A obtenção de quantidades suficientes de proteínas de membrana para aplicações a jusante continua sendo um desafio técnico significativo. Este protocolo permite a purificação de várias proteínas de transporte de membrana para a homogeneidade. Uma das principais vantagens dessa técnica é que o Saccharomyces cerevisiae é um sistema de expressão eucariótica de tempo e custo-benefício para proteínas de membrana que permite a otimização de muitas variáveis experimentais importantes.
Comece inoculando três colônias de leveduras transformadas, em 50 mililitros de meio seletivo suplementar completo sem histidina. Complementado com base de nitrogênio de levedura e 2% de glicose para uma incubação durante a noite a 190 rotações por minuto e 30 graus Celsius. Remova a cultura no dia seguinte.
Use um espectótmetro para determinar a densidade óptica em 600 nanômetros ou OD 600. E inocular cada um dos quatro frascos de dois litros contendo 500 mililitros de cultura de meio a um OD 600 de 0,01. Em seguida, agitar as culturas a 190 rotações por minuto a 30 graus Celsius por 30 horas para permitir que as células consumam toda a glicose e cresçam a uma alta densidade.
Para induzir a expressão do transportador de borate, adicione 125 mililitros de cinco x meio peptone de levedura, complementado com 10% de galactose a 190 rotações por minuto a 30 graus Celsius por 16 horas. Em seguida, colher as células de levedura por centrifugação e resuspend a pelota em 100 mililitros de água fria. Gire em vórtice para resuspensar a pelota de levedura e transferir em série a solução para fazer isso com todas as garrafas contendo pelotas.
Para colher as membranas de levedura, primeiro, adicione 11,25 mililitros de um Molar Tris, 0,45 mililitros de 0,5 molar EDTA e 2,25 mililitros de 100 PMSF mililitros às células resuspendadas. Adicione água a um volume final de 225 mililitros e transfira as células para um recipiente de 450 mililitros de chapa metálica. Cubra o volume restante com contas de vidro frias de 0,5 milímetros e monte a câmara de contas com um rotor.
Mergulhe a câmara em um banho de gelo e realize seis pulsos de um minuto, separados por dois minutos de descanso para evitar o superaquecimento do lise. Após o último pulso, remova a membrana de filtragem de um filtro plástico descartável de tampa de garrafa aparafusado em uma garrafa de vidro e despeje o conteúdo da câmara de contas sobre o conjunto enquanto aplica o vácuo. Em seguida, enxágue com o tampão de lavagem de contas x adicionando ao giro da câmara e, em seguida, adicionando às contas.
Enxágüe a câmara de contas com 225 mililitros de tampão de lavagem e lave as contas com o conteúdo da câmara. Colete o lise por centrifugação e decante o supernascedor em garrafas de policarbonato para ultracentrifugação para coleta das membranas. No final da ultracentrifugação descarte o supernascido e pese as garrafas com as pelotas de membrana antes de reutilizar as membranas em aproximadamente 35 mililitros de tampão de resuspensão de membrana.
Adicione as suspensões a um Douncer de vidro, em seguida, Dounce homogeneize as membranas uma alíquota homogênea que homogeneize em um tubo cônico de 50 mililitros para armazenamento negativo de 80 graus Celsius. Pesar as garrafas vazias de centrífugas para determinar a massa das membranas colhidas. Para solubilização e purificação de proteínas, adicione uma barra de agitação e 150 miligramas de DDM por grama de membrana a um béquer no gelo e resuspenque as membranas descongeladas a um volume final de 15 mililitros de tampão de resuspensão de membrana, complementado com um PMSF milimiliar e 20 milimolar imidazoles por grama de membrana.
Adicione a solução de membrana ao béquer por uma hora de agitação em um banho de gelo. Seguido pela centrifugação para pelotar o material não solubilizado. Em uma sala fria de 4 graus celsius, filtre o supernascer através de um filtro de seringa de cinco micrômetros e use uma bomba peristáltica definida para uma taxa de fluxo de um mililitro por minuto para carregar a amostra em uma coluna de afinidade de níquel imobilizado de um mililitro, então, lave a coluna com 10 volumes de coluna de tampão de lavagem e dilua a proteína no buffer de elução.
Coletando o elunato em dez frações de mililitro. Execute as frações de gel preparadas coletadas em um gel de página Tris-Glycine SDS de quatro a 20%, juntamente com frações de lise e lavagem solubilizadas à temperatura ambiente, puxando o pico coletado frações iludidas para concentração a um 500 micro litro ou menos volume em um concentrador de corte dalton de 50 quilos em uma centrífuga de bancada a quatro graus Celsius. Filtre a proteína concentrada através de um filtro de coluna de giro de 0,2 micrômetro e injete o filtrado em uma coluna de exclusão de tamanho equilibrada em um buffer S-200.
Depois de executar as frações de pico em um segundo quatro a 20% Tris-Glycine SDS gel página, colorir o gel e coletar as frações de pico puro para concentração em um concentrador de corte Dalton de 50 quilos a quatro graus Celsius como apenas demonstrado. Em seguida, meça a absorvância da amostra de proteína em um comprimento de onda de 280 nanômetros para determinar a concentração antes de armazenar a amostra indefinidamente a 80 graus Celsius negativos. Para realizar um ensaio de ligação cruzada de glutaraldeído, primeiro, adicione 0,5 miligramas por mililitro de proteína descongelada em três microliters de tampão S-200 a cinco microliters de tampão S200.
Complete a reação de controle negativo com a adição de um microliter de 20% de sulfato de dodecyl de sódio e um microliter de 1,5% glutaraldeído. Complete as amostras experimentais com a adição de um micro litro de água e um micro litro de glutaraldeído de 1,5%. Após 30 minutos em temperatura ambiente, termine a reação com cinco microlitadores de 3x SDS page loading die contendo um excesso de tampão Tris para saciar o glutaraldeído e carregar todos os 15 micro litros da solução em um gel de página Tris-Glycine SDS de quatro a 20%.
Em seguida, execute o gel a 200 volts por 30 minutos antes de coloração para determinar a extensão do cruzamento mais fraco como evidenciado por uma banda que funciona com o dobro do tamanho do monômero desnaturado. Manche o gel tremendo em um agitador orbital lento com a mancha de gel adicionada ao gel. Aqui, géis típicos para as frações iludidas da cromatografia de afinidade de níquel mostram três proteínas parcialmente purificadas com as frações de lise não demonstrando uma faixa significativa correspondente ao transportador de borate como esperado para proteínas que não se expressam bem.
A pista de lavagem de ad millimolar em cada gel mostra perda mínima da proteína marcada de dez histidinas, apesar de seus emissores relativamente altos e antiga concentração. Enquanto as bandas correspondentes aos transportadores de borate são prontamente aparentes nas frações iludidas. Antes da injeção da coluna S200, as proteínas são insuficientemente purificadas para muitas aplicações a jusante, como indicado pelas bandas extras em cada amostra.
Após sua injeção em colunas de exclusão de tamanho, no entanto, podem ser observadas frações iludidas de alta pureza. Crosslinking demonstra que os transportadores homomédicos purificados poderiam ter sua montagem em solução prontamente avaliada com a extensão da ligação cruzada sendo dependente do número de resíduos de lisina nas proximidades uns dos outros É importante lembrar que uma vez que a colheita celular começa, a proteína deve ser mantida fria o tempo todo. Ou no gelo em uma sala de quatro graus Celsius ou em um caso de deli.
Após este procedimento, as proteínas da membrana podem ser caracterizadas por métodos biofísicos, bioquímicos ou estruturais, incluindo cristalografia de raios-X ou microscopia crio-elétron. Ao permitir a purificação de quantidades miligramas de proteína homogênea, essas técnicas foram utilizadas para determinar a estrutura cristalina do transportador Arabidopsis thaliana.
