השגת כמויות מספיקות של חלבוני קרום עבור יישומים במורד הזרם נשאר אתגר טכני משמעותי. פרוטוקול זה מאפשר טיהור של מספר חלבונים הובלת קרום הומוגניות. יתרון מרכזי של טכניקה זו הוא כי Saccharomyces cerevisiae היא מערכת ביטוי אוקריוטי זמן וחסכונית עבור חלבוני קרום המאפשר אופטימיזציה של משתנים ניסיוניים מרכזיים רבים.
התחל על ידי חינוך שלוש מושבות שמרים שהשתנו, ב 50 מיליליטר של מדיום סלקטיבי משלים משלים ללא היסטידין. בתוספת בסיס חנקן שמרים ו 2% גלוקוז עבור דגירה לילה ב 190 סיבובים לדקה ו 30 מעלות צלזיוס. הסר את התרבות למחרת.
השתמש ספקטרופוטומטר כדי לקבוע את הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר או OD 600. ולחסן כל אחד מארבעה בקבוקים שני ליטר המכיל 500 מיליליטר של תרבות בינונית ל OD 600 של 0.01. ואז לנער את התרבויות ב 190 סיבובים לדקה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 30 שעות כדי לאפשר לתאים לצרוך את כל הגלוקוז לגדול לצפיפות גבוהה.
כדי לגרום לביטוי טרנספורטר בוראט, להוסיף 125 מיליליטר של חמישה x שמרים פפטונה בינוני, בתוספת 10% גלקטוז ב 190 סיבובים לדקה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. ואז לקצור את תאי השמרים על ידי צנטריפוגה ולתלות מחדש את גלולה ב 100 מיליליטר של מים קרים. מערבולת במערבולת כדי להשתמש מחדש את גלולת השמרים ולהעביר באופן סדרתי את הפתרון לעשות זאת עם כל הבקבוקים המכילים כדורי.
כדי לקצור את קרום השמרים, ראשית, להוסיף 11.25 מיליליטר של טריס טוחן אחד, 0.45 מיליליטר של EDTA טוחן 0.5 ו 2.25 מיליליטר של 100 PMSF מילימולרית לתאים המתווכים מחדש. מוסיפים מים לנפח סופי של 225 מיליליטר ומעבירים את התאים למיכל מכות חרוז מתכת 450 מיליליטר. העליון את הנפח הנותר עם 0.5 מילימטר קר גם חמוזי זכוכית ולהרכיב את תא חרוזים עם רוטור.
לטבול את התא באמבט קרח ולבצע שישה פולסים של דקה אחת, מופרדים על ידי שתי דקות מנוחה כדי למנוע התחממות יתר של lysate. לאחר הדופק האחרון, להסיר את קרום הסינון ממסנן פלסטיק חד פעמי בקבוק העליון דפק לתוך בקבוק זכוכית ויוצקים את התוכן של תא חרוזים חרוזים על ההרכבה תוך החלת ואקום. לאחר מכן לשטוף עם שני חיץ לשטוף חרוזים x על ידי הוספת לתא מסתחרר ולאחר מכן הוספת חרוזים.
שוטפים את תא חרוזים עם 225 מיליליטר של חיץ לשטוף ולשטוף את חרוזים עם התוכן של התא. לאסוף את lysate על ידי צנטריפוגה ו decant supernatant לתוך בקבוקי פוליקרבונט עבור אולטרהצנטריפוגה לאיסוף של הממברנות. בסוף ultracentrifugation להשליך את supernatant ולשקול את הבקבוקים עם כדורי קרום לפני resuspending הממברנות בכ 35 מיליליטר של חיץ resuspension קרום.
מוסיפים את המתלים לזכוכית Douncer, ואז Dounce הומוגניזציה הממברנות aliquot הומוגנית לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר עבור אחסון שלילי 80 מעלות צלזיוס. שקלו את בקבוקי הצנטריפוגה הריקים כדי לקבוע את המסה של הממברנות שנקטפו. עבור מינון חלבון וטיהור, מוסיפים בר ערבוב ו 150 מיליגרם של DDM לגרם של קרום לתוך מקור על קרח resuspend את הממברנות המופשרות לנפח סופי של 15 מיליליטר של חיץ ממברנה resuspension, בתוספת אחד מילימול PMSF ו 20 מילימולרים imidazoles לכל גרם של ממברנה.
מוסיפים את תסכול הממברנה לפקעת במשך שעה של ערבוב באמבט קרח. ואחריו צנטריפוגה כדי גלולה החומר שאינו מנוון. בחדר קר 4 מעלות צלזיוס, לסנן את supernatant דרך מסנן מזרק חמישה מיקרומטר ולהשתמש במשאבה peristaltic להגדיר קצב זרימה של מיליליטר אחד לדקה כדי לטעון את המדגם על עמודת זיקה ניקל משותק מיליליטר אחד ולאחר מכן, לשטוף את העמוד עם 10 כרכים עמודה של חיץ לשטוף ולדלל את החלבון במאגר אלוט.
אוסף את ההתרומם בעשרה שברים מיליליטר אחד. הפעל את שברי הג'ל המוכנים שנאספו על ג'ל דף טריס-גליצין SDS של 4 עד 20%, יחד עם ליזט מנוצל ושברים בטמפרטורת החדר, ומשך את הפסגה שנאספה שברים חמקו לריכוז לנפח של 500 מיקרו ליטר או פחות בריכוז ניתוק דלטון של 50 קילו בצנטריפוגה על ספסל בארבע מעלות צלזיוס. מסננים את החלבון המרוכז באמצעות מסנן עמודת ספין 0.2 מיקרומטר ומזריקים את הסינון לעמודת אי-הכללה בגודל המוציידת במאגר S-200.
לאחר הפעלת שברי השיא על ג'ל דף SDS טריס-גליצין 4 עד 20%, להכתים את הג'ל ולאסוף את שברי השיא הטהורים לריכוז במרכז ניתוק דלתון 50 קילו בארבע מעלות צלזיוס כפי שהודגם רק. לאחר מכן למדוד את הספיגה של דגימת החלבון באורך גל 280 ננומטר כדי לקבוע את הריכוז לפני אחסון המדגם ללא הגבלת זמן ב 80 מעלות צלזיוס שלילי. כדי לבצע בדיקה חוצה קישור glutaraldehyde, הראשון, להוסיף 0.5 מיליגרם למיליליטר של חלבון מופשר בשלושה microliters של חיץ S-200 לחמישה microliters של חיץ S200.
השלם את תגובת הבקרה השלילית עם תוספת של מיקרוליטר אחד של 20% נתרן דודיצל סולפט ומיקרוליטר אחד של 1.5% גלוטארלדהיד. השלם את הדגימות הניסיוניות בתוספת מיקרו ליטר מים אחד ומיקרו ליטר אחד של 1.5% גלוטארלדהיד. לאחר 30 דקות בטמפרטורת החדר לסיים את התגובה עם חמישה microliters של 3x SDS דף ג'ל טעינה למות המכיל עודף של חיץ טריס כדי להתרווה glutaraldehyde ולדעון את כל 15 מיקרו ליטרים של הפתרון על ארבעה עד 20% טריס-גליצין SDS דף ג'ל.
לאחר מכן, להפעיל את הג'ל ב 200 וולט במשך 30 דקות לפני הכתם כדי לקבוע את היקף עמעום ההצלבה כפי שמוצג על ידי רצועה הפועלת בגודל כפול של מונומר denatured. מכתימים את הג'ל על ידי טלטול על שייקר מסלולי איטי עם כתם ג'ל שנוסף לג'ל. כאן ג'לים טיפוסיים עבור שברים חמק מן כרומטוגרפיה זיקה ניקל להראות שלושה חלבונים מטוהרים חלקית עם שברי ליזאט לא מדגים רצועה משמעותית המתאימה טרנספורטר בוראט כצפוי עבור חלבונים כי לא מעל להביע היטב.
נתיב הכביסה של מילימולר המודעות בכל ג'ל מראה אובדן מינימלי של עשרת החלבונים המתויגים בהיסטידין למרות הריכוז הישן של פולטיהם הגבוהים יחסית. בעוד הלהקות המתאימות למשגרים הבוראטים ניכרות בקלות בשברים שחמקו. לפני הזרקת עמודת S200, החלבונים אינם מטוהרים מספיק עבור יישומים רבים במורד הזרם כפי שצוין על ידי הרצועות הנוספות בכל דגימה.
לאחר הזריקה שלהם לתוך עמודות הדרת גודל עם זאת, שברים חמק של טוהר גבוה ניתן לראות. Crosslinking מדגים כי המשגרים הומומרי מטוהרים יכול להיות הרכבה שלהם בפתרון מוערך בקלות עם היקף ההצלבה להיות תלוי במספר שאריות ליזין בסמיכות זה לזה חשוב לזכור כי לאחר קצירת התא מתחיל, החלבון חייב להישמר קר בכל עת. או על קרח בחדר של ארבע מעלות צלזיוס או במעדנייה.
בעקבות הליך זה, חלבוני הממברנה יכולים להיות מאופיינים עוד יותר בשיטות ביופיזיות, ביוכימיות או מבניות כולל קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית. על ידי הפעלת טיהור כמויות מיליגרם של חלבון הומוגני, טכניקות אלה שימשו כדי לקבוע את מבנה הגביש של thaliana Arabidopsis אחד טרנספורטר.
