Vorremmo ringraziare le aziende agricole Smithfield per la donazione di tessuto polmonare suino intatto. Vorremmo anche ringraziare il Dr. Hu Yang, il Dr. Christina Tang e Chirurgia Dipartimento di VCU plastica per averci permesso di utilizzare le loro attrezzature. campioni di idrogel e di tessuto sono stati preparati per SEM presso il Dipartimento VCU di Anatomia e Neurobiologia Microscopia strumento sostenuto, in parte, da un finanziamento NIH-NINDS nucleo centrale di Grant 5 P30 NS047463 e, in parte, dalla forma di finanziamento NIH-NCI Cancer Support Center di Grant P30 CA016059. l&#39;imaging SEM dei campioni presso il VCU Nanotecnologia Nucleo Caratterizzazione Facility (NCC). Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation, CMMI 1.351.162.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Soluzione </td><td> filtro sterile </td><td> Indicazioni </td></tr><tr><td> DIH 2 O </td><td> sì </td><td> DIH 2 O; sterile filtrato </td></tr><tr><td> 0,1% soluzione di Triton X-100 </td><td> sì </td><td> Sotto cappa aggiungere 100 ml Triton-X 100 Soluzione a 100 ml DIH 2 O e agitare fino alla dissoluzione; filtro sterile. </td></tr><tr><td> 2% Desossicolato Soluzione </td><td> sì </td><td> Sotto cappa aggiungere 2 g di sodio soluzione Desossicolato per 100 ml DIH 2 O e agitare fino alla dissoluzione; filtro sterile </td></tr><tr><td> 1 M NaCl </td><td> sì </td><td> Aggiungere 58,44 g di NaCl a 1 L di DIH 2 O; agitare fino a scioglimento; filtro sterile </td></tr><tr><td> soluzione DNasi </td><td> sì </td><td> Aggiungere 12.000unità di DNasi a 1 L DIH 2 O; Aggiungere 0,156 g MgSO 4 (Anidro), e 0,222 g CaCl 2; agitare fino a scioglimento; filtro sterile </td></tr><tr><td> PBS </td><td> sì </td><td> Unire 27,2 g di Na 2 HPO 4 · 7H 2 O (bibasico eptaidrato), 80 g di NaCl, e 2 g KCl con 10 L DIH 2 O; agitare fino a scioglimento; aggiustare il pH a 7,4; filtro sterile </td></tr></tbody></table> Tabella 1: soluzioni necessarie per Tissue Decellularization. Effettuare le soluzioni di cui sopra per il processo di decellularization. Conservare a 4 ° C. Circa 2,5 L sarà necessario per un polmone suino. 1. Formazione Hydrogel <ol><li> Suina Lung Decellularization (adattato da riferimenti 9,10) <ol><li> Ottenere un blocco normale polmone suino, da un macello, con il cuore e Vasculature intatto. </li><li> Utilizzare forbici di tessuto o un bisturi per sezionare il cuore, vasi più vicino possibile al cuore di taglio, la vascolarizzazione sarà utilizzato in fasi successive per perfusione. </li><li> sezionare cura di collocare il tessuto connettivo circostante la trachea, bronchi e vasi con un bisturi o forbici. NOTA: determinare le migliori polmone da utilizzare per il resto della procedura con la scelta di un polmone, senza grandi tagli o punture attraverso la pleura e grandi quantità di atelettasia o occlusione vascolare che possono ostacolare l&#39;efficacia del processo di decellularization. </li><li> Tagliare il polmone non ottimale lasciando tanto bronchi attaccati alla trachea possibile (cuore, tessuto connettivo e i lobi del polmone rimosso può essere smaltito). Ci dovrebbe essere un polmone rimanendo attaccata alla trachea e vascolare. NOTA: Conservare sezioni per istologia se lo si desidera. 9 </li><li> Chiudere bronchi scollegati con pinze o sutura per prevent riflusso eccesso. </li></ol><ol start="6"><li> Preparare le soluzioni decellularization e conservare in frigorifero a 4 ° C fino al momento (Tabella 1). </li><li> Utilizzando una pompa a mano cannulata per adattare l&#39;arteria polmonare, profumato il tessuto polmonare 3 volte con acqua deionizzata sia attraverso l&#39;arteria polmonare e la trachea. Profumato vascolarizzazione prima volta in volta. Iniziare con circa 1 L nel sistema vascolare e 1,5 L in trachea per ogni perfusione, ma come detriti cellulari viene rimosso più liquido può essere perfusi attraverso il sistema. </li><li> Profumato sia vascolarizzazione e la trachea con Triton X-100 soluzione. </li><li> Immergere tessuto polmonare in Triton X-100 soluzione per 24 ore a 4 ° C. </li><li> Perfuse vascolare e trachea 3 volte con acqua deionizzata per sciacquare. </li><li> Profumato sia vascolarizzazione e la trachea con la soluzione desossicolato. </li><li> Immergere le sezioni di tessuto in desossicolato per 24 ore a 4 ° C. </li><li> Perfuse vascolare e trachea 3 volte con acqua deionizzata per sciacquare. </li><li>Profumato sia vascolarizzazione e la trachea con soluzione di NaCl. </li><li> Immergere il tessuto in soluzione NaCl filtrata per 1 ora a 4 ° C. </li><li> Perfuse vascolare e trachea 3 volte con acqua deionizzata per sciacquare. </li><li> Profumato sia vascolarizzazione e la trachea con una soluzione di DNasi. </li><li> Immergere il tessuto in soluzione DNasi filtrata per 1 ora a 4 ° C. </li><li> Profumato sia vascolare e la trachea 5 volte con PBS. </li><li> Sezionare via tessuto cartilagineo evidente, trachea e tutto tubuli 2 mm o più di diametro (che si trova principalmente attorno l&#39;ilo e porzioni mediali dei polmoni) di condurre le vie aeree, lasciando solo le zone respiratorie (soprattutto le aree periferiche). </li><li> Sezionare il tessuto in 1 sezioni pollici o più piccoli. Orientamento del tessuto non ha importanza per questo passo. </li><li> Eliminare il tessuto liquido in eccesso e in 50 ml provette coniche. Congelare il tessuto a -80 ° C. NOTA: Mantieni sezioni per l&#39;esame istologico per garantire la rimozione di cellule e debri cellulares, se desiderato. Usiamo H &amp; E, α-galattosidasi, PicoGreen, idrossiprolina, ninidrina, Alcian blu, SDS-PAGE, e spettrometria di massa per la caratterizzazione. 