Diese Forschung wurde von der intramuralen Forschungsprogramm des NIH, National Institute of Environmental Health Sciences [teilweise] unterstützt. Besonderen Dank an Shyamal Peddada für statistische Analysen. Wir wünschen auch Humphrey Yao, Gary Vogel und Yuki Arao zur Überprüfung dieser Handschrift, und Franco DeMayo für seine anhaltende Unterstützung und Beratung bedanken.

Alle Arbeiten erfolgten im Rahmen des normalen Betriebs des NIEHS Knock Out Maus Core Facility. Alle Mäuse blieben auf einem 12:12 h Licht: Dunkel-Zyklus, und waren eine Diät von NIH-31 und Wasser ernähren ad libitum. Alle Versuche wurden im Einklang mit der Animal Care und Gebrauch von dem National Institute of Environmental Health Sciences durchgeführt.
(1) tierische Vorbereitung
<ol><li>Züchten Spender Mäuse, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > j weiblichen Mäusen bei 8-10 Wochen alt natürlich bis B6 (Cg)-Tyr < c-2J > j männliche Mäuse zwischen 8 und 26 Wochen alt. Sichtkontrolle Stecker am nächsten Morgen (E0.5).</li>
	<li>Züchten Sie Empfänger Mäuse, Schweizer Webster weibliche Mäuse zwischen 6 und 9 Wochen alt natürlich vasektomierten Schweizer Webster männlichen Mäusen gezüchtet werden. Sichtkontrolle Stecker am nächsten Morgen (E0.5).</li>
</ol>2. ES Handy Vorbereitung
<ol><li>Kultur für 129-Derieved-AB2.2 ES-Zellen, Zellen in DMEM ergänzt mit 15 % FBS, 1 % Glutamin, 1 % Penn/Strep und 0,1 % β-Mercaptoethanol. Andere ES-Zellen pro ES Zelle Lieferant Anweisungen, ihre empfohlene Protokolle mit Kultur.</li>
</ol>(3) Embryo Collection
<ol><li>
Tierische Dissektion
	<ol>
<li>Bereiten Sie mehrere 60 mm Schalen, ca. 1 pro 5 Mäusen plus 3 Extra, mit 10 mL Sammlung Strahlmittel (BCM) (10 % FBS IN DMEM), und einem 4 Schüssel gut mit 0,5 mL BCM pro Bohrloch. Equilibrate bei 37 ° C, 5 % CO2.</li>
		<li>Einschläfern B6 (Cg)-Tyr < c-2J > j weiblichen Mäusen bei 3,5 mit CO2 Erstickung, mit einer Flussrate von 10 %.</li>
		<li>Legen Sie nach euthanizing die Mäuse in der Rückenlage und nass des Bauches gründlich mit 70 % Ethanol.</li>
		<li>Den erste Schnitt durch die Haut nur, in der Mitte des Bauches, so dass die Öffnung so weit wie möglich zu machen. Als nächstes öffnen Sie durch die Bauchdecke wieder den Schnitt so weit wie möglich zu machen. Hinweis: Dabei in zwei Schritten hilft, verringern oder beseitigen Fell Verschmutzungen.</li>
		<li>Ein Eierstock ab und hält die Fettpolster des Eierstocks mit stumpfen Pinzette entfernen Sie vorsichtig die Eierstöcke, Eileiter und Gebärmutter, wobei besonders vorsichtig, um das Fettgewebe auf ein Minimum zu reduzieren. Die Gebärmutter zu entfernen, als eine einzelne Einheit oder als einzelne Hörner, ohne Änderung in der folgenden Prozedur.</li>
		<li>Legen Sie nach der Entfernung die Gebärmutter in eine 60 mm Schale mit Strahlmittel Sammlung</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Embryo-Entfernung
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine 10 mL Spritze mit BCM gefüllt und mit einer 25 G Nadel passen.</li>
		<li>Eine Gebärmutter in einer Zeit, entfernen Sie sie aus der Schale der Abhaltung von BCM, Tupfen Sie sie auf ein Gewebe zu entfernen überschüssiges Blut, und legen Sie in einer 60 mm Petrischale unter einer niedrigen Vergrößerung Mikroskop seziert.</li>
		<li>Halten Sie vorsichtig und sanft die Gebärmutter direkt unter dem distalen Ende (in der Nähe der Eileiter) mit Zange sezieren, fügen Sie die Nadel in der Mitte der Gebärmutter in als Parallel ein Flugzeug wie möglich. Stechen Sie die Nadel direkt hinter den Spitzen der Zange.</li>
		<li>Einigen Druck auf die Zange, die Gebärmutter, die Nadel zu halten, und etwa 1 mL der BCM durch das Horn des Uterus zu vertreiben. Hinweis: Bei diesem Schritt Vorsicht ist da zu viel Druck auf die Spritze einen unkontrollierbaren Stream Medien, führt oft verlassen das Gericht.</li>
