The work is supported by HHMI. We thank our lab members for their help with testing the protocol and revising the manuscript.

1. Costruzione del illuminatore LED NOTA: L&#39;attrezzatura necessaria a LED è riassunto nella lista dei materiali. L&#39;intera impostazione del LED è piccolo e può essere posizionato in qualsiasi punto in laboratorio, anche se si consiglia di riporla in una stanza buia per controllare la luce l&#39;esposizione di vermi 4. <ol><li> Collegare il LED ad un controllore con cavi (Figura 1A, D). </li><li> Collegare il controller per una funzione generatore / amplificatore digitale con un cavo BNC (Figura 1A, C, D). </li><li> Fissare i LED luminosi 10 cm sopra il palco con un supporto personalizzato (Figura 1A). NOTA: Abbiamo fatto il supporto con parti metalliche. </li><li> Coprire l&#39;installazione di illuminazione a LED in parte, ma evitare accumulo di calore (Figura 1B), il che rende i vermi malati. NOTA: Usiamo una copertina rigida in plastica su misura con la parte superiore aperta e in basso (Figura 1A). Il rivestimento non è necessario per la mutagenesi in sé, ma è usato to limitare l&#39;esposizione non necessaria della luce blu per l&#39;ambiente circostante. Si consiglia di non coprire il setup LED completamente (Figura 1B) per evitare il surriscaldamento dei vermi. </li><li> Indossare occhiali di protezione laser. NOTA: indossare gli occhiali di protezione laser, perché la luce è molto luminoso. Occhiali da sole può funzionare così. </li><li> Attivare la leva del regolatore LED di &#39;Int.&#39; per illuminazione continua (Figura 1D) e impostarlo al 65% della potenza massima (Figura 1C). </li><li> Utilizzare un fotometro per misurare l&#39;intensità della luce blu sul palco dove i vermi sono posizionati utilizzando il protocollo del produttore. La configurazione dà 2,0 mW / mm 2 sotto illuminazione continua. </li></ol> 2. Trattamento Light Blue NOTA: utilizzare il ceppo CZ20310 juSi164 [Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3&#39;UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ED3) III 4 Il ceppo è disponibile. presso il Caenorhabditis Genetics center (CGC, http: //www.cgc.cbs.umn.edu/). <ol><li> Mantenere il ceppo His-mSOG al buio su terreno di coltura nematode standard (NGM) piatti con E. coli OP50 seguendo un protocollo standard di 10,11. NOTA: In luce ambiente, juSi164 ceppi contenenti, non visualizzano un tasso di mutazione di sopra di un tasso di spontanea 4. passaggio ceppo di routine utilizzando un ambito dissezione con una lampada alogena in genere non causare mutazioni pure. Tuttavia, occorre prestare attenzione per evitare l&#39;esposizione inutile alla luce, ad esempio, mantenendo i ceppi in un incubatore scuro all&#39;interno di serie, o coprendo i ceppi con un foglio. Si consiglia di congelare aliquote del ceppo dopo averlo ricevuto nel caso in cui le mutazioni inutili si accumulano nel tempo. </li><li> Scegliere gravido giovane adulto (circa post-L4 12 h) gli animali con un verme scegliere 11. NOTA: gli animali più giovani mostrare effetto mutageno meno 4, mentre gli animali più anziani possono avere dimensioni covata inferiore. </li><li> Tagliare un filtro pAPER per adattarsi un piatto 60 millimetri con 25 mm x 25 mm Foro quadrato e posto su una piastra di testa di serie (Figura 1E). NOTA: Un pugno quadrato può essere utilizzato, ma le dimensioni del punzone non deve essere preciso. </li><li> Goccia 100 ml di 100 mM CuCl 2 sulla carta da filtro in modo uniforme per restringere vermi all&#39;interno del foro quadrato sulla piastra. </li><li> Scegliere il numero desiderato di gravide giovani adulti ermafroditi (vedi punto 3 per un esempio) e trasferimento al centro della piastra CuCl 2. </li><li> Indossare occhiali di protezione laser. </li><li> Accendere il LED e il generatore di funzioni. </li><li> Attivare la leva del controller LED a &#39;Ext.&#39; controllarlo dal generatore di funzione (Figura 1D). </li><li> Impostare il controller al 65% della potenza massima e il generatore di funzioni come onda sinusoidale, 4 Hz (Figura 1C). </li><li> Posizionare la piastra CuCl 2 dal passo 2.5 senza coperchio sulla scena sotto il LED (Figura 1A &lt;/ Strong&gt;). </li><li> Illuminare gli animali con luce blu per 30 minuti. </li><li> Trasferire i vermi in cerca sani per un piatto testa di serie come P 0. NOTA: Il numero desiderato di P 0 dipende dal tipo di schermata. Vedere il punto 3 per un esempio. I P 0 vermi possono sembrare essere scoordinato immediatamente dopo il trattamento della luce e si riprenderà nel corso del tempo. </li><li> Mantenere vermi coperti con un foglio in un incubatore o al buio; e seguire la procedura standard per iniziare lo screening fenotipi desiderati tra loro progenie 2,10. </li></ol> 3. Esempio di uno screening genetico di andata NOTA:. Questo è un esempio della schermata clonale con 120 genomi aploidi per verificare se il LED e la tensione funzionano figura 2 mostra uno schema del procedimento. <ol><li> [Day1] Dopo il trattamento la luce blu, raccogliere cinque worm cerca sani su un piatto NGM con OP50 come P 0, tenerli in un 20 ° C incubatore, e far loro deporre le uova per 1D (targa &#39;1 ° giorno&#39;). </li><li> [Day2] Trasferimento P 0 su una nuova piastra di testa di serie (piastra &#39;Day2&#39;). </li><li> [Giorno 3] Raccogliere e uccidere P 0 sulla targhetta &#39;Day2&#39; bruciandoli. </li><li> [Day4] Raccogliere 30 gravido giovane adulto F 1 dal piatto del &#39;1 ° giorno&#39; e trasferirli su singoli piatti (30 F 1 Piano per &#39;1 ° giorno&#39;). </li><li> [5 ° giorno] Ripetere il punto 3.4 per la targa &#39;Day2&#39; (30 F 1 piastre per &#39;Day2&#39;). </li><li> [Day7-9] Controllare le morfologie anormali e / o comportamenti di F 2 vermi rispetto al ceppo WT (Figura 3a) allo stereomicroscopio standard quando diventano adulti. NOTA: A ereditarie mutazione mostra circa un quarto di vermi con lo stesso fenotipo tra F 2 quando è recessiva con elevata penetranza. Tuttavia, alcuni mutanti possono crescere lentamente e / o mostrare penetranza parziale. Pertanto, è possibile che meno di un quarto dei mutanti può essere trovato unpiatto. </li><li> Raccogliere i vermi con fenotipi visibili individualmente e controllare l&#39;ereditabilità del fenotipo nella prossima generazione. </li></ol> 4. Esempio di integrazione extrachromosomal Transgene <ol><li> Iniettare il DNA di interesse in CZ20310 juSi164 [Pmex-5-his-72 :: miniSOG-3&#39;UTR (TBB-2) + Cb-unc-119 (+)] unc-119 (ED3) e preparare i vermi transgenici con un basso tasso di trasmissione (10-30%), a seguito di un protocollo di 12,13 iniezione standard. NOTA: In alternativa, gli array extracromosomici stabiliti possono essere attraversate in ceppi juSi164. Per evitare genotipizzazione per juSi164, eterozigoti juSi164 possono essere utilizzati come P 0 malgrado l&#39;efficienza potrebbe essere diminuita. Il metodo di genotipizzazione per juSi164 è descritta nel paragrafo 5. </li><li> [Day1] Trattare ~ 20 animali transgenici come P 0 con luce blu come descritto al punto 2. NOTA: Più P 0 vermi sono necessarie a seconda del TR<html> tasso asmissione. Transgeni possono essere identificati da fenotipi o pennarello co-iniezione 12,13. </li><li> Raccogliere 10 sano P cercando 0 su piatti individuali, tenerli in un incubatore a 20 °, e far loro deporre le uova per un paio di giorni (P 0 piastre) </li><li> [Day4] individuare 20 transgenici F 1 vermi da ogni piatto P 0 su piatti individuali e far loro deporre le uova. (20 F 1 x 10 p 0 piastre = 200 f 1 piastre in totale.) </li><li> [Day7] Trova F 1 piatti con&gt; 75% F 2 con transgeni. </li><li> Scegliere cinque animali transgenici dalla velocità di trasmissione&gt; 75% F 1 piastre (F 2 piastre). </li><li> [Giorno10] Tenere F 2 piastre con velocità di trasmissione di 100% come potenziali linee integrate. </li><li> Outcross le linee potenziali integrati utilizzando una procedura standard 10 per controllare la segregazione mendeliana e di togliere eventuali mutazioni di fondo. </li></ol>Le &quot;&gt; 5. genotipizzazione <ol><li> Lyse 20 outcrossed F 2 vermi in tampone di lisi utilizzando un protocollo standard di 14. </li><li> Eseguire PCR utilizzando i primer per l&#39;inserimento MosSCI 9, juSi164, (Tabella 1) con una temperatura di ricottura di 58 ° C seguendo un protocollo standard 14. NOTA: Non è necessario genotipo unc-119 (ED3) perché unc-119 (ED3) può essere rilevato da un comportamento non coordinato dopo aver rimosso il transgene salvataggio (juSi164) nei seguenti passi 5.4 e 5.5. </li><li> Eseguire agarosio elettroforesi su gel 15 ed esaminare le dimensioni delle bande (Tabella 1) per trovare il WT per juSi164. </li><li> Esaminare se la progenie F 2 ha paralizzato i vermi a causa dell&#39;esistenza di unc-119 (ED3). </li><li> Se i vermi non coordinate si trovano sul gradino 5.4, singoli diversi vermi nonuncoordinated per ottenere tutti i vermi nonuncoordinated nella prossima generazione. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Qui, descriviamo una procedura dettagliata di mutagenesi optogenetic usando la sua-mSOG espresso nella linea germinale e fornire un esempio di uno screening genetico in avanti su piccola scala. Rispetto alla mutagenesi chimica standard, questo metodo di mutagenesi optogenetic ha diversi vantaggi. In primo luogo, non è tossico, mantenendo in tal modo il personale di laboratorio da mutageni chimici tossici come SME, ITA e trimethylpsoralen con la luce ultravioletta (TMP / UV). In secondo luogo, la procedura sperimentale di mutagenesi può essere utilizzato per un piccolo numero di P 0 animali e può essere rifinita in un&#39;ora. In terzo luogo, la mutagenesi optogenetic produce un ampio spettro di mutazioni comprese le sostituzioni nucleotidiche e delezioni cromosomiche. Infine, la mutagenesi optogenetic può essere utilizzato per l&#39;integrazione dei transgeni extracromosomici. Il passo fondamentale in questo protocollo mutagenesi è quello di garantire che il setup LED lavora sul suo-mSOG contenenti ceppi presso l&#39;exefficienza pected. Si consiglia di eseguire una schermata clonale pilota, come descritto nel protocollo Sezione 3, con circa 100 genomi aploidi. La mutagenesi è facilmente scalabile da piccole dimensioni schermi pilota agli schermi nonclonal aumentando il numero di P 0 per il trattamento di luce. Per schermi nonclonal su larga scala, si consiglia di sincronizzare i vermi a gravido giovani adulti e il trasferimento di centinaia di loro con la soluzione M9 in un piatto CuCl 2 per il trattamento della luce. La condizione standard descritto ai punti 2 e 3 si stima che l&#39;efficienza di circa 4,4 volte inferiore rispetto al diffuso metodo di mutagenesi 50 mM SME 4. Il tasso di mutazione può essere migliorata aumentando il tempo di esposizione alla luce e / o aumentando l&#39;intensità della luce. Tuttavia, queste modifiche possono causare fototossicità e portare a dimensioni ridotte covata e la malattia di vermi luminosi trattati. Per aumentare l&#39;efficienza, può essere possibile utilizzare derivati ​​miniSOG con maggiore ROS resa talecome miniSOG (Q103L) anche se può aumentare l&#39;effetto di sfondo mutagenesi senza trattamento luce 16,17. Per la modifica del costrutto di DNA, la Pmex-5-HIS-72 :: miniSOG-3&#39;UTR (TBB-2) plasmide (pCZ886) è disponibile in commercio. Nelle condizioni descritte qui, transgeni integrati vengono generati a circa una linea per ogni 200 F 1, in media, 4 quando si utilizza un ceppo transgenico extracromosomico con una velocità di trasmissione di 10 - 30%. Questa efficienza può essere aumentata utilizzando ceppi transgenici extracromosomici con elevate velocità di trasmissione Come riportato in precedenza per un metodo di radiazione UV 18. His-mSOG mediata mutagenesi optogenetic induce mutazioni in una vasta gamma di geni. Inoltre, la frequenza di loci recuperato dallo schermo soppressore rpm-1 mediante mutagenesi optogenetic è simile a quelli dalla stessa schermata usando EMS 4. Tuttavia, è posBLE che mutagenesi optogenetic utilizzando un gene istone può avere una polarizzazione verso alcuni geni, a causa di fattori sconosciuti come la struttura della cromatina. Per risolvere questo problema, è necessario analizzare molte mutazioni indotte da optogenetically sequenziamento dell&#39;intero genoma. His-mSOG mediata mutagenesi optogenetic provoca un ampio spettro di mutazioni comprese sostituzioni nucleotidiche singoli e delezioni vanno da 1 bp a qualche centinaio bp 4. Lo spettro di varianti singolo nucleotide suggerisce che le specie reattive dell&#39;ossigeno miniSOG-indotti sono la causa delle mutazioni 4. E &#39;anche possibile che i danni miniSOG istone proteine e provoca cromatina instabilità perché miniSOG è utilizzato per inattivare proteine così 19. Può essere possibile manipolare il tipo di mutazioni utilizzando la luce di diversa intensità. Dal momento che la mutagenesi optogenetic provoca eliminazioni, è importante analizzare le eliminazioni così come i cambiamenti a singolo nucleotide chedati le sequenziamento del genoma per la mappatura 20. In precedenza era stato riferito che un microscopio epifluorescente viene utilizzato per miniSOG mediata l&#39;ablazione delle cellule 21,22. L&#39;intensità luminosa di un microscopio composto epifluorescente standard è stato misurato essere ~ 0,5 mW / mm 2 senza lente, che è circa 4 volte inferiore a quello utilizzato nel protocollo di mutagenesi optogenetic standard. Quindi, è altamente consigliabile determinare empiricamente la efficienza nell&#39;utilizzo un microscopio epi fluorescente come fonte luminosa. Un vantaggio del LED è la stabilità per migliaia di ore. Studi precedenti hanno mostrato che miniSOG è più potente ablazione cellule ROS-mediata sotto luce pulsata 22, anche se il meccanismo preciso resta da determinare. Abbiamo usato una funzione di generatore / amplificatore digitale per fare luce pulsata. Un&#39;altra opzione è quella di collegare la sorgente di luce a un computer tramite l&#39;interfaccia USB-TTL (Figura 1A) per regolare la Li LEDGHT da un programma. Il sistema a LED qui descritto può essere utilizzato anche per altri scopi, come il controllo optogenetic di cellule eccitabili utilizzando channelrhodopsin 23, l&#39;ablazione delle cellule utilizzando mitochondria- o membrana cellulare mirati miniSOG 17,22, e Cromoforo-Assisted luce inattivazione (CALI) di proteine 19. Inoltre, questo mutagenesi optogenetic ha il potenziale per essere applicata ad altri organismi, come batteri, lieviti, volare, e zebrafish, così come le linee cellulari di mammiferi.

Schermi genetici a termine sono stati ampiamente utilizzati per generare mutanti genetici che perturbano vari processi biologici in organismi modello come il Caenorhabditis elegans (C. elegans) 1. Le analisi di questi mutanti portano alla scoperta dei geni funzionalmente importanti e loro vie di segnalazione 1,2. Tradizionalmente, mutagenesi in C. elegans si ottiene utilizzando prodotti chimici mutageni, radiazioni, o trasposoni 2. Sostanze chimiche come metanosolfonato etile (EMS) e N -ethyl- N -nitrosourea (ITA) sono tossici per l&#39;uomo; raggi gamma o raggi ultravioletti (UV) mutagenesi richiede attrezzature speciali; e ceppi trasposoni-attivi, come ad esempio ceppi mutatori 3, possono causare mutazioni inutili durante la manutenzione. Abbiamo sviluppato un approccio semplice per indurre mutazioni ereditarie con un fotosensibilizzante geneticamente codificato 4. Specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS) possono danneggiare il DNA 5.Il generatore mini ossigeno singoletto (miniSOG) è una proteina fluorescente verde di 106 aminoacidi che è stato progettato dalla LOV (luce, ossigeno, e tensione) del dominio di Arabidopsis phototropin 2 6. Dopo l&#39;esposizione alla luce blu (~ 450 nm), miniSOG genera ROS compreso l&#39;ossigeno singoletto con fl avin mononucleotide come cofattore 6-8, che è presente in tutte le cellule. Abbiamo costruito una proteina di fusione His-mSOG etichettando miniSOG al C-terminale dell&#39;istone-72, un C. elegans variante dell&#39;istone 3. Abbiamo generato una singola copia transgene 9 per esprimere la sua-mSOG nella linea germinale di C. elegans. In condizioni di coltura normali nel buio, i vermi transgenici His-mSOG hanno dimensioni normali covata e durata 4. Al momento l&#39;esposizione alla luce blu del LED, i vermi His-mSOG producono mutazioni ereditarie tra loro progenie 4. Lo spettro di mutazioni indotte include cambiamenti nucleotide, come ad esempio G: C a T: A e G: C a C: G, e piccoli chromosoMi eliminazioni 4. Questa procedura mutagenesi è semplice da eseguire, e richiede l&#39;installazione minima di sicurezza del laboratorio. Qui, descriviamo l&#39;installazione di illuminazione a LED e le procedure per la mutagenesi optogenetic.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="626">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Ultra High Power LED light source</td>
			<td style="width:71px;">Prizmatix</td>
			<td style="width:115px;">UHP-mic-LED-460</td>
			<td style="width:184px;">460 &#177; 5 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">LED controller</td>
			<td style="width:71px;">Prizmatix</td>
			<td style="width:115px;">UHPLCC-01</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:256px;">Digital function generator/amplifier</td>
			<td style="width:71px;">PASCO</td>
			<td style="width:115px;">PI-9587C</td>
			<td style="width:184px;">PI-9587C is no longer available. The replacement is PI-8127.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">BNC cable male/male</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td style="width:115px;">CA3136</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">USB-TTL interface</td>
			<td style="width:71px;">Prizmatix</td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:184px;">Optional</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:256px;">Photometer</td>
			<td style="width:71px;">THORLABS</td>
			<td style="width:115px;">PM50 and Model D10MM</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Filter paper</td>
			<td style="width:71px;">Whatman</td>
			<td style="width:115px;">1001-110</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:256px;">Copper chloride dihydrate (CuCl2&#8729;2H2O)</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:115px;">C6641</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:256px;">Stereomicroscope</td>
			<td style="width:71px;">Leica</td>
			<td style="width:115px;">MZ95</td>
			<td style="width:184px;"></td>
		</tr>
		<tr height="163">
			<td height="163" style="height:163px;width:256px;">NGM plate</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:184px;">Dissolve 5g NaCl, 2.5g Peptone, 20g Agar, 10 &#181;g/ml cholesterol in 1 L H2O. After autoclaving, add 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO4, 25 mM KH2PO4(pH6.0).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="88">
			<td height="88" style="height:88px;width:256px;">Lysis solution</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td style="width:184px;">10 mM Tris(pH8.8), 50 mM KCl, 0.1% Triton X100, 2.5 mM MgCl2, 100 &#181;g/ml Proteinase K</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optogenetic random mutagenesis using histone-minisog in c. elegans

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most mutagenesis-based screens, researchers have relied on the use of toxic chemicals, carcinogens, or irradiation, which requires designated equipment, safety setup, and/or disposal of hazardous materials. We have developed a simple approach to induce heritable mutations in C. elegans using germline-expressed histone-miniSOG, a light-inducible potent generator of reactive oxygen species. This mutagenesis method is free of toxic chemicals and requires minimal laboratory safety and waste management. The induced DNA modifications include single-nucleotide changes and small deletions, and complement those caused by classical chemical mutagenesis. This methodology can also be used to induce integration of extrachromosomal transgenes. Here, we provide the details of the LED setup and protocols for standard mutagenesis and transgene integration.

Abbiamo condotto uno screening genetico in avanti con CZ20310 juSi164 unc-119 (ED3) con l&#39;esposizione alla luce 30 minuti seguendo il protocollo standard descritto nelle sezioni 2 e 3. Tra 60 F 1 piastre corrispondenti a 120 genomi aploidi mutagenizzate, abbiamo trovato 8 F 1 piatti con F 2 vermi che mostrano fenotipi visibili, come difetti dimensioni del corpo (figura 3B), il movimento scoordinato (Figura 3C), e la letalità degli adulti (Figura 3D). Non abbiamo notato alcuna differenza nel numero di mutanti tra &#39;1 ° giorno&#39; e le piastre &#39;Day2&#39;. Tutti progenie di piccoli individuati F 2 vermi e non coordinati F 2 vermi ha mostrato i fenotipi corrispondenti, suggerendo che essi sono mutanti ereditarie. L&#39;osservazione completo è riassunta in Tabella 2. In media, una schermata clonale con 120 genomi aploidi si tradurrà in circa 10 F 1 piastre concontenente vermi con fenotipi visibilmente rilevabili come la forma del corpo e locomozione che facilmente individuato sotto uno stereomicroscopio. Più analisi quantitativa è necessario determinare il tasso di mutazione esattamente 4. Il numero atteso di mutanti visibili da questa schermata suggerisce che il ceppo e la configurazione funzionino correttamente per mutagenesi optogenetic. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54810/54810fig1.jpg" /> Figura 1:. Setup LED (A) L&#39;intero sistema. Il LED è stato montato su un supporto su misura. Dettagli si trovano nella lista dei materiali. (B) Il coperchio è realizzato in plastica. Esso non copre completamente il sistema per evitare l&#39;accumulo di calore. (C) di controllo e la funzione di generatore. (D) Il lato posteriore del sistema. (E) Un piatto di testa di serie con CuCl 2 carta da filtro -soaked per il trattamento luce blu.<html> <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54810/54810fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54810/54810fig2.jpg" /> Figura 2:. Procedura sperimentale per uno schermo Clonal Dopo il trattamento la luce blu, P 0 vermi vengono trasferite a un piatto di teste di serie e ha permesso di deporre le uova. P 0 vermi vengono trasferiti in una nuova piastra testa di serie 1 d dopo il trattamento della luce e hanno ucciso 2 d dopo il trattamento della luce. F 1 vermi vengono individuati dai P 0 piastre. Fenotipi di F 2 vermi vengono esaminati dopo diventano adulti. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54810/54810fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 10fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Esempio di Mutants (A) ceppo originale per la mutagenesi optogenetic:. CZ20310 juSi164 unc-119 (ED3). Questo ceppo ha normale forma del corpo, il comportamento e le dimensioni covata. Barra di scala: 0,5 mm. . (B - D) F 2 progenie difetto mostrando dimensioni del corpo (B), scoordinato (C), e (D) fenotipi letali <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/54810/54810fig3large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/54810/54810table1.jpg" /> Tabella 1: genotipizzazione di juSi164 e unc-119 (ED3). <img alt="Tabella 2" src="/files/ftp_upload/54810/54810table2.jpg" /> Tabella 2: Esempio di fenotipi from uno schermo clonale.

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Mutagenesi optogenetica casuale utilizzando l'istone-miniSOG in C. elegans | Genetica | Video

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Geneticamente codificato istone-miniSOG induce genome-wide mutazioni ereditarie in un modo dipendente dalla luce blu. Questo metodo mutagenesi è semplice, veloce, privo di sostanze chimiche tossiche, e ben si adatta per lo screening genetico in avanti e l&#39;integrazione del transgene.

Optogenetic caso Mutagenesi Utilizzando istone-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

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Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

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9.0K Views.  University of California in San Diego and Howard Hughes Medical Institute.  Geneticamente codificato istone-miniSOG induce genome-wide mutazioni ereditarie in un modo dipendente dalla luce blu. Questo metodo mutagenesi è semplice, veloce, privo di sostanze chimiche tossiche, e ben si adatta per lo screening genetico in avanti e l'integrazione del transgene. 

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Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.

Mirata<em&gt; In Situ</em&gt; mutagenesi dell&#39;istone geni in germogliamento lievito

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

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Genetica

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged as a powerful tool for gene-expression analysis and transcriptome mapping. However, handling RNA-Seq datasets requires sophisticated computational expertise and poses inherent challenges for biology researchers. This bottleneck has been mitigated by the open access Galaxy project that allows users without bioinformatics skills to analyze RNA-Seq data, and the Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID), a Gene Ontology (GO) term analysis suite that helps derive biological meaning from large data sets. However, for first-time users and bioinformatics' amateurs, self-learning and familiarization with these platforms can be time-consuming and daunting. We describe a straightforward workflow that will help C. elegans researchers to isolate worm RNA, conduct an RNA-Seq experiment and analyze the data using Galaxy and DAVID platforms. This protocol provides stepwise instructions for using the various Galaxy modules for accessing raw NGS data, quality-control checks, alignment, and differential gene expression analysis, guiding the user with parameters at every step to generate a gene list that can be screened for enrichment of gene classes or biological processes using DAVID. Overall, we anticipate that this article will provide information to C. elegans researchers undertaking RNA-Seq experiments for the first time as well as frequent users running a small number of samples.

Transcriptomic Analysis of C. elegans RNA Sequencing Data Through the Tuxedo Suite on the Galaxy Project

Galaxy and DAVID have emerged as popular tools that allow investigators without bioinformatics training to analyze and interpret RNA-Seq data. We describe a protocol for C. elegans researchers to perform RNA-Seq experiments, access and process the dataset using Galaxy and obtain meaningful biological information from the gene lists using DAVID.

Analisi trascrittomica di<em&gt; C</em&gt;.<em&gt; elegans</em&gt; RNA Sequencing dati attraverso la suite Tuxedo sul Progetto Galaxy

Next generation sequencing (NGS) technologies have revolutionized the nature of biological investigation. Of these, RNA Sequencing (RNA-Seq) has emerged ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. Therefore, DNA-protein interactions regulate multiple physiological, pathophysiological, and biological functions, such as cell differentiation, cell proliferation, cell cycle control, chromosome stability, epigenetic gene regulation, and cell transformation. In eukaryotic cells, the DNA interacts with histone and nonhistone proteins and is condensed into chromatin. Several technical tools can be used to analyze DNA-protein interactions, such as the Electrophoresis (gel) Mobility Shift Assay (EMSA) and DNase I footprinting. However, these techniques analyze the protein-DNA interaction in vitro, not within the cellular context. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a technique that captures proteins at their specific DNA binding sites, thereby allowing for the identification of DNA-protein interactions within their chromatin context. It is done by fixation&#160;of the DNA-protein interaction, followed by&#160;immunoprecipitation of the protein of interest. Subsequently, the genomic site that the protein was bound to is characterized. Here, we describe and discuss ChIP and demonstrate its analytical value for the identification of the Transforming Growth Factor-&#946; (TGF-&#946;)-induced binding of the transcription factor SMAD2 to SMAD Binding Elements (SBE) within the promoter region of the tyrosine-protein kinase Kit (c-KIT) receptor ligand Stem Cell Factor (SCF).

DNA-protein interactions are essential for multiple biological processes. During the evaluation of cellular functions, the analysis of DNA-protein interactions is indispensable for understanding gene regulation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to analyze such interactions in vivo.

Analisi del promotore di ligandi di c-KIT utilizzando l&#39;immunoprecipitazione cromatina

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this characteristic, Cpf1 has been used for the establishment of a DNA assembly standard called C-Brick, which has the advantage of long recognition sites and short scars. On a standard C-Brick vector, there are four Cpf1 recognition sites &#8211; the prefix (T1 and T2 sites) and the suffix (T3 and T4 sites) &#8211; flanking biological DNA parts. The cleavage of T2 and T3 sites produces complementary sticky ends, which allow for the assembly of DNA parts with T2 and T3 sites. Meanwhile, a short &#34;GGATCC&#34; scar is generated between parts after assembly. As the newly formed plasmid once again contains the four Cpf1 cleavage sites, the method allows for the iterative assembly of DNA parts, which is similar to those of BioBrick and BglBrick standards. A procedure outlining the use of the C-Brick standard to assemble DNA parts is described here. The C-Brick standard can be widely used by scientists, graduate and undergraduate students, and even amateurs.

CRISPR-associated protein Cpf1 can be guided by a specially designed CRISPR RNA (crRNA) to cleave double-stranded DNA at desired sites, generating sticky ends. Based on this characteristic, a DNA assembly standard (C-Brick) was established, and a protocol detailing its use is described here.

Protocolli per l&#39;assemblaggio standard di DNA C-Brick utilizzando Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on animal physiology and behavior. Recently, we showed that modulation of longevity in the nematode Caenorhabditis elegans by food abundance is more complex than previously recognized. The responsiveness of the lifespan to changes in food level is determined by specific genes that act by controlling information processing within a neural circuit. Our framework combines genetic analysis, high-throughput quantitative imaging and information theory. Here, we describe how these techniques can be used to characterize any gene that has a physiological relevance to broad-range dietary restriction. Specifically, this workflow is designed to reveal how a gene of interest regulates lifespan under broad-range dietary restriction; then to establish how the expression of the gene varies with food level; and finally, to provide an unbiased quantification of the amount of information conveyed by gene expression about food abundance in the environment. When several genes are examined simultaneously under the context of a neural circuit, this workflow can uncover the coding strategy employed by the circuit.

Quantification of Information Encoded by Gene Expression Levels During Lifespan Modulation Under Broad-range Dietary Restriction in C. elegans

Here, we present a framework to relate broad-range dietary restriction to gene expression and lifespan. We describe protocols for broad-range dietary restriction and for quantitative imaging of gene expression under this paradigm. We further outline computational analyses to reveal underlying information processing features of the genetic circuits involved in food-sensing.

Quantificazione delle informazioni codificate dal Gene Expression livelli durante la durata della vita modulazione sotto restrizione dietetica di ampio spettro, in c. elegans

Sensory systems allow animals to detect, process, and respond to their environment. Food abundance is an environmental cue that has profound effects on ...

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has been associated with both the progression of cancer and the development of drug resistance. Until now, it has not been feasible to easily manipulate the ploidy of a multicellular animal without generating mostly sterile progeny. Presented here is a simple and rapid protocol for generating tetraploid Caenorhabditis elegans animals from any diploid strain. This method allows the user to create a bias in chromosome segregation during meiosis, ultimately increasing ploidy in C. elegans. This strategy relies on the transient reduction of expression of the rec-8 gene to generate diploid gametes. A rec-8 mutant produces diploid gametes that can potentially produce tetraploids upon fertilization. This tractable scheme has been used to generate tetraploid strains carrying mutations and chromosome rearrangements to gain insight into chromosomal dynamics and interactions during pairing and synapsis in meiosis. This method is efficient for generating stable tetraploid strains without genetic markers, can be applied to any diploid strain, and can be used to derive triploid C. elegans. This straightforward method is useful for investigating other fundamental biological questions relevant to genome instability, gene dosage, biological scaling, extracellular signaling, adaptation to stress, development of resistance to drugs, and mechanisms of speciation.

Manipulation of Ploidy in Caenorhabditis elegans

This method allows for the generation of tetraploid and triploid Caenorhabditis nematodes from any diploid strain. Polyploid strains generated by this method have been used to study chromosome interactions in meiotic prophase, and this method is useful for examining important basic questions in cell, developmental, evolutionary, and cancer biology.

Manipolazione di Ploidy in Caenorhabditis elegans

Mechanisms that involve whole genome polyploidy play important roles in development and evolution; also, an abnormal generation of tetraploid cells has ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve random mutagenesis, error-prone PCR is a convenient and efficient strategy for generating a diverse pool of mutants (i.e., a mutant library). Error-prone PCR is the method of choice when a researcher seeks to mutate a pre-defined region, such as the coding region of a gene while leaving other genomic regions unaffected. After the mutant library is amplified by error-prone PCR, it must be cloned into a suitable plasmid. The size of the library generated by error-prone PCR is constrained by the efficiency of the cloning step. However, in the fission yeast, Schizosaccharomyces pombe, the cloning step can be replaced by the use of a highly efficient one-step fusion PCR to generate constructs for transformation. Mutants of desired phenotypes may then be selected using appropriate reporters. Here, we describe this strategy in detail, taking as an example, a reporter inserted at centromeric heterochromatin.

This article describes a detailed methodology for random mutagenesis of a target gene in fission yeast. As an example, we target rpt4+, which encodes a subunit of the 19S proteasome, and screen for mutations that destabilize heterochromatin.

Gene targeting mutagenesi casuale per selezionare eterocromatina-destabilizzare Proteasome mutanti in lievito di fissione

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been co-opted as a powerful tool for precise eukaryotic genome engineering. Here, we present a rapid and simple method using chimeric single guide RNAs (sgRNA) and CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) for the efficient and precise generation of genomic point mutations in C. elegans. We describe a pipeline for sgRNA target selection, homology-directed repair (HDR) template design, CRISPR-Cas9-RNP complexing and delivery, and a genotyping strategy that enables the robust and rapid identification of correctly edited animals. Our approach not only permits the facile generation and identification of desired genomic point mutant animals, but also facilitates the detection of other complex indel alleles in approximately 4 - 5 days with high efficiency and a reduced screening workload.

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Here, we present a method to engineer the genome of C. elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins and homology dependent repair templates.

Un veloce e Facile Pipeline per generazione di mutanti di punto Genomic in c. elegans utilizzando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteine

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant viruses they vector. Despite numerous studies of the biology of these species in different environments, a key life history parameter, offspring sex ratios, has received little attention, yet is important for predicting population dynamics. The primary sex ratio (sex ratio at oviposition) of Bemisia tabaci has never been reported but can be found by determining the egg fertilization rate of this haplodiploid insect. The technique involves the dechorionation of eggs with bleach, a series of fixation steps, and the application of the general DNA fluorescent stain, DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole, a DNA-binding fluorescent dye), to bind to female and male pronuclei. Here, we present the technique, and an example of its application, to test whether an endosymbiotic bacterium, Rickettsia sp. nr. bellii, influenced the primary sex ratio of B. tabaci. This method may assist in population studies of whiteflies, or in determining if sex allocation exists with certain environmental stimuli.

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

We present a simple cytogenetic technique using 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) to determine the fertilization rate and primary sex ratio of the haplodiploid invasive pest Bemisia tabaci.

Determinare il tasso di fertilizzazione dell'uovo di Bemisia tabaci utilizzando una tecnica citogenetica

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly sensitive. This protocol obtains precise measurements of gene expression from single worms or from bulk samples. The protocol presented here provides a novel adaptation of existing methods for complementary DNA (cDNA) preparation coupled to a nanofluidic RT-qPCR platform. The first part of this protocol, named &#8216;Worm-to-CT&#8217;, allows cDNA production directly from nematodes without the need for prior mRNA isolation. It increases experimental throughput by allowing the preparation of cDNA from 96 worms in 3.5 h. The second part of the protocol uses existing nanofluidic technology to run high-throughput RT-qPCR on the cDNA. This paper evaluates two different nanofluidic chips: the first runs 96 samples and 96 targets, resulting in 9,216 reactions in approximately 1.5 days of benchwork. The second chip type consists of six 12 x 12 arrays, resulting in 864 reactions. Here, the Worm-to-CT method is demonstrated by quantifying mRNA levels of genes encoding heat shock proteins from single worms and from bulk samples. Provided is an extensive list of primers designed to amplify processed RNA for the majority of coding genes within the C. elegans genome.

High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology

In this article a high-throughput protocol for fast and reliable determination of gene expression levels in single or bulk C. elegans samples is described. This protocol does not require RNA isolation and produces cDNA directly from samples. It can be used together with high-throughput multiplexed nanofluidic real-time qPCR platforms.

RT-PCR quantitativo ad alta produttività in campioni C. elegans singoli e sfusi che utilizzano la tecnologia nanofluidica

This paper presents a high-throughput reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) assay for Caenorhabditis elegans that is fast, robust, and highly ...