Questa ricerca è stata sostenuta [in parte] dal programma di ricerca intramurale del NIH, National Institute of Environmental Health Sciences. Si ringrazia Shyamal Peddada per l'analisi statistica. Desideriamo anche ringraziare Humphrey Yao, Gary Bird e Yuki Arao per la revisione di questo manoscritto e Franco DeMayo per il suo continuo supporto e consulenza.

Tutte le operazioni sono state eseguite come parte del normale funzionamento dell'impianto NIEHS Knock Out Mouse Core. Tutti i topi sono stati tenuti su un 12:12 ciclo di luce: scuro h e sono stati di alimentazione una dieta di NIH-31 e acqua ad libitum. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con il Comitato di uso del National Institute of Environmental Health Sciences e cura degli animali.
1. animale preparazione
<ol><li>Razza di topi di donatore, B6 (Cg)-Tyr < c-2J >/j topi femmina a 8-10 settimane di età naturalmente a B6 (Cg)-Tyr < c-2J > il topo maschio/j tra 8 e 26 settimane di età. Tappi di verificare visivamente la mattina seguente (0.5).</li>
	<li>Razza destinatari topi, topi femminili tra 6 e 9 settimane di età naturalmente sono allevati per vasectomia topi maschi Swiss Webster svizzero di Webster. Tappi di verificare visivamente la mattina seguente (0.5).</li>
</ol>2. preparazione delle cellule ES
<ol><li>Per 129-derieved AB2.2 ES cells, cultura cellule in DMEM completate con 15% FBS, 1% glutammina, 1% Penn/strep e 0,1% β-mercaptoetanolo. Tutte le altre celle di ES secondo le istruzioni del fornitore di cellule ES, utilizzando i protocolli consigliati della coltura.</li>
</ol>3. gruppi di raccolta
<ol><li>
Dissezione animale
	<ol>
<li>Preparare diversi piatti di 60 mm, circa 1 / 5 topi più 3 extra, con 10 mL collezione di granigliatura (BCM) (10% FBS IN DMEM), e un 4 piatto bene con 0,5 mL BCM per pozzetto. Equilibrare a 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>Eutanasia B6 (Cg)-Tyr < c-2J > topi femmina/j a E3.5 usando CO2 asfissia, con una portata di 10%.</li>
		<li>Dopo l'eutanasia, posizionare i mouse nella posizione supina e bagnato l'addome accuratamente con etanolo al 70%.</li>
		<li>Fare la prima incisione attraverso la pelle solo, al punto centrale dell'addome, rendendo l'apertura più ampio possibile. Quindi aprire attraverso la parete addominale, rendendo nuovamente l'incisione più ampio possibile. Nota: Questa operazione in due passaggi aiuta a ridurre o eliminare la contaminazione di pelliccia.</li>
		<li>A partire da un'ovaia e che tiene il cuscinetto adiposo dell'ovaia con il forcipe smussato, rimuovere con cautela l'ovaia, ovidotto e dell'utero, prendendo cura in più per mantenere il tessuto adiposo al minimo. Rimuovere l'utero come una singola unità, o come corna individuali, con nessun cambiamento nella procedura seguente.</li>
		<li>Dopo la rimozione, è necessario mettere l'utero in un piatto di 60 mm contenente materiale di granigliatura collezione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rimozione di embrione
	<ol>
<li>Preparare una siringa da 10 mL riempita con BCM e misura con un ago da 25 G.</li>
		<li>Uno utero alla volta, rimuoverli dal piatto della holding del BCM, li asciugare su un panno per rimuovere il sangue in eccesso e mettere in un piatto di 60 mm con un basso ingrandimento microscopio per dissezione.</li>
		<li>Tenendo accuratamente e delicatamente l'utero appena sotto l'estremità distale (vicino l'ovidotto) con forcipe di dissezione, inserire l'ago al centro dell'utero in parallelo un aereo come possibile. Inserire l'ago appena oltre le punte della pinza.</li>
		<li>Applicare un po' di pressione per il forcipe per tenere l'utero per l'ago e di espellere circa 1 mL di BCM attraverso il corno dell'utero. Nota: Deve prestare attenzione a questo punto, come troppa pressione sulla siringa causerà un flusso incontrollabile dei media, spesso lasciando il piatto.</li>
		<li>Dopo aver sciacquato l'utero, uteri interi fino a 5 per ogni piatto di 60 mm, posizionare il piatto indietro nell'incubatore fino alla raccolta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Raccolta degli embrioni
	<ol>
<li>Utilizzando una pipetta di vetro tirato a mano e un apparato di pipetta di bocca, raccogliere blastocisti in un ambito di dissezione, impostare tra 25 X e 35 X. (Figura 1). Nota: Bocca pipetta apparato è costituito da 30-40 cm di tubo flessibile, inferiore a 5 mm I.D. Inserire un 1, punta della pipetta 000 µ l, scegliere innanzitutto a un'estremità e apporre la pipetta di vetro in esso. Aggiungere un filtro per siringa a altra estremità, con un annesso 1 cc siringa, non lo stantuffo, per agire come un pezzo di bocca.</li>
		<li>Rimozione di piatti dall'incubatrice e utilizzando un modello di griglia, esaminare ogni parte del piatto per gli embrioni. Gli embrioni vengono raccolte fino individualmente e posizionarvi la goccia di BCM in un piatto secondario.</li>
		<li>Dopo aver raccolto da tutti i piatti, lavare gli embrioni ancora una volta in una goccia di BCM fresco e quindi posizionare nel piatto ben 4 in attesa di iniezione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. embrione iniezione
<ol><li>Pick up cellule ES individualmente con l'ago per iniezione basata sulla conferma.<ol>
<li>Preparare un piatto di iniezione con l'aggiunta di 5-7 mL di media di iniezione (DMEM, 10% FBS e 20 mM HEPES) per un piatto di vetro inferiore ad iniezione. Le iniezioni sono fatte a temperatura ambiente.</li>
		<li>Utilizzando un olio o aria microinjector, applicare il vuoto per l'inserimento dell'ago per disegnare le cellule ES in. Fare attenzione a tenere il piccolo spazio possibile tra le celle. Contare le celle ES qui, o nella fase di iniezione.</li>
		<li>Selezionare le celle di ES che sono medio-piccole dimensioni rispetto alla popolazione generale delle cellule, con una superficie liscia e senza difetti evidenti come vacuoli. Nota: Le popolazioni delle cellule ES variano notevolmente nella qualità morfologiche, e gli standard utilizzati saranno necessario regolare con loro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iniettare gli embrioni con circa 15 cellule ES (Figura 1).<ol>
<li>Allegare una pipetta di supporto punta a una seconda microinjector di aria e posizionare un embrione vicino all'apertura del titolare. Applicare il vuoto per proteggere l'embrione al titolare.</li>
		<li>Regolare per l'asse z spostando la pipetta di supporto verso l'alto o verso il basso così che l'embrione è solo toccare la diapositiva, seguita da una messa a fuoco fine sulla zona. Successivamente, regolare l'asse Z dell'ago per iniezione in modo che le cellule ES vicino alla punta sono a fuoco.</li>
		<li>Regolare l'embrione ora spingendo delicatamente dall'ago per iniezione nella parte superiore o inferiore, ruotandola per mettere l'ICM nella posizione desiderata.</li>
		<li>Inserire l'ago per iniezione attraverso la zona e l'ICM o il trofoblasto, utilizzando una spinta costante ma controllata. Esercitare una leggera pressione per la microinjector dell'ago per iniezione per aiutare a mantenere il Blastocele dal collasso.</li>
		<li>Una volta che l'ago ha penetrato il Blastocele, applicare una pressione da microinjector per trasferire le cellule ES al Blastocele dell'embrione. Pausa brevemente come la smussatura dell'ago inizia a uscire l'embrione per consentire la pressione nell'embrione di tornare alla normalità, pur mantenendo le cellule. Nota: Le celle di riferimento gruppo ES sono state iniettate normalmente, seguendo una tradizionale ES cell iniezione protocollo9, avendo cura di non per toccare l'ICM. Le cellule ES sono state iniettate anche attraverso l'ICM, spingendo l'ago direttamente attraverso l'ICM (TICM) (Figura 2film supplementare).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. trasferimento di eEmbryos
<ol><li>Trasferire gli embrioni in topi Swiss Webster a E2.5, utilizzando un dispositivo di trasferimento di embrioni non chirurgico, per le procedure di fabbricazione. Questa procedura non chirurgica non richiede alcuna anestesia o la speciale cura post-op. Casa topi singolarmente dopo il trasferimento degli embrioni e attraverso la consegna e lo svezzamento successive.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6), 823-826 (2013).</li><li>Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EUCOMM+the+European+Conditional+Mouse+Mutagenesis+Program.">EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).</li><li>Austin, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).</li><li>Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Knockout+and+Reporter+Mouse+Line+Generation+and+Breeding+Colony+Establishment+Using+EUCOMM+Conditional-Ready+Embryonic+Stem+Cells:+A+Case+Study.">Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).</li><li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells.">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+and+female+mice+derived+from+the+same+embryonic+stem+cell+clone+by+tetraploid+embryo+complementation.">Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vigor,+fetal+overgrowth,+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation.">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).</li><li>Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+potential+and+behavior+of+tetraploid+cells+in+the+mouse+embryo.">Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo.</a> Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+of+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+four-+or+eight-cell+embryos+by+piezo+micromanipulation.">Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation.</a> Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).</li><li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses.">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse embryo. , (2014).</li><li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , (2011).</li><li>Young, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mechanical+stimulation+on+the+reprogramming+of+somatic+cells+into+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno concorrenti interessi di divulgare.

Si è a lungo pensato che qualsiasi disturbo del ICM potrebbe portare alla mortalità, infatti, protocolli di microinjection di blastocisti correnti ancora avvertono di questo12,13. Quello che vi abbiamo mostrato qui è che microiniezione attraverso l'ICM non è dannosa per l'embrione e aumenta la resa delle chimere.
L'esatto meccanismo di questo effetto non è stato identificato. Tuttavia, la rottura meccanica del ICM e l'accompagnamento ipoblasto, dovrebbe aumentare l'incidenza di integrazione delle cellule ES la neonata ICM dopo microiniezione. Recenti lavori nel campo della iPSCs ha dimostrato che la stimolazione meccanica aiuta alla riprogrammazione di iPSC umano14. Se la manipolazione meccanica ha un effetto simile in ICM dell'embrione del mouse, potrebbe avere l'effetto di ritorno cellule del ICM che potenzialmente aveva iniziato a differenziare, torna a uno stato pluripotenti, eliminando un potenziale 'head start' del donatore blastocisti cellule derivate nella formazione di tessuto embrionale. Infine, è possibile che l'iniezione attraverso i risultati ICM nella morte di un numero imprecisato di cellule in ICM, abbassando il livello di concorrenza per l'iniettati geneticamente modificato cellule ES.
I principali vantaggi di questo metodo di modifica sono che non richiede nuovo apprendimento, risoluzione dei problemi o attrezzature. Tutte le tecniche di riporto da iniezione standard blastocisti. Le fasi più critiche rimangono invariati; corretta e tempestiva raccolta di embrioni e condizioni di coltura adeguato per gli embrioni prima, durante e dopo l'iniezione. Quando si utilizza la tecnica di trasferimento dell'embrione non-chirurgico, lo fa diventare più critico per selezionare il destinatari corretto topi. Con trasferimenti chirurgici, il chirurgo ha avuto l'opportunità di esaminare il mouse per verificare il corretto stato riproduttivo, dove con i trasferimenti non chirurgica, non è possibile. Topi dovrebbero essere privilegiata età riproduttiva (6-9 settimane) e devono essere utilizzati solo topi con spine visibili. L'aspetto più importante di questa tecnica e tutte le iniezioni di cellule ES, sono la qualità delle cellule ES.
Quando si occupano di alta qualità, robusto di cellula, questa tecnica può solo minime differenze di resa, ma con ES suboptimale linee cellulari o difficoltà a lavorare con linee, uno qualsiasi, anche minori miglioramenti, può essere significativo e fare la differenza tra il successo del progetto e il fallimento. È anche da notare, che nel corso di questo studio, diverse linee di cellule ES commercialmente disponibile generato germline chimere, e quasi tutte le linee di ES commerciale che ha generato le chimere di germline erano iniezioni TICM. Qui abbiamo indicato che un semplice cambiamento nella tecnica può comportare un miglioramento significativo della produttività, senza incorrere in alcun costo aggiuntivo per le nuove attrezzature, formazione o aumento dell'uso di animali.

Per quasi 25 anni, la creazione di topi geneticamente mirati è stato un processo lento, spesso ostacolato da un collo di bottiglia nella fase blastocisti ES cella microiniezione per la generazione di germline trasmissione chimere. Gli avanzamenti recenti, tra cui CRISPR/Cas91,2 di targeting in cellule ES ed ES di alto-rendimento cella consorzi di generazione come KOMP, hanno migliorato la disponibilità/generazione di cellule geneticamente modificate ES. Tuttavia, la generazione di germline chimere rimane un collo di bottiglia nella creazione di topi geneticamente modificati da queste cellule ES3,4. Progetti di generazione di alto-rendimento ES cella sono stati afflitti da alta variabilità nella qualità delle cellule di ES, che è fondamentale per la riuscita creazione di chimere di germline. Inoltre, alcune delle varietà di cellula ES comunemente utilizzati sono noti per aneuploidia alta e difficile produzione di germline chimere competente5.
Sono stati sviluppati molti metodi per la creazione di topi con una chimera o superiore, o completamente delle cellule di ES derivato topi6,7,8,9,10. Mentre ciascuno di questi sistemi ha i suoi meriti, hanno anche le loro carenze. La generazione delle chimere tetraploide, mentre la generazione delle cellule di ES 100% derivato topi, è inefficiente e generalmente limitata a linee nazionali 5,6. Recensioni più recenti metodi di iniezione morula possono produrre alta percentuale chimere, prossima al 100%, ma in genere richiedono significative ulteriori apparecchiature (laser o piezo) e formazione10,11. Nei laboratori dove queste tecniche sono già in atto, questa nuova metodologia potrebbe non essere necessaria.
Obiettivo di questo studio era di trovare un metodo che utilizza tecniche comuni e prontamente disponibili attrezzature per aumentare il tasso di generazione di chimera, aumentando la probabilità di trasmissione nella linea germinale dell'allele del mutante per fondare la Colonia del mouse successiva.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ES Cell injection needle</td>
			<td>Humagen</td>
			<td>MSC-20-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSET device</td>
			<td>Paratechs</td>
			<td>60010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>10439-024</td>
			<td>lots should be individually tested for ES Cell compatibility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro injector</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>Cell Tram Air 5176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6(Cg)-Tyr&#60;c-2J&#62;/J</td>
			<td>Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Taconic, USA</td>
			<td>Tac:SW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Dish</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P50G-0-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trans-inner cell mass injection of embryonic stem cells leads to higher chimerism rates

Nel tentativo di aumentare l'efficienza nella creazione di topi geneticamente modificati tramite metodologie delle cellule di ES, presentiamo un adattamento per l'attuale protocollo di iniezione di blastocisti. Qui segnaliamo che una semplice rotazione dell'embrione e iniezione attraverso massa cellulare Trans-interno (TICM) ha aumentato la percentuale dei topi chimerici dal 31% al 50%, con nessun equipaggiamento supplementare o ulteriore formazione specialistica. inbred 26 differenti cloni, e cloni totali 35 sono stati iniettati in un periodo di 9 mesi. Non c'era differenza significativa nel tasso di recupero di embrioni o di tasso di gravidanza tra tecniche di iniezione tradizionale e TICM. Pertanto, senza alcuna alterazione principali nel processo di iniezione e un semplice posizionamento della blastocisti e iniettare attraverso l'ICM, rilasciando le cellule ES nella cavità Blastocele possa potenzialmente migliorare la quantità di produzione chimerici e successive trasmissione nella linea germinale.

Trattamento linea cellulare come l'effetto casuale, un modello lineare di effetti misti è stato utilizzato per analizzare i dati nel software (ad es. SAS (versione 9.2)). Ogni analisi controllata per il numero di embrioni trasferiti e la linea cellulare. La seconda analisi anche controllata per il numero dei cuccioli che sono sopravvissuti.
Per questo studio, ogni linea cellulare ES e clone è stato iniettato entrambi con tradizionali e tecniche TICM, alternando i due metodi dopo ogni embrione. Dopo l'iniezione, embrioni sono stati segregati sul piatto e raggruppati per trasferimento, generalmente fra 12 e 15 embrioni per donna destinatario. Gli embrioni che non hanno un Blastocele chiaramente visibile, mancava una Zona pellucida, o dove le cellule ES iniettate non riuscì ad entrare il Blastocele, sono stati eliminati da questo esperimento.
I primi dati esaminati erano il tasso di gravidanza. Come mostrato nella Figura 3, i tassi di gravidanza erano invariati nel gruppo TICM dal gruppo di controllo. Inoltre, un'uguale percentuale di cuccioli sono sopravvissuti allo svezzamento (P = 0,50, Figura 4). La cosa più importante, mentre il numero di topi allo svezzamento rimane invariato, il numero di cuccioli visualizzati da cappotto colore chimerismo aumentato dal 31% al 50% per il gruppo TICM (p = 0,005, Figura 5). Il grado di chimerismo di colore del cappotto è stato considerato troppo soggettivo per essere valutati in questo studio e non veramente rilevanti per chimerismo germinale.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56955/56955fig1.jpg"> Figura 1: apparecchiatura specializzata. (Sinistra) Installazione di microscopio di iniezione, tra cui manipolatori Micro (A) e (B) cella Tram aria. (A destra) Apparato di pipetta di bocca, con pipetta di vetro tirato (C) , (D) 1000 µ l punta della pipetta, tubo (E) , filtro (F) e (G) siringa in botte. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56955/56955fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56955/56955fig2.jpg"> Figura 2: esempio di iniezione embrione blastocisti. (A, B) Metodo di iniezione tradizionale, dove l'ago per iniezione entra nel fronte del ICM, evitando qualsiasi interazione con l'ICM. (C, D) Metodo TICM, dove l'ago per iniezione entra direttamente attraverso l'ICM al Blastocele. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56955/56955fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56955/56955fig3.jpg"> Figura 3: tasso di gravidanza. Il tasso di gravidanza ha mostrato alcuna differenza significativa tra tradizionale (39/50) e TICM (64/76). Medie più errore standard della media (SEM). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56955/56955fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56955/56955fig4.jpg"> Figura 4: tasso di sopravvivenza. Il tasso di sopravvivenza è il numero dei cuccioli che sono sopravvissuti allo svezzamento, dove c'era una cucciolata di svezzare. Cuccioli che non sopravvisse allo svezzamento e cucciolate dove nessun cuccioli sono sopravvissuti allo svezzamento, non sono stati inclusi in questi dati. Medie più errore standard della media (SEM). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56955/56955fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56955/56955fig5.jpg"> Figura 5: tasso di Chimerism. Questi dati rappresentano solo il numero se chimere prodotte e non riguarda la qualità del chimerism. Nel gruppo tradizionale, 31% (34/110) della prole ha mostrato chimerismo, dove il gruppo TICM ha avuto una media del 50% (79/158). Media plus errore standard della media (SEM). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56955/56955fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Qui presentiamo un protocollo per aumentare la produzione di chimera senza l'uso di nuove attrezzature. Un cambiamento di orientamento semplice dell'embrione per iniezione può aumentare il numero di embrioni prodotti e potenzialmente ridurre la timeline di trasmissione nella linea germinale.

Trans-inner Cell Mass iniezione delle cellule staminali embrionali porta a tassi più elevati di chimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

trans-inner-cell-mass-injection-embryonic-stem-cells-leads-to-higher

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K Views.  NIEHS/NIH. Qui presentiamo un protocollo per aumentare la produzione di chimera senza l'uso di nuove attrezzature. Un cambiamento di orientamento semplice dell'embrione per iniezione può aumentare il numero di embrioni prodotti e potenzialmente ridurre la timeline di trasmissione nella linea germinale.

Video: Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

Propagazione di staminali embrionali umane (ES) Cellule

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Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivazione di cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali embrionali murini

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Derivazione di cellule staminali embrionali umane da Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Immunoprecipitazione della cromatina di cellule staminali embrionali umane

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This pathology causes symptoms such as intermittent claudication (pain with walking), painful ischemic ulcerations, or even limb-threatening gangrene. It is generally believed that the vascular endothelium, a monolayer of endothelial cells that invests the luminal surface of all blood and lymphatic vessels, plays a dominant role in vascular homeostasis and vascular regeneration. As a result, stem cell-based regeneration of the endothelium may be a promising approach for treating PAD.In this video, we demonstrate the transplantation of embryonic stem cell (ESC)-derived endothelial cells for treatment of unilateral hindimb ischemia as a model of PAD, followed by non-invasive tracking of cell homing and survival by bioluminescence imaging. The specific materials and procedures for cell delivery and imaging will be described. This protocol follows another publication in describing the induction of hindlimb ischemia by Niiyama et al.1

The surgical procedure for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial cells to the ischemic hindlimb is demonstrated, with non-invasive tracking by bioluminescence imaging.

Cellule embrionali staminali endoteliali derivati ​​dalle cellule per il trattamento di ischemia degli arti posteriori

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

L&#39;isolamento e la derivazione di cellule embrionali del mouse Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali in precursori degli oligodendrociti

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Mappatura destino di cellule staminali embrionali umane per la formazione teratoma

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

L&#39;uso di LysoTracker per rilevare la morte cellulare programmata in embrioni e differenziazione delle cellule staminali embrionali

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...