobica di S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

expression-purification-and-antimicrobial-activity-of-s100a12

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Video: Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

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This manuscript describes how to screen for thermostabilizing mutations, purify the human serotonin transporter, generate high affinity antibodies, and crystallize the serotonin transporter-antibody complex bound to the antidepressant drug S-citalopram. This protocol can be adapted to the study of other challenging membrane transporters, receptors, and channels.

Thermostabilization, Espressione, purificazione e cristallizzazione della umana trasportatore della serotonina associato a<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

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Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

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Espressione e purificazione dei canali ionici di mammiferi Bestrophin

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a chemical defense because it has antimicrobial activity and is considered a natural insecticide. Caffeine can also produce negative allelopathic effects that prevent the growth of surrounding plants. In addition, people around the world consume caffeine for its analgesic and stimulatory effects. Due to interest in the technological applications of caffeine, research on the biosynthetic pathway of this compound has grown. These studies have primarily focused on understanding the biochemical and molecular mechanisms that regulate the biosynthesis of caffeine. In vitro tissue culture has become a useful system for studying this biosynthetic pathway. This article will describe a step-by-step protocol for the quantification of caffeine and for measuring the transcript levels of the gene (CCS1) encoding caffeine synthase (CS) in cell suspensions of C. arabica L. as well as its activity.

This protocol describes an efficient methodology for the extraction and quantification of caffeine in cell suspensions of C. arabica L. and an experimental process for evaluating the enzymatic activity of caffeine synthase with the expression level of the gene that encodes this enzyme.

Estrazione di caffeina, l'attività enzimatica e l'espressione genica della sintasi di caffeina da sospensioni di cellule vegetali

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic purification methods. This manuscript illustrates the technical details involved in the anaerobic purification process, including the preparation of buffers and reagents, the methods for column chromatography in a glove box, and the desalting of the protein prior to kinetics. Also described are the methods for preparing and using an oxygen electrode to perform kinetic characterization of an oxygen-utilizing enzyme. These methods are illustrated using the dioxygenase enzyme DesB, a gallate dioxygenase from the bacterium Sphingobium sp. strain SYK-6.

Here we present a protocol for anaerobic protein purification, anaerobic protein concentration, and subsequent kinetic characterization using an oxygen electrode system. The method is illustrated using the enzyme DesB, a dioxygenase enzyme which is more stable and active when purified and stored in an anaerobic environment.

Purificazione della proteina anaerobica e analisi cinetica tramite elettrodo di ossigeno per lo studio di inibizione e attività di Dioxygenase di Giuroma90

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

Espressione e purificazione di TRPC3 la scanalatura del catione del lipido sensibili umani per determinazione strutturale di singola particella cRIO-microscopia elettronica

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also known as Band 3), the most abundant membrane protein in the red blood cells. The SLC4 family is homologous with borate transporters, which have been characterized in plants and fungi. It remains a significant technical challenge to express and purify membrane transport proteins to homogeneity in quantities suitable for&#160;structural or functional studies. Here we describe detailed procedures for the overexpression of borate transporters in Saccharomyces cerevisiae, isolation of yeast membranes, solubilization of protein by detergent, and purification of borate transporter homologs from S. cerevisiae, Arabidopsis thaliana, and Oryza sativa. We also detail a glutaraldehyde cross-linking experiment to assay multimerization of homomeric transporters. Our generalized procedures can be applied to all three proteins and have been optimized for efficacy. Many of the strategies developed here can be utilized for the study of other challenging membrane proteins.

Here we present a protocol to express, solubilize, and purify several eukaryotic borate transporters with homology to the SLC4 transporter family using yeast. We also describe a chemical cross-linking assay to assess the purified homomeric proteins for multimeric assembly. These protocols can be adapted for other challenging membrane proteins.

Espressione, solubilizzazione e purificazione dei trasportatori eucariotiche borato

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, fluorophores are prone to loss of signal via photobleaching by dissolved oxygen (O2). To prevent photobleaching and extend the fluorophore lifetime, oxygen scavenging systems (OSS) are employed to reduce O2. Commercially available OSS may be contaminated by nucleases that damage or degrade nucleic acids, confounding interpretation of experimental results. Here we detail a protocol for the expression and purification of highly active Pseudomonas putida protocatechuate-3,4-dioxygenase (PCD) with no detectable nuclease contamination. PCD can efficiently remove reactive O2 species by conversion of the substrate protocatechuic acid (PCA) to 3-carboxy-cis,cis-muconic acid. This method can be used in any aqueous system where O2 plays a detrimental role in data acquisition. This method is effective in producing highly active, nuclease free PCD in comparison with commercially available PCD.

Protocatechuate 3,4-dioxygenase (PCD) can enzymatically remove free diatomic oxygen from an aqueous system using its substrate protocatechuic acid (PCA). This protocol describes the expression, purification, and activity analysis of this oxygen scavenging enzyme.

Espressione e purificazione di Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Diossigenasi

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.