9 </li></ol></li><li> Lung Processing <ol><li> Rimuovere i coperchi da tubi congelati contenenti tessuto polmonare decellularized. </li><li> Mettere carta da filtro sopra l&#39;apertura del tubo e fissare con nastro di gomma. NOTA: Tube e contenuto deve ancora essere congelati comunque di trovarsi in -80 ° C fino congelati. </li><li> Lyophilize il tessuto fino a quando tutto il liquido in eccesso è andato, utilizzando un liofilizzatore secondo le istruzioni del produttore. Conservare a -80 ° C fino al momento di mulino. </li><li> Prima di iniziare aggiungere azoto liquido fresare freezer per raffreddare isolamento e componenti interni alle condizioni di lavoro. </li><li> Rimuovere la barra mulino magnetica dal tubo di mulino e aggiungere il tessuto per coprire fondo. </li><li> Sostituire bar mulino e aggiungere il tessuto poco compresso. La barra mulino deve ancora muoversi liberamente. </li><li> Chiudere la provetta mulino e PLAce nel mulino congelatore. </li><li> Riempire azoto liquido per la linea di riempimento massimo. </li><li> Mulino Congelatore tutto il tessuto in polvere fine (circa 5 minuti, il tasso di compressione pari a ~ 600 min -1), in un cilindro di policarbonato con un dispositivo di simulazione in acciaio inox così come tappi terminali in acciaio inox con il mulino congelatore secondo le istruzioni del produttore. Conservare a -80 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Micro-porosa formazione di gel (8 mg / ml) (adattato da riferimenti 9,11) <ol><li> Aggiungere 1% (w / v) di polvere decellularized e 0,1% (w / v) di pepsina per 0,01 M HCl, sotto costante agitazione (dovrebbe essere in grado di vedere il flusso a livello superiore del liquido), a temperatura ambiente, per 48 hr. NOTA: La polvere viene caricata staticamente, in modo da aggiungere il HCl dopo la polvere offre la possibilità di lavare l&#39;eccesso al largo delle pareti del tubo. </li><li> Dopo la digestione per 48 h, porre la soluzione e reagenti in ghiaccio per 5 min. </li><li> Utilizzando refrigerato 10% (v / v) 0,1 M NaOH, und 11.11% (v / v) 10x PBS (per portare l&#39;intera soluzione a 1x concentrazione), portare la soluzione proteica digerita a pH fisiologico di 7,4. NOTA: La soluzione può essere conservato a 4 ° C per una settimana. Eseguire la cinetica di gelificazione utilizzando reometria 9 se lo si desidera. </li></ol></li></ol> 2. Cross-collega idrogeli per migliorare la resistenza meccanica <ol><li> Soluzioni di 1%, 0,1% e 0,01% w / v soluzione genipina reticolazione sono state preparate sciogliendo la necessaria quantità di polvere genipina in 10% DMSO. </li><li> Agitare la soluzione ogni 15 min per 1 ora. </li><li> Aggiungere la soluzione genipina per coprire idrogel ECM (100 microlitri per ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti) che sono stati precedentemente assemblati in parte 1.3.4. </li><li> Lasciare ogni idrogel ECM per reticolare per 24 ore a 37 ° C. </li><li> Risciacquare l&#39;idrogel ECM 3 volte con PBS fino a quando la soluzione di lavaggio non è più blu. Gli idrogel reticolati saranno quindi pronto per l&#39;ulteriore caratterizzazione e cestudi su colture ll. </li></ol> 3. coltura cellulare con microporosa Gel <ol><li> Rivestimento bidimensionale <ol><li> Utilizzando la soluzione dalla 1.3.3, aggiungere 20 ml di soluzione pregel a ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti non trattate. </li><li> durante la notte in frigorifero a 4 ° C per consentire la proteina adsorbimento al piatto. </li><li> Aspirare soluzione PreGel e risciacquare con PBS. </li><li> Cellule Passage 9. </li><li> Aggiungere 10.000 cellule / cm 2 per pozzi. </li><li> Aumentare la media per 100 pl per pozzetto e incubare a 37 ° C. </li></ol></li><li> Tre coltura cellulare dimensionale 9 <ol><li> Utilizzando la soluzione da 1.3.3, risospendere le cellule pellet ad una concentrazione di 1.000.000 cellule / ml di soluzione pregel. </li><li> erogare rapidamente 16 ml di sospensione PreGel cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, in modo da formare un idrogel di spessore ~ ​​500 micron per la coltura delle cellule 3D. </li><li> Incubare a 37 ° C per 30min per il gel per formare. </li><li> Aggiungere 100 microlitri di media all&#39;inizio idrogel formati e incubare a 37 ° C. </li></ol></li><li> Tre coltura cellulare tridimensionale su gel di rigidità variabili <ol><li> Utilizzando la soluzione da 1.3.3, pipetta 100 ml di soluzione di PreGel in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti. </li><li> Incubare a 37 ° C per 30 minuti per gel di forma. Nota: Cross-collega passi dalla parte 2 può essere usato qui. </li><li> Cellule Passage 9. </li><li> Aggiungere 10.000 cellule / cm 2 per pozzi. </li><li> Aumentare la media per 100 pl per pozzetto e incubare a 37 ° C. </li></ol></li></ol>

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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decellularization+of+human+and+porcine+lung+tissues+for+pulmonary+tissue+engineering.">Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering.</a> Ann Thorac Surg. 96 (3), 1046-1055 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Uno degli aspetti integranti della biologia è l&#39;auto-organizzazione di molecole in strutture gerarchiche che svolgono un compito specifico. 13 Nel laboratorio, auto-assemblaggio dipende da numerosi fattori quali la concentrazione di sale, il pH e la durata digestione. Come si vede, un auto-organizzazione forme idrogel quando le proteine ​​solubilizzati torna a una temperatura fisiologica. L&#39;idrogel formatosi è in grado di promuovere l&#39;attaccamento cellulare e la proliferazione in vitro. risposta cellulare ai segnali biofisici da ECM non può essere ricercato con polimeri. risposta cellulare specifica del tessuto ai segnali biofisici non può essere ricercato utilizzando altri tessuti. ricercatori Rigenerazione e medici credono utilizzando ponteggi decellularized migliora la rigenerazione dei tessuti e la guarigione delle ferite. Cronica soffre di malattie polmonari hanno bisogno di miglioramenti terapeutici per aumentare la disponibilità di organi e diminuire immunogenicità. Organo specifico, interazioni cellula-ECM deve esserestudiato per ulteriori biologia organo. Utilizzando ECM da impalcatura cellulare per le cellule del polmone ha mostrato risultati coerenti. 14,15 Utilizzando le fette di polmone da modelli malati incoraggia il rinnovamento malattia 16 staminali o progenitrici delle cellule, che si trova nei polmoni distali, 17,18 e richiede nicchie speciali per evitare la formazione di teratomi. Utilizzando tessuti ECM specifico come un veicolo di consegna, gli effetti rigenerativi delle cellule progenitrici possono essere aumentati. L&#39;idrogel ECM stabilisce un ambiente più applicabile per valutare reazioni cellulari a matrice extracellulare. Un grande corpo di ricerca esiste guardando rigidità come si riferisce alla segnalazione cellulare. Il nostro metodo di reticolazione genipina consentono di cellula-rigidità di segnalazione, nonché le interazioni dei componenti cellula-ECM. Mentre idrogel rigidità può essere manipolato da ECM quantità e il rapporto di proteine, l&#39;uso di genipina permette idrogel modifiche rigidità alquanto indipendenti di contenuti ECM. Regolazione genconcentrazione EPIN può consentire accurata messa a punto delle proprietà meccaniche ad assomigliare più strettamente tessuto polmonare naturali 6. Dai dati ottenuti usando genipina idrogel dal polmone periferico nel presente studio, è stato osservato un aumento di 15 volte (da 5 Pa a 75 Pa). Sulla base dei dati reologiche del normale tessuto di ratto polmone biopsie che è stato decellularized usando gli stessi metodi, possiamo raggiungere approssimativo rigidità tessuto polmonare periferico (dati non riportati) con l&#39;aggiunta di 1% genipina a idrogeli polmonari periferici o l&#39;aggiunta di 0,01% a idrogel polmone intero (stimato ). Utilizzando la ECM polmone periferico costituito da parenchima polmonare ha fatto un gel notevolmente più morbido rispetto a tutto il nostro polmone ECM idrogel risultati precedentemente pubblicati 7. Pertanto, in aggiunta a genipina, selezionando specifiche regioni di tessuto polmonare per decellularize drammaticamente può influenzare la rigidità. Ci sono opportunità per migliorare questo metodo, che può includere ulteriori passaggi comunemente utilizzati in perfusisulla decellularization del tessuto polmonare intero. Questo metodo è stato utilizzato il tessuto polmonare normale e può richiedere modifiche per decellularization dei polmoni malati. Non abbiamo ancora esaminato questo processo in specifici stati di malattia. Otteniamo i nostri polmoni spediti sul ghiaccio durante la notte da un macello. Questo metodo potrebbe limitare l&#39;efficacia del nostro processo a causa di atelettasia o occlusione vascolare; tuttavia, raramente abbiamo per rimuovere le aree del polmone che non sono stati accuratamente decellularized. Quando l&#39;ottenimento di tessuto polmonare fresco, si consiglia rendendo tutte le soluzioni necessarie prima di ottenere i polmoni per evitare pause della lavorazione dei tessuti. Precedenti ricerche hanno trovato che l&#39;uso di acido peracetico come uno stadio di sterilizzazione finale alla matrice di produzione provoca un rigenerativa M1 macrofagi fenotipo ad infiltrarsi cellule del sistema immunitario, 19 potenzialmente migliorare gli effetti proregenerative di tessuto decellularized. Altre ricerche è andato in con altri detergenti per completare il processo, ma quelli appeaR da specifiche preferenze di laboratorio con in ultima analisi, lo stesso impatto sulla decellularization. La procedura e di digestione passi decellularization possono essere ottimizzate a seconda dell&#39;applicazione specifica del ricercatore. Ad esempio, modificare il tempo o la neutralizzazione metodi di gel di digestione può cambiare la composizione delle proteine, le proprietà meccaniche, o cinetica di gelificazione. Alternative al metodo qui descritto può variare del livello di complessità a seconda dei risultati sperimentali desiderati. Ad esempio, se l&#39;obiettivo era di mantenere la membrana basale intatta per quanto possibile, una pompa di perfusione con un limitato controllo pressione può diminuire danni barriera. Inoltre, se uno aveva un setup di laboratorio a disposizione per mantenere intatto per le specie più grandi entrambi i polmoni, il processo decellularization può migliorare l&#39;efficacia. Viceversa, una mano tecnica con un mortaio e pestello macinazione può essere applicato al tessuto liofilizzato per i laboratori che non hanno un Cryomill. Ci si aspetterebbe Grindin manog per produrre frammenti più grandi, limitando la superficie disponibile per la digestione acida così potrebbero dover essere modificato in questo caso i tempi di digestione. Alternative non sono limitati ai passi decellularization e formazione di idrogel. Glutaraldeide è stato usato come un reticolante per idrogel, fornendo una possibile alternativa alla crescente resistenza meccanica degli idrogel biologici utilizzati per sistemi modello. Altri sistemi modello includono polmoni decellularized intatto come un sistema in vitro 3D cultura, o più comunemente in cerca di fette di polmone come un modello 3D in vitro patibolo. 20 abbiamo già accennato le limitazioni che vengono dal lavorare con impalcature di polimeri e ponteggi componenti singoli, ma quelli rimangono come possibili alternative alla procedura qui presentata. Inoltre, ci sono metodi alternativi per determinare l&#39;efficacia decellularization (come l&#39;isolamento del DNA), gelificazione (può usare saggi di torbidità), e l&#39;attaccamento cellulare unND proliferazione (come l&#39;uso di CCK8). Abbiamo trovato che i metodi qui descritti sono più che sufficienti per caratterizzare idrogel per uso come supporti del modello 3D. Gli idrogel ECM polmonari che descriviamo qui di fornire una piattaforma efficace per lo studio delle interazioni cellula-ECM. La soluzione pregel ha un potenziale come rivestimento per trasportatori di farmaci polimero, aiutando nella fornitura di cellule staminali mesenchimali, o come una piattaforma di distribuzione di droga da solo. Il protocollo presentato qui fornisce i passaggi fondamentali per la creazione di un idrogel versatile derivato da ECM polmone.

Translating in vitro results to the clinic is one of the most challenging issues facing biomedical researchers. In vitro research on tissue culture plastic is easier, more convenient, and maintains high cell viability.1 This approach is a reasonable starting point, but the results have limited clinical translation. Increasingly, laboratories are incorporating three-dimensional constructs to replace the traditional two-dimensional methods. Reviews are available for many three-dimensional environments, from biological scaffolds to polymeric scaffolds.2,3
Biological frameworks can mimic characteristics of in vivo environments as they contain many of the protein and glycosaminoglycan components of the native matrix and provide familiar binding sites for cells to attach to and recognize. Extracellular matrix (ECM) derived materials have been shown to be capable scaffolds for cell attachment and proliferation.4 One challenge that limits the application of ECM hydrogel platforms stems from their inherently weak mechanical properties following gelation. Native tissue often has mechanical properties that are magnitudes higher than hydrogels. Non-toxic crosslinking agents can increase the mechanical properties of hydrogels to better mimic the native tissue environment. Genipin is a non-toxic, natural crosslinker derived from Gardenia plants with the ability to closely tailor mechanical properties of ECM with changes in genipin concentration5,6. 
Nearly all cells in the body exist in, and organize on, ECM that they either produce or maintain. New focus on the universal importance of ECM in the organization, condition, and function in every organ or system has sparked the production of matrix based platforms for in vitro investigation. Porcine small intestine submucosa is the most extensively studied naturally-derived scaffold, and it has been used to regenerate tendons, ligaments, skeletal muscle4, and even bone7. Matrices from other organs and donor species have also demonstrated good tissue regeneration potential. The use of foreign ECM components causes minimal issues with immunomodulation. After elimination of host cellular matter, the remaining ECM will be similar in amino acid content and organization to all other mammalian species8. There is a growing line of thinking that the best way to examine cell-ECM interactions in vitro is to utilize organ-specific ECM scaffolds. Each organ provides a unique composition of proteins and proteoglycans to create cellular niches. Niches provide structural, functional and even the enzymatic breakdown of the extracellular matrix contributing to biophysical signaling. To attain an in vitro microenvironment most similar to the in vivo microenvironment, use of tissue specific ECM would optimize the cellular niches for research. 
The goal of this protocol is to provide a method for establishing a hydrogel scaffold unique to the lung ECM. This method provides a platform for in vitro research on lung cell-ECM interactions.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP151-100</td>
			<td style="width:371px;">Use in fume hood with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Deoxycholate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D6750-100g</td>
			<td>Use with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M7506-500g</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C1016-500g</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNase</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025-150KU</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148-500ML</td>
			<td>Use with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pepsin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6887-5G</td>
			<td>Use in fume hood with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP359-500</td>
			<td>Use with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Genipin</td>
			<td style="width:135px;">Wako Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">078-03021</td>
			<td>Use in fume hood with eye protection and gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS 10x</td>
			<td style="width:135px;">Quality Biological</td>
			<td>119-069-151</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:135px;">VWR</td>
			<td>45000-448</td>
			<td>None</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter Paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td align="right">8519</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hand pump</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td>10-239-1</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Graduate Beaker</td>
			<td style="width:135px;">VitLab</td>
			<td align="right" style="width:119px;">445941</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryomill</td>
			<td>SPEX</td>
			<td>6700</td>
			<td>Use cryogloves and eye protection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lyophilizer</td>
			<td>FTS FlexiDry</td>
			<td></td>
			<td>Use gloves.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rheometer</td>
			<td>Discovery</td>
			<td>HR-2</td>
			<td>Use gloves and eye protection.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tunable hydrogels from pulmonary extracellular matrix for 3d cell culture