		<li>Nach dem Spülen der Gebärmutter bis zu 5 ganze Uteri pro 60 Millimeter-Teller, legen Sie die Schüssel wieder in den Inkubator bis zur Abholung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Embryo-Sammlung
	<ol>
<li>Mit einer Hand gezeichnete Glaspipette und einen Mund Pipette Apparat, sammeln Sie Blastozysten einen sezierenden Rahmen bis 25 X 35 X festgelegt. (Abbildung 1). Hinweis: Mund Pipette Apparatur besteht aus 30-40 cm Schlauch, unter 5 mm I.D. Legen Sie ein 1 000 µL PIPETTENSPITZE, zuerst in an einem Ende und befestigen Sie die Glaspipette drin. Fügen Sie an das andere Ende mit einer angehängten 1 cc Spritzenzylinder, keine Kolben, als ein Mundstück handeln Spritze Filter hinzu.</li>
		<li>Gerichte aus dem Inkubator zu entfernen und mit einem gittermuster untersuchen Sie jeden Teil der Schale für Embryonen. Embryonen werden gepflückt, einzeln auf und legen Sie auf die Tropfen BCM in eine zweite Schüssel.</li>
		<li>Nach dem Sammeln von allen Gerichten, waschen Sie die Embryonen noch einmal in einem Tropfen frisch BCM, und platzieren Sie die 4 gut Gericht Injektion zu erwarten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Embryo Injektion
<ol><li>ES-Zellen holen Sie einzeln mit der Injektionsnadel basierend auf Bestätigung ab.<ol>
<li>Bereiten Sie eine Injektion Gericht durch Zugabe von 5-7 mL Injektion Medien (DMEM, 10 % FBS und 20 mM HEPES) zur Injektion Glasschale unten. Injektionen sind bei Raumtemperatur durchgeführt.</li>
		<li>Verwenden entweder eine Luft oder Öl Microinjector, Vakuum auf der Injektionsnadel Embryonaler Stammzellen zu zeichnen, anwenden. Achten Sie darauf, um so wenig Raum wie möglich zwischen den Zellen zu halten. Die ES-Zellen zu zählen, hier oder bei der Injektion Schritt.</li>
		<li>Wählen Sie Embryonische Stammzellen, die Mittel bis klein im Vergleich zur allgemeinen Bevölkerung der Zellen, mit glatter Oberfläche und ohne offensichtliche Mängel wie Vakuolen sind. Hinweis: ES-Zell-Populationen variieren stark in morphologischen Qualität und Standards verwendet musst mit ihnen anpassen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injizieren Sie Embryonen mit ca. 15 ES-Zellen (Abbildung 1).<ol>
<li>Anhängen einer haltepipette Tipp: um eine zweite Luft-Microinjector und einen Embryo in der Nähe der Öffnung des Inhabers zu positionieren. Gelten Sie Vakuum um den Embryo an den Inhaber zu sichern.</li>
		<li>Für die Z-Achse von der haltepipette oben oder unten zu verschieben, so dass der Embryo nur die Folie, gefolgt von Feinfokussierung auf die Zona berührt einstellen. Als nächstes einstellen Sie die Z-Achse von der Injektionsnadel so, dass ES-Zellen in der Nähe der Spitze im Mittelpunkt stehen.</li>
		<li>Passen Sie den Embryo nun durch leichten Druck aus der Injektionsnadel an der Ober- oder Unterseite, drehen es um ICM in die gewünschte Position setzen.</li>
		<li>Legen Sie die Injektionsnadel durch die Zona und ICM oder Trophoblast, einen festen, aber kontrollierten Push verwenden. Leichten Druck auf die Microinjector der Injektionsnadel zu helfen, das blastocöl vor dem Kollaps.</li>
		<li>Sobald die Nadel das blastocöl eingedrungen ist, üben Sie Druck aus der Microinjector, ES-Zellen auf das blastocöl des Embryos zu übertragen. Pause kurz als die schräge der Nadel beginnt, verlassen Sie den Embryo um den Druck des Embryos zurück zu normal, Beibehaltung der Zellen zu ermöglichen. Hinweis: Referenz-Gruppe-ES-Zellen wurden normalerweise injiziert, Anschluss an eine traditionelle ES Handy Injektion Protokoll9, kümmert sich nicht um das ICM zu berühren. ES-Zellen wurden auch durch das ICM, schieben die Nadel direkt durch das ICM (TICM) (Abbildung 2ergänzende Film) injiziert.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Übertragung von eEmbryos
<ol><li>Transferieren Sie die Embryonen an Schweizer Webster Mäuse am E2.5, mit einem nicht-chirurgische Embryo Transfer Gerät pro Verfahren der Herstellung. Dieses nicht-chirurgische Verfahren erfordert keine Anästhesie oder spezielle postoperative Pflege. Hausmäuse individuell nach dem Transfer der Embryonen und durch Lieferung und anschließende absetzen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6), 823-826 (2013).</li><li>Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EUCOMM+the+European+Conditional+Mouse+Mutagenesis+Program.">EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).</li><li>Austin, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).</li><li>Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Knockout+and+Reporter+Mouse+Line+Generation+and+Breeding+Colony+Establishment+Using+EUCOMM+Conditional-Ready+Embryonic+Stem+Cells:+A+Case+Study.">Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).</li><li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells.">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+and+female+mice+derived+from+the+same+embryonic+stem+cell+clone+by+tetraploid+embryo+complementation.">Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vigor,+fetal+overgrowth,+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation.">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).</li><li>Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+potential+and+behavior+of+tetraploid+cells+in+the+mouse+embryo.">Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo.</a> Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+of+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+four-+or+eight-cell+embryos+by+piezo+micromanipulation.">Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation.</a> Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).</li><li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses.">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse embryo. , (2014).</li><li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , (2011).</li><li>Young, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mechanical+stimulation+on+the+reprogramming+of+somatic+cells+into+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenskonflikte offenzulegen.

Es hat lange gedacht, dass jede Störung des ICM aktuellen Blastozyste Mikroinjektion Protokolle warnen noch dieser12,13zur Sterblichkeit, in der Tat führen könnte. Was wir hier gezeigt haben ist, die Mikroinjektion durch das ICM ist nicht schädlich für den Embryo und erhöht den Ertrag der Chimären.
Der genaue Mechanismus für diesen Effekt wurde nicht festgestellt. Allerdings sollte die mechanische Beeinträchtigung der ICM und der begleitenden Hypoblast die Inzidenz von ES Zelle Integration in die neu gebildete ICM nach Mikroinjektion erhöhen. Neuere Arbeiten auf dem Gebiet der iPSCs hat gezeigt, dass mechanische Stimulation hilft bei der Reprogrammierung von menschlichen iPSC14. Wenn mechanische Manipulation eine ähnliche Wirkung im ICM des Mausembryos hat, hätte es die Wirkung der Rückgabe Zellen des ICM potenziell begonnen hatte, zu unterscheiden, wieder in einen pluripotenten Zustand entfernen ein Potenzial "Vorsprung" der Blastozyste Spender abgeleitete Zellen bei der Bildung des embryonalen Gewebes. Zu guter Letzt ist es möglich, dass die Injektion durch die ICM-Ergebnisse in den Tod einer unbekannten Anzahl von Zellen im ICM, das Absenken des Wettbewerbs für die mikroinjiziert genetisch ES-Zellen verändert.
Die Hauptvorteile dieser Modifikation der Methode sind, dass es kein neues lernen, Fehlerbehebung oder Ausrüstung erfordert. Alle Techniken Übertrag von standard-Blastozyste Injektion. Unverändert bleiben auch die kritischsten Schritte; richtige und rechtzeitige Sammlung von Embryonen und richtige Kulturbedingungen für die Embryonen vor, während und nach der Injektion. Wenