The work is supported by HHMI. We thank our lab members for their help with testing the protocol and revising the manuscript.

1. Costruzione del illuminatore LED NOTA: L&#39;attrezzatura necessaria a LED è riassunto nella lista dei materiali. L&#39;intera impostazione del LED è piccolo e può essere posizionato in qualsiasi punto in laboratorio, anche se si consiglia di riporla in una stanza buia per controllare la luce l&#39;esposizione di vermi 4. <ol><li> Collegare il LED ad un controllore con cavi (Figura 1A, D). </li><li> Collegare il controller per una funzione generatore / amplificatore digitale con un cavo BNC (Figura 1A, C, D). </li><li> Fissare i LED luminosi 10 cm sopra il palco con un supporto personalizzato (Figura 1A). NOTA: Abbiamo fatto il supporto con parti metalliche. </li><li> Coprire l&#39;installazione di illuminazione a LED in parte, ma evitare accumulo di calore (Figura 1B), il che rende i vermi malati. NOTA: Usiamo una copertina rigida in plastica su misura con la parte superiore aperta e in basso (Figura 1A). Il rivestimento non è necessario per la mutagenesi in sé, ma è usato to limitare l&#39;esposizione non necessaria della luce blu per l&#39;ambiente circostante. Si consiglia di non coprire il setup LED completamente (Figura 1B) per evitare il surriscaldamento dei vermi. </li><li> Indossare occhiali di protezione laser. NOTA: indossare gli occhiali di protezione laser, perché la luce è molto luminoso. Occhiali da sole può funzionare così. </li><li> Attivare la leva del regolatore LED di &#39;Int.&#39; per illuminazione continua (Figura 1D) e impostarlo al 65% della potenza massima (Figura 1C). </li><li> Utilizzare un fotometro per misurare l&#39;intensità della luce blu sul palco dove i vermi sono posizionati utilizzando il protocollo del produttore. La configurazione dà 2,0 mW / mm 2 sotto illuminazione continua. </li></ol> 2. Trattamento Light Blue NOTA: utilizzare il ceppo CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3&#39;UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ED3) III 4 Il ceppo è disponibile. presso il Caenorhabditis Genetics center (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/). <ol><li> Mantenere il ceppo His-mSOG al buio su terreno di coltura nematode standard (NGM) piatti con E. coli OP50 seguendo un protocollo standard di 10,11. NOTA: In luce ambiente, juSi164 ceppi contenenti, non visualizzano un tasso di mutazione di sopra di un tasso di spontanea 4. passaggio ceppo di routine utilizzando un ambito dissezione con una lampada alogena in genere non causare mutazioni pure. Tuttavia, occorre prestare attenzione per evitare l&#39;esposizione inutile alla luce, ad esempio, mantenendo i ceppi in un incubatore scuro all&#39;interno di serie, o coprendo i ceppi con un foglio. Si consiglia di congelare aliquote del ceppo dopo averlo ricevuto nel caso in cui le mutazioni inutili si accumulano nel tempo. </li><li> Scegliere gravido giovane adulto (circa post-L4 12 h) gli animali con un verme scegliere 11. NOTA: gli animali più giovani mostrare effetto mutageno meno 4, mentre gli animali più anziani possono avere dimensioni covata inferiore. </li><li> Tagliare un filtro pAPER per adattarsi un piatto 60 millimetri con 25 mm x 25 mm Foro quadrato e posto su una piastra di testa di serie (Figura 1E). NOTA: Un pugno quadrato può essere utilizzato, ma le dimensioni del punzone non deve essere preciso. </li><li> Goccia 100 ml di 100 mM CuCl 2 sulla carta da filtro in modo uniforme per restringere vermi all&#39;interno del foro quadrato sulla piastra. </li><li> Scegliere il numero desiderato di gravide giovani adulti ermafroditi (vedi punto 3 per un esempio) e trasferimento al centro della piastra CuCl 2. </li><li> Indossare occhiali di protezione laser. </li><li> Accendere il LED e il generatore di funzioni. </li><li> Attivare la leva del controller LED a &#39;Ext.&#39; controllarlo dal generatore di funzione (Figura 1D). </li><li> Impostare il controller al 65% della potenza massima e il generatore di funzioni come onda sinusoidale, 4 Hz (Figura 1C). </li><li> Posizionare la piastra CuCl 2 dal passo 2.5 senza coperchio sulla scena sotto il LED (Figura 1A &lt;/ Strong&gt;). </li><li> Illuminare gli animali con luce blu per 30 minuti. </li><li> Trasferire i vermi in cerca sani per un piatto testa di serie come P 0. NOTA: Il numero desiderato di P 0 dipende dal tipo di schermata. Vedere il punto 3 per un esempio. I P 0 vermi possono sembrare essere scoordinato immediatamente dopo il trattamento della luce e si riprenderà nel corso del tempo. </li><li> Mantenere vermi coperti con un foglio in un incubatore o al buio; e seguire la procedura standard per iniziare lo screening fenotipi desiderati tra loro progenie 2,10. </li></ol> 3. Esempio di uno screening genetico di andata NOTA:. Questo è un esempio della schermata clonale con 120 genomi aploidi per verificare se il LED e la tensione funzionano figura 2 mostra uno schema del procedimento. <ol><li> [Day1] Dopo il trattamento la luce blu, raccogliere cinque worm cerca sani su un piatto NGM con OP50 come P 0, tenerli in un 20 ° C incubatore, e far loro deporre le uova per 1D (targa &#39;1 ° giorno&#39;). </li><li> [Day2] Trasferimento P 0 su una nuova piastra di testa di serie (piastra &#39;Day2&#39;). </li><li> [Giorno 3] Raccogliere e uccidere P 0 sulla targhetta &#39;Day2&#39; bruciandoli. </li><li> [Day4] Raccogliere 30 gravido giovane adulto F 1 dal piatto del &#39;1 ° giorno&#39; e trasferirli su singoli piatti (30 F 1 Piano per &#39;1 ° giorno&#39;). </li><li> [5 ° giorno] Ripetere il punto 3.4 per la targa &#39;Day2&#39; (30 F 1 piastre per &#39;Day2&#39;). </li><li> [Day7-9] Controllare le morfologie anormali e / o comportamenti di F 2 vermi rispetto al ceppo WT (Figura 3a) allo stereomicroscopio standard quando diventano adulti. NOTA: A ereditarie mutazione mostra circa un quarto di vermi con lo stesso fenotipo tra F 2 quando è recessiva con elevata penetranza. Tuttavia, alcuni mutanti possono crescere lentamente e / o mostrare penetranza parziale. Pertanto, è possibile che meno di un quarto dei mutanti può essere trovato unpiatto. </li><li> Raccogliere i vermi con fenotipi visibili individualmente e controllare l&#39;ereditabilità del fenotipo nella prossima generazione. </li></ol> 4. Esempio di integrazione extrachromosomal Transgene <ol><li> Iniettare il DNA di interesse in CZ20310 juSi164 [Pmex-5-his-72 :: miniSOG-3&#39;UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ED3) e preparare i vermi transgenici con un basso tasso di trasmissione (10-30%), a seguito di un protocollo di 12,13 iniezione standard. NOTA: In alternativa, gli array extracromosomici stabiliti possono essere attraversate in ceppi juSi164. Per evitare genotipizzazione per juSi164, eterozigoti juSi164 possono essere utilizzati come P 0 malgrado l&#39;efficienza potrebbe essere diminuita. Il metodo di genotipizzazione per juSi164 è descritta nel paragrafo 5. </li><li> [Day1] Trattare ~ 20 animali transgenici come P 0 con luce blu come descritto al punto 2. NOTA: Più P 0 vermi sono necessarie a seconda del TR<html> tasso asmissione. Transgeni possono essere identificati da fenotipi o pennarello co-iniezione 12,13. </li><li> Raccogliere 10 sano P cercando 0 su piatti individuali, tenerli in un incubatore a 20 °, e far loro deporre le uova per un paio di giorni (P 0 piastre) </li><li> [Day4] individuare 20 transgenici F 1 vermi da ogni piatto P 0 su piatti individuali e far loro deporre le uova. (20 F 1 x 10 p 0 piastre = 200 f 1 piastre in totale.) </li><li> [Day7] Trova F 1 piatti con&gt; 75% F 2 con transgeni. </li><li> Scegliere cinque animali transgenici dalla velocità di trasmissione&gt; 75% F 1 piastre (F 2 piastre). </li><li> [Giorno10] Tenere F 2 piastre con velocità di trasmissione di 100% come potenziali linee integrate. </li><li> Outcross le linee potenziali integrati utilizzando una procedura standard 10 per controllare la segregazione mendeliana e di togliere eventuali mutazioni di fondo. </li></ol>Le &quot;&gt; 5. genotipizzazione <ol><li> Lyse 20 outcrossed F 2 vermi in tampone di lisi utilizzando un protocollo standard di 14. </li><li> Eseguire PCR utilizzando i primer per l&#39;inserimento MosSCI 9, juSi164, (Tabella 1) con una temperatura di ricottura di 58 ° C seguendo un protocollo standard 14. NOTA: Non è necessario genotipo unc-119 (ED3) perché unc-119 (ED3) può essere rilevato da un comportamento non coordinato dopo aver rimosso il transgene salvataggio (juSi164) nei seguenti passi 5.4 e 5.5. </li><li> Eseguire agarosio elettroforesi su gel 15 ed esaminare le dimensioni delle bande (Tabella 1) per trovare il WT per juSi164. </li><li> Esaminare se la progenie F 2 ha paralizzato i vermi a causa dell&#39;esistenza di unc-119 (ED3). </li><li> Se i vermi non coordinate si trovano sul gradino 5.4, singoli diversi vermi nonuncoordinated per ottenere tutti i vermi nonuncoordinated nella prossima generazione. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Qui, descriviamo una procedura dettagliata di mutagenesi optogenetic usando la sua-mSOG espresso nella linea germinale e fornire un esempio di uno screening genetico in avanti su piccola scala. Rispetto alla mutagenesi chimica standard, questo metodo di mutagenesi optogenetic ha diversi vantaggi. In primo luogo, non è tossico, mantenendo in tal modo il personale di laboratorio da mutageni chimici tossici come SME, ITA e trimethylpsoralen con la luce ultravioletta (TMP / UV). In secondo luogo, la procedura sperimentale di mutagenesi può essere utilizzato per un piccolo numero di P 0 animali e può essere rifinita in un&#39;ora. In terzo luogo, la mutagenesi optogenetic produce un ampio spettro di mutazioni comprese le sostituzioni nucleotidiche e delezioni cromosomiche. Infine, la mutagenesi optogenetic può essere utilizzato per l&#39;integrazione dei transgeni extracromosomici. Il passo fondamentale in questo protocollo mutagenesi è quello di garantire che il setup LED lavora sul suo-mSOG contenenti ceppi presso l&#39;exefficienza pected. Si consiglia di eseguire una schermata clonale pilota, come descritto nel protocollo Sezione 3, con circa 100 genomi aploidi. La mutagenesi è facilmente scalabile da piccole dimensioni schermi pilota agli schermi nonclonal aumentando il numero di P 0 per il trattamento di luce. Per schermi nonclonal su larga scala, si consiglia di sincronizzare i vermi a gravido giovani adulti e il trasferimento di centinaia di loro con la soluzione M9 in un piatto CuCl 2 per il trattamento della luce. La condizione standard descritto ai punti 2 e 3 si stima che l&#39;efficienza di circa 4,4 volte inferiore rispetto al diffuso metodo di mutagenesi 50 mM SME 4. Il tasso di mutazione può essere migliorata aumentando il tempo di esposizione alla luce e / o aumentando l&#39;intensità della luce. Tuttavia, queste modifiche possono causare fototossicità e portare a dimensioni ridotte covata e la malattia di vermi luminosi trattati. Per aumentare l&#39;efficienza, può essere possibile utilizzare derivati ​​miniSOG con maggiore ROS resa talecome miniSOG (Q103L) anche se può aumentare l&#39;effetto di sfondo mutagenesi senza trattamento luce 16,17. Per la modifica del costrutto di DNA, la Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3&#39;UTR (TBB-2) plasmide (pCZ886) è disponibile in commercio. Nelle condizioni descritte qui, transgeni integrati vengono generati a circa una linea per ogni 200 F 1, in media, 4 quando si utilizza un ceppo transgenico extracromosomico con una velocità di trasmissione di 10 - 30%. Questa efficienza può essere aumentata utilizzando ceppi transgenici extracromosomici con elevate velocità di trasmissione Come riportato in precedenza per un metodo di radiazione UV 18. His-mSOG mediata mutagenesi optogenetic induce mutazioni in una vasta gamma di geni. Inoltre, la frequenza di loci recuperato dallo schermo soppressore rpm-1 mediante mutagenesi optogenetic è simile a quelli dalla stessa schermata usando EMS 4. Tuttavia, è posBLE che mutagenesi optogenetic utilizzando un gene istone può avere una polarizzazione verso alcuni geni, a causa di fattori sconosciuti come la struttura della cromatina. Per risolvere questo problema, è necessario analizzare molte mutazioni indotte da optogenetically sequenziamento dell&#39;intero genoma. His-mSOG mediata mutagenesi optogenetic provoca un ampio spettro di mutazioni comprese sostituzioni nucleotidiche singoli e delezioni vanno da 1 bp a qualche centinaio bp 4. Lo spettro di varianti singolo nucleotide suggerisce che le specie reattive dell&#39;ossigeno miniSOG-indotti sono la causa delle mutazioni 4. E &#39;anche possibile che i danni miniSOG istone proteine e provoca cromatina instabilità perché miniSOG è utilizzato per inattivare proteine così 19. Può essere possibile manipolare il tipo di mutazioni utilizzando la luce di diversa intensità. Dal momento che la mutagenesi optogenetic provoca eliminazioni, è importante analizzare le eliminazioni così come i cambiamenti a singolo nucleotide chedati le sequenziamento del genoma per la mappatura 20. In precedenza era stato riferito che un microscopio epifluorescente viene utilizzato per miniSOG mediata l&#39;ablazione delle cellule 21,22. L&#39;intensità luminosa di un microscopio composto epifluorescente standard è stato misurato essere ~ 0,5 mW / mm 2 senza lente, che è circa 4 volte inferiore a quello utilizzato nel protocollo di mutagenesi optogenetic standard. Quindi, è altamente consigliabile determinare empiricamente la efficienza nell&#39;utilizzo un microscopio epi fluorescente come fonte luminosa. Un vantaggio del LED è la stabilità per migliaia di ore. Studi precedenti hanno mostrato che miniSOG è più potente ablazione cellule ROS-mediata sotto luce pulsata 22, anche se il meccanismo preciso resta da determinare. Abbiamo usato una funzione di generatore / amplificatore digitale per fare luce pulsata. Un&#39;altra opzione è quella di collegare la sorgente di luce a un computer tramite l&#39;interfaccia USB-TTL (Figura 1A) per regolare la Li LEDGHT da un programma. Il sistema a LED qui descritto può essere utilizzato anche per altri scopi, come il controllo optogenetic di cellule eccitabili utilizzando channelrhodopsin 23, l&#39;ablazione delle cellule utilizzando mitochondria- o membrana cellulare mirati miniSOG 17,22, e Cromoforo-Assisted luce inattivazione (CALI) di proteine 19. Inoltre, questo mutagenesi optogenetic ha il potenziale per essere applicata ad altri organismi, come batteri, lieviti, volare, e zebrafish, così come le linee cellulari di mammiferi.

Schermi genetici a termine sono stati ampiamente utilizzati per generare mutanti genetici che perturbano vari processi biologici in organismi modello come il Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1. Le analisi di questi mutanti portano alla scoperta dei geni funzionalmente importanti e loro vie di segnalazione 1,2. Tradizionalmente, mutagenesi in C. elegans si ottiene utilizzando prodotti chimici mutageni, radiazioni, o trasposoni 2. Sostanze chimiche come metanosolfonato etile (EMS) e N -ethyl- N -nitrosourea (ITA) sono tossici per l&#39;uomo; raggi gamma o raggi ultravioletti (UV) mutagenesi richiede attrezzature speciali; e ceppi trasposoni-attivi, come ad esempio ceppi mutatori 3, possono causare mutazioni inutili durante la manutenzione. Abbiamo sviluppato un approccio semplice per indurre mutazioni ereditarie con un fotosensibilizzante geneticamente codificato 4. Specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) possono danneggiare il DNA 5.Il generatore mini ossigeno singoletto (miniSOG) è una proteina fluorescente verde di 106 aminoacidi che è stato progettato dalla LOV (luce, ossigeno, e tensione) del dominio di Arabidopsis phototropin 2 6. Dopo l&#39;esposizione alla luce blu (~ 450 nm), miniSOG genera ROS compreso l&#39;ossigeno singoletto con fl avin mononucleotide come cofattore 6-8, che è presente in tutte le cellule. Abbiamo costruito una proteina di fusione His-mSOG etichettando miniSOG al C-terminale dell&#39;istone-72, un C. elegans variante dell&#39;istone 3. Abbiamo generato una singola copia transgene 9 per esprimere la sua-mSOG nella linea germinale di C. elegans. In condizioni di coltura normali nel buio, i vermi transgenici His-mSOG hanno dimensioni normali covata e durata 4. Al momento l&#39;esposizione alla luce blu del LED, i vermi His-mSOG producono mutazioni ereditarie tra loro progenie 4. Lo spettro di mutazioni indotte include cambiamenti nucleotide, come ad esempio G: C a T: A e G: C a C: G, e piccoli chromosoMi eliminazioni 4. Questa procedura mutagenesi è semplice da eseguire, e richiede l&#39;installazione minima di sicurezza del laboratorio. Qui, descriviamo l&#39;installazione di illuminazione a LED e le procedure per la mutagenesi optogenetic.

<table><tbody><tr><td>Ultra High Power LED light source</td><td>Prizmatix</td><td>UHP-mic-LED-460</td><td>460 &amp;plusmn; 5 nm</td></tr><tr><td>LED controller</td><td>Prizmatix</td><td>UHPLCC-01</td><td></td></tr><tr><td>Digital function generator/amplifier</td><td>PASCO</td><td>PI-9587C</td><td>PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.</td></tr><tr><td>BNC cable male/male</td><td>THORLABS</td><td>CA3136</td><td></td></tr><tr><td>USB-TTL interface</td><td>Prizmatix</td><td></td><td>Optional</td></tr><tr><td>Photometer</td><td>THORLABS</td><td>PM50 and Model D10MM</td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Whatman</td><td>1001-110</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>MZ95</td><td></td></tr><tr><td>NGM plate</td><td></td><td></td><td>Dissolve 5 g NaCl, 2.5 g Peptone, 20 g Agar, 10 &amp;micro;g/mL cholesterol in 1 L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. After autoclaving, add 1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 25 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(pH 6.0).&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lysis solution</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris(pH 8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100, 2.5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 100 &amp;micro;g/mL Proteinase K</td></tr></tbody></table>

optogenetic random mutagenesis using histone-minisog in c. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Abbiamo condotto uno screening genetico in avanti con CZ20310 juSi164 unc-119 (ED3) con l&#39;esposizione alla luce 30 minuti seguendo il protocollo standard descritto nelle sezioni 2 e 3. Tra 60 F 1 piastre corrispondenti a 120 genomi aploidi mutagenizzate, abbiamo trovato 8 F 1 piatti con F 2 vermi che mostrano fenotipi visibili, come difetti dimensioni del corpo (figura 3B), il movimento scoordinato (Figura 3C), e la letalità degli adulti (Figura 3D). Non abbiamo notato alcuna differenza nel numero di mutanti tra &#39;1 ° giorno&#39; e le piastre &#39;Day2&#39;. Tutti progenie di piccoli individuati F 2 vermi e non coordinati F 2 vermi ha mostrato i fenotipi corrispondenti, suggerendo che essi sono mutanti ereditarie. L&#39;osservazione completo è riassunta in Tabella 2. In media, una schermata clonale con 120 genomi aploidi si tradurrà in circa 10 F 1 piastre concontenente vermi con fenotipi visibilmente rilevabili come la forma del corpo e locomozione che facilmente individuato sotto uno stereomicroscopio. Più analisi quantitativa è necessario determinare il tasso di mutazione esattamente 4. Il numero atteso di mutanti visibili da questa schermata suggerisce che il ceppo e la configurazione funzionino correttamente per mutagenesi optogenetic. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54810/54810fig1.jpg" /> Figura 1:. Setup LED (A) L&#39;intero sistema. Il LED è stato montato su un supporto su misura. Dettagli si trovano nella lista dei materiali. (B) Il coperchio è realizzato in plastica. Esso non copre completamente il sistema per evitare l&#39;accumulo di calore. (C) di controllo e la funzione di generatore. (D) Il lato posteriore del sistema. (E) Un piatto di testa di serie con CuCl 2 carta da filtro -soaked per il trattamento luce blu.<html> <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54810/54810fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54810/54810fig2.jpg" /> Figura 2:. Procedura sperimentale per uno schermo Clonal Dopo il trattamento la luce blu, P 0 vermi vengono trasferite a un piatto di teste di serie e ha permesso di deporre le uova. P 0 vermi vengono trasferiti in una nuova piastra testa di serie 1 d dopo il trattamento della luce e hanno ucciso 2 d dopo il trattamento della luce. F 1 vermi vengono individuati dai P 0 piastre. Fenotipi di F 2 vermi vengono esaminati dopo diventano adulti. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54810/54810fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 10fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Esempio di Mutants (A) ceppo originale per la mutagenesi optogenetic:. CZ20310 juSi164 unc-119 (ED3). Questo ceppo ha normale forma del corpo, il comportamento e le dimensioni covata. Barra di scala: 0,5 mm. . (B - D) F 2 progenie difetto mostrando dimensioni del corpo (B), scoordinato (C), e (D) fenotipi letali <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54810/54810fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/54810/54810table1.jpg" /> Tabella 1: genotipizzazione di juSi164 e unc-119 (ED3). <img alt="Tabella 2" src="/files/ftp_upload/54810/54810table2.jpg" /> Tabella 2: Esempio di fenotipi from uno schermo clonale.

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Mutagenesi optogenetica casuale utilizzando l'istone-miniSOG in C. elegans | Genetica | Video

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Geneticamente codificato istone-miniSOG induce genome-wide mutazioni ereditarie in un modo dipendente dalla luce blu. Questo metodo mutagenesi è semplice, veloce, privo di sostanze chimiche tossiche, e ben si adatta per lo screening genetico in avanti e l&#39;integrazione del transgene.

Optogenetic caso Mutagenesi Utilizzando istone-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

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Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

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9.1K Views.  University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute.  Geneticamente codificato istone-miniSOG induce genome-wide mutazioni ereditarie in un modo dipendente dalla luce blu. Questo metodo mutagenesi è semplice, veloce, privo di sostanze chimiche tossiche, e ben si adatta per lo screening genetico in avanti e l'integrazione del transgene. 

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Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Mirata<em&gt; In Situ</em&gt; mutagenesi dell&#39;istone geni in germogliamento lievito

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

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Genetica

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

Gene targeting mutagenesi casuale per selezionare eterocromatina-destabilizzare Proteasome mutanti in lievito di fissione

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been co-opted as a powerful tool for precise eukaryotic genome engineering. Here, we present a rapid and simple method using chimeric single guide RNAs (sgRNA) and CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) for the efficient and precise generation of genomic point mutations in C. elegans. We describe a pipeline for sgRNA target selection, homology-directed repair (HDR) template design, CRISPR-Cas9-RNP complexing and delivery, and a genotyping strategy that enables the robust and rapid identification of correctly edited animals. Our approach not only permits the facile generation and identification of desired genomic point mutant animals, but also facilitates the detection of other complex indel alleles in approximately 4 - 5 days with high efficiency and a reduced screening workload.

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Here, we present a method to engineer the genome of C. elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins and homology dependent repair templates.

Un veloce e Facile Pipeline per generazione di mutanti di punto Genomic in c. elegans utilizzando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

Applicazione di RNAi ed espressione di fattore di trascrizione indotta da calore-shock per riprogrammare le cellule germinali ai neuroni in c. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Biologia dello sviluppo

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Neuroscienze

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

Introduzione al Laboratorio Worm: da Worms coltura a mutagenesi

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Biologia

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that exhibit partial and variable transmission rates of extrachromosomal arrays to the next generation. In addition, transgenic animals are mosaic and express the transgene in a variable number of cells. Extrachromosomal arrays can be integrated into the C. elegans genome using UV irradiation to establish nonmosaic transgenic strains with 100% transmission rate of the transgene. To that extent, F1 progenies of UV irradiated transgenic animals are screened for animals carrying a heterozygous integration of the transgene, which leads to a 75% Mendelian transmission rate to the F2 progeny. One of the challenges of this method is to distinguish between the percentage of transgene transmission in a population before (X% transgenic animals) and after integration (&#8805;75% transgenic F2 animals). Thus, this method requires choosing a nonintegrated transgenic line with a percentage of transgenic animals that is significantly lower than the Mendelian segregation of 75%. Consequently, nonintegrated transgenic lines with an extrachromosomal array transmission rate to the next generation &#8804;60% are usually preferred for integration, and transgene integration in highly transmitting strains is difficult. Here we show that the efficiency of extrachromosomal arrays integration into the genome is increased when using highly transmitting transgenic lines (&#8805;80%). The described protocol allows for easy selection of several independent lines with homozygous transgene integration into the genome after UV irradiation of transgenic worms exhibiting a high rate of extrachromosomal array transmission. Furthermore, this method is quite fast and low material consuming. The possibility of rapidly generating different lines that express a particular integrated transgene is of great interest for studies focusing on gene expression pattern and regulation, protein localization, and overexpression, as well as for the development of subcellular markers.

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

This protocol describes a rapid and low material consuming procedure for the integration of transgenic extrachromosomal arrays into the Caenorhabditis elegans genome using ultra violet (UV) irradiation. Furthermore, this protocol is particularly well suited for transgenic lines that transmit extrachromosomal arrays at a high rate.

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

Metodi di studio variazioni inerenti l'aggregazione proteica con l'età in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

RNAi Feeding in Liquid Culture: A High-Throughput Method to Knockdown Gene Expression in C. elegans

Source: Groh, N. et al. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/video/56464/methods-to-study-changes-inherent-protein-aggregation-with-age">Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in&#160;Caenorhabditis elegans</a>.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2017).
RNAi is powerful genetic tool available to C. elegans researchers. This video introduces a method to treat more worms with RNAi than plate feeding by utilizing liquid culture conditions.

Alimentazione dell'RNAi in coltura liquida: un metodo ad alto rendimento per abbattere l'espressione genica in C. elegans

Source: Groh, N. et al. Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in&#160;Caenorhabditis elegans.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2017).
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Optogenetic caso Mutagenesi Utilizzando istone-miniSOG in

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In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

Introduzione al Laboratorio Worm: da Worms coltura a mutagenesi

Imaging C. elegans Gli embrioni utilizzando un microscopio epifluorescente e Software Open Source

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Metodi di studio variazioni inerenti l'aggregazione proteica con l'età in Caenorhabditis elegans

Alimentazione dell'RNAi in coltura liquida: un metodo ad alto rendimento per abbattere l'espressione genica in C. elegans