Qui vi presentiamo un metodo per stabilire più idrogel di coltura cellulare di componenti per vitro coltura cellulare del polmone in. Cominciando con sano en bloc tessuto polmonare da suini, ratti, o il mouse, il tessuto è perfuso e immerso in successive detergenti chimici per rimuovere i detriti cellulari. Confronto istologica del tessuto prima e dopo l&#39;elaborazione conferma rimozione di oltre il 95% della doppia elica colorazione del DNA e alfa galattosidasi suggerisce la maggioranza dei detriti cellulari viene rimosso. Dopo decellularization, il tessuto è liofilizzata e quindi cryomilled in una polvere. La polvere matrice viene digerito per 48 ore in una soluzione di pepsina di digestione acida e quindi neutralizzato per formare la soluzione pregel. Gelificazione della soluzione pregel può essere indotta da incubazione a 37 ° C e può essere utilizzato immediatamente dopo neutralizzazione o conservato a 4 ° C per un massimo di due settimane. I rivestimenti possono essere formati usando la soluzione pregel su una lastra non trattata per cattaccamento ell. Le celle possono essere sospesi in pregel prima autoassemblaggio per ottenere una coltura 3D, placcato sulla superficie di un gel costituito da cui le cellule possono migrare attraverso il ponteggio, o placcato sui rivestimenti. Modifiche alla strategia presentati possono influenzare la temperatura di gelificazione, la forza, o taglie frammento di proteina. Al di là di formazione idrogel, la rigidità idrogel può essere aumentata mediante genipina.

Utilizzando questo metodo, abbiamo prodotto idrogel di maiale normale, ratto, e polmoni del mouse (Figura 1). polmoni trasformati forniscono una stima rispettivamente 5 mg, 40 mg e 10 g di polvere di ECM. Una panoramica del processo è mostrato nella figura 2. visualizzazioni chiave durante il processo sono: l&#39;aspetto bianco dei polmoni dopo il risciacquo desossicolato; dopo la formazione pregel, la soluzione deve essere opaco e la soluzione deve apparire omogenea per mesi se conservata a 4 ° C. Abbiamo incluso un tavolo risoluzione di base per identificare fonti di errore durante tutto il processo (Tabella 2). Dopo gelificazione, idrogel possono essere utilizzati immediatamente o memorizzati per un utilizzo futuro. Test reologico conferma che oltre il 90% della gelificazione avviene nei primi minuti dopo aver raggiunto 37 ° C (figura 3). idrogel Formata sono stabili per lunghi periodi in PBS, ma l&#39;adesione cellulare e proliferation può cambiare (Figura 4). Anche se questo protocollo è stato scritto per polmone suino, limitazioni di spazio ci limitano ad utilizzare un solo polmone quando decellularizing polmoni di maiale. Abbiamo usato la stessa procedura con lievi modifiche per decellularize entrambi i polmoni per altre specie. Per ratti e topi, i polmoni possono essere lasciati intatti e cuore attaccate, ma il tessuto connettivo devono ancora essere rimossi con un bisturi o forbici. Manteniamo il cuore intatto e attaccato per ratti e topi e nei profumi delle soluzioni attraverso il ventricolo destro al posto dell&#39;arteria polmonare. Perfusione della trachea è sempre la stessa; tuttavia, la cannula può essere suturata nella trachea per facilità di accesso per le specie più piccole. Abbiamo aggiunto più tipi di cellule, le cellule staminali mesenchimali umane, 9 topo cellule staminali mesenchimali, linee di cellule epiteliali umane (A549s), primario endo microvascolare umanacellule thelial (HpuVECs), e cellule umane della vena ombelicale epiteliali (HUVEC) all&#39;interno e sulla superficie degli idrogel ECM polmone. Non abbiamo incontrato problemi per quanto riguarda la natura xenogenica dei gel formati. Il nostro lavoro precedente ha mostrato una riduzione significativa α-galattosidasi in idrogel suina. 9 La soluzione pre-gel può essere usato anche come rivestimento a 4 ° C per migliorare l&#39;adesione cellulare. La soluzione pregel migliora attaccamento HpuVEC e la proliferazione quando aggiunto a polmone ECM piastre di coltura dei tessuti rivestiti. Pozzetti dimostrano un significativo miglioramento attaccamento cellulare rispetto ai pozzi non trattate (Figura 5). L&#39;aggiunta di genipina aumenta idrogel reticolazione. Questa maggiore reticolazione può fornire una rigidità più fisiologicamente rilevanti, riducendo la degradazione della ECM. La diminuzione nella degradazione, ma minore in vitro, può verificarsi a causa di una maggiore adesione traproteine ​​e quindi più resistenza al rimodellamento dalle cellule. Abbiamo usato cicli di frequenza su un reometro per misurare le proprietà meccaniche del idrogel reticolato. Idrogel rigidità è risultata essere correlata direttamente genipina concentrazione con la mediana e concentrazione essendo 0,01% pertinenza (Figura 6, tessuto nativo non mostrato). Un saggio MTT è stato usato per quantificare la proliferazione e sopravvivenza cellulare sul idrogel reticolato. La proliferazione cellulare è maggiore sul idrogel reticolato (Figura 7). Questo supporta aumento della proliferazione cellulare su una maggiore rigidità da parte degli altri. 12 Variando genipina tempo o della temperatura di reticolazione può provocare diversi gradi di reticolazione. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig1.jpg" /> Figura 1: Immagini di polmoni c&#39;e decellularized. Foto di (A) del mouse polmone dopo decellularizione e il cuore rimosso, (B) Rat dopo Triton X-100 sciacquato via, (C) Pig, prima di risciacquo iniziale; cedono ~ 5 mg, 40 mg e 10 g di Lung ECM rispettivamente. Polmonare (D) Mouse e cuore intatto, dopo decellularization, con la cannula ancora suturati al suo posto. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55094/55094fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig2.jpg" /> Figura 2: Panoramica dei metodi. Questa è una panoramica del metodo per la produzione di idrogel di polmoni. Cominciando con blocco decellularization polmone maiale avviene lasciando tessuto bianco o traslucido solo opaca che si compone di proteine ​​ECM. Poi, dopo la rimozione di eventuale acqua residua e aumentando la superficie di ottimizzare digestione acida il tessuto è solubilizzato. Neutralizzazione del acid e aumentando il sale a livelli fisiologici crea la soluzione pregel pronto per la gelificazione. Una volta che la soluzione forma un idrogel a 37 ° C, la caratterizzazione avviene con un microscopio gel reometro e scansione elettronica. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55094/55094fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig3.jpg" /> Figura 3: Rappresentante reologico dati per gelificazione a temperatura rampa. Dopo uno sweep di ampiezza iniziale per determinare gamma viscoelastico lineare, una rampa di temperatura è stato utilizzato per determinare la cinetica di gelificazione. I dati sono presentati come media +/- deviazione standard. n = 4. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig4.jpg" /> Figura 4: Stabilità a lungo termine. un imetà di un polmone suino ECM idrogel memorizzati in PBS per oltre 6 mesi a temperatura ambiente. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig5.jpg" /> Figura 5: Metabolic Assay di HpuVECs. MTT dati proliferazione da primari cellule endoteliali microvascolari umane (HpuVECs) coltivate su piastre non trattate colture di tessuti. soluzione Pregel da 1.3.3 è stato aggiunto al piatti, frigorifero durante la notte e sciacquati per formare piastre rivestite di pre-gel polmone ECM. HpuVECs mostrato attività MTT superiore sul ECM piastre rivestite rispetto ai non-rivestita. * P &lt;0,05 rispetto al controllo. I dati sono media ± deviazione standard n = 3 per gruppo. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig6.jpg" /> Figura 6: reologico dati per reticolazione avanzato. dati reometria per reticolazione genipina. La rigidità aumenta con l&#39;aumento delle concentrazioni di Genipin ad un plateau a 1% genipina. I dati sono normalizzati a mostrare un aumento di volte in reticolazione con genipina. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/55094/55094fig7.jpg" /> Figura 7; La proliferazione cellulare su genipina reticolati Gel. Dati MTT normalizzati per A549s su idrogel reticolati genipina. Aumento della proliferazione cellulare visto con maggiore rigidità. p &lt;0,05 rispetto al controllo. I dati sono media ± deviazione standard. n = 3 per gruppo. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Problema </td><td> Problema </td><td> Risoluzione </td></tr><tr><td> Rosso / colore rosa mantenuto dopo decellularization </td><td> decellularization inefficace </td><td> Ricominciare con nuovi polmoni </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Rimuovere aree di decellularization incompleta &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td></td><td> occlusione vascolare </td><td> Ricominciare con nuovi polmoni </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Rimuovere aree di decellularization incompleta </td></tr><tr><td> detriti cellulari significativo mantenuta </td><td> decellularization inefficace </td><td> Ricominciare con nuovi polmoni </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Rimuovere aree di decellularization incompleta </td></tr><tr><td></td><td> occlusione vascolare </td><td> Ricominciare con nuovi polmoni </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Rimuovere aree di decellularization incompleta </td></tr><tr><td></td><td> atelettasia </td><td> Ricominciare con nuovi polmoni </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Rimuovere aree di decellularization incompleta </td></tr><tr><td> La distruzione delle membrane trovato in campioni istologici </td><td> Over-pressurizzazione dei vasi durante la perfusione </td><td> Ridurre la pressione di perfusionedi detergenti </td></tr><tr><td> Grande particolato rimane dopo la fresatura </td><td> Troppo materiale liofilizzato in tubo </td><td> Ridurre il materiale in macinazione cilindro </td></tr><tr><td></td><td> Non fresata per un tempo sufficiente </td><td> aumentare il tempo di fresatura </td></tr><tr><td> soluzione pregel non gelificante </td><td> Soluzione pH troppo elevato </td><td> Fare pH 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Inizia soluzione pregel con neve fresca </td></tr><tr><td></td><td> Soluzione pH troppo basso </td><td> Fare pH 7,4 </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Inizia soluzione pregel con neve fresca </td></tr><tr><td></td><td> ECM sopra digerito </td><td> Inizia soluzione pregel con neve fresca </td></tr><tr><td> Le cellule non sopravvivono </td><td> I microbi introdotte dopo HCl digestione </td><td> Inizia di nuovo con neve fresca e utilizzare soluzioni filtrati sterili </td></tr><tr><td></td><td> pH off </td><td> Ricominciare soluzione pregel </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Fare pH 7,4 </td></tr><tr><td></td><td> Le cellule scoppiano </td><td> Fissare contenuto di sale in soluzione pregel </td></tr></tbody></table> Tabella 2: Guida alla risoluzione di identificare le fonti di errore potenziale.

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Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Questo è un metodo per creare un 3-dimensionale scaffold coltura cellulare dalla matrice extracellulare polmonare. polmone Intact è trasformato in idrogel in grado di sostenere la crescita delle cellule in tre dimensioni.

Sintonizzabile idrogel da polmonare matrice extracellulare per colture cellulari 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...

tunable-hydrogels-from-pulmonary-extracellular-matrix-for-3d-cell

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.5K Views.  Virginia Commonwealth University.  Questo è un metodo per creare un 3-dimensionale scaffold coltura cellulare dalla matrice extracellulare polmonare. polmone Intact è trasformato in idrogel in grado di sostenere la crescita delle cellule in tre dimensioni. 

Video: Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formazione Light-mediata ed il modello di idrogel per colture cellulari

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Ricerca

Bioingegneria

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus of this article is on the methods for fabricating ECM-derived porous foams and microcarriers for use as biologically-relevant substrates in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative scaffolds and cell delivery systems for tissue engineering and regenerative medicine. Using decellularized tissues or purified insoluble collagen as a starting material, the techniques can be applied to synthesize a broad array of tissue-specific bioscaffolds with customizable geometries. The approach involves mechanical processing and mild enzymatic digestion to yield an ECM suspension that is used to fabricate the three-dimensional foams or microcarriers through controlled freezing and lyophilization procedures. These pure ECM-derived scaffolds are highly porous, yet stable without the need for chemical crosslinking agents or other additives that may negatively impact cell function. The scaffold properties can be tuned to some extent by varying factors such as the ECM suspension concentration, mechanical processing methods, or synthesis conditions. In general, the scaffolds are robust and easy to handle, and can be processed as tissues for most standard biological assays, providing a versatile and user-friendly 3D cell culture platform that mimics the native ECM composition. Overall, these straightforward methods for fabricating customized ECM-derived foams and microcarriers may be of interest to both biologists and biomedical engineers as tissue-specific cell-instructive platforms for in vitro and in vivo applications.

The tissue-specific extracellular matrix (ECM) is a key mediator of cell function. This article describes methods for synthesizing pure ECM-derived foams and microcarriers that are stable in culture without the need for chemical crosslinking for applications in advanced 3D in vitro cell culture models or as pro-regenerative bioscaffolds.

Fabbricazione di Schiume matrice extracellulare-derivati ​​e microcarriers come tessuto-specifica delle cellule, Cultura e piattaforme di distribuzione

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

Coltura di cellule di idrogeli ultrasottile Innova elastico come una membrana dello scantinato biomimetici per Dual

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

Fabricating a Kidney Cortex Extracellular Matrix-Derived Hydrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust mechanical support for in vitro cell culture but lack the necessary protein and ligand composition to elicit physiological behavior from cells. This manuscript describes a fabrication method for a kidney cortex ECM-derived hydrogel with proper mechanical robustness and supportive biochemical composition. The hydrogel is fabricated by mechanically homogenizing and solubilizing decellularized human kidney cortex ECM. The matrix preserves native kidney cortex ECM protein ratios while also enabling gelation to physiological mechanical stiffnesses. The hydrogel serves as a substrate upon which kidney cortex-derived cells can be maintained under physiological conditions. Furthermore, the hydrogel composition can be manipulated to model a diseased environment which enables the future study of kidney diseases.

Here we present a protocol to fabricate a kidney cortex extracellular matrix-derived hydrogel to retain the native kidney extracellular matrix (ECM) structural and biochemical composition. The fabrication process and its applications are described. Finally, a perspective on using this hydrogel to support kidney-specific cellular and tissue regeneration and bioengineering is discussed.

Fabbricando un rene corteccia extracellulare Matrix-derivato idrogel

Extracellular matrix (ECM) provides important biophysical and biochemical cues to maintain tissue homeostasis. Current synthetic hydrogels offer robust ...

Production of Extracellular Matrix Fibers via Sacrificial Hollow Fiber Membrane Cell Culture

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure and healing. Extraction of extracellular matrix from fibrogenic cell cultures in vitro has potential for generation of ECM from human- and potentially patient-specific cell lines, minimizing the presence of xenogeneic epitopes which has hindered the clinical success of some existing ECM products. A significant challenge in in vitro production of ECM suitable for implantation is that ECM production by cell culture is typically of relatively low yield. In this work, protocols are described for the production of ECM by cells cultured within sacrificial hollow fiber membrane scaffolds. Hollow fiber membranes are cultured with fibroblast cell lines in a conventional cell medium and dissolved after cell culture to yield continuous threads of ECM. The resulting ECM fibers produced by this method can be decellularized and lyophilized, rendering it suitable for storage and implantation.

The goal of this protocol is production of whole extracellular matrix fibers targeted for wound repair which are suitable for preclinical evaluation as part of a regenerative scaffold implant. These fibers are produced by the culture of fibroblasts on hollow fiber membranes and extracted by dissolution of the membranes.

Produzione di fibre di matrice extracellulare tramite fibra cava sacrificale membrana Cell Culture

Engineered scaffolds derived from extracellular matrix (ECM) have driven significant interest in medicine for their potential in expediting wound closure ...

Measuring Global Cellular Matrix Metalloproteinase and Metabolic Activity in 3D Hydrogels

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) culture systems. However, measurement of cell function in 3D culture is often more challenging. Many biological assays require retrieval of cellular material which can be difficult in 3D cultures. One way to address this challenge is to develop new materials that enable measurement of cell function within the material. Here, a method is presented for measurement of cellular matrix metalloproteinase (MMP) activity in 3D hydrogels in a 96-well format. In this system, a poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogel is functionalized with a fluorogenic MMP cleavable sensor. Cellular MMP activity is proportional to fluorescence intensity and can be measured with a standard microplate reader. Miniaturization of this assay to a 96-well format reduced the time required for experimental set up by 50% and reagent usage by 80% per condition as compared to the previous 24-well version of the assay. This assay is also compatible with other measurements of cellular function. For example, a metabolic activity assay is demonstrated here, which can be conducted simultaneously with MMP activity measurements within the same hydrogel. The assay is demonstrated with human melanoma cells encapsulated across a range of cell seeding densities to determine the appropriate encapsulation density for the working range of the assay. After 24 h of cell encapsulation, MMP and metabolic activity readouts were proportional to cell seeding density. While the assay is demonstrated here with one fluorogenic degradable substrate, the assay and methodology could be adapted for a wide variety of hydrogel systems and other fluorescent sensors. Such an assay provides a practical, efficient and easily accessible 3D culturing platform for a wide variety of applications.

Here, a protocol is presented for encapsulating and culturing cells in poly(ethylene glycol) (PEG) hydrogels functionalized with a fluorogenic matrix metalloproteinase (MMP)-degradable peptide. Cellular MMP and metabolic activity are measured directly from the hydrogel cultures using a standard microplate reader.

Misurazione della proteinasi metallica della matrice cellulare globale e l'attività metabolica in idrogel 3D

Three-dimensional (3D) cell culture systems often more closely recapitulate in vivo cellular responses and functions than traditional two-dimensional (2D) ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Bioinchiostro a matrice extracellulare derivato dal tessuto pancreatico per la stampa di costrutti di tessuto pancreatico 3D Cell-Laden

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Un modello di coltura a matrice extracellulare extracellulare -adipocyte umano per lo studio del crosstalk metabolico a matrice

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

Preparazione di microambienti a matrice extracellulare tunable per valutare schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

Ceppo controllato di idrogel 3D in imaging a microscopia dal vivo

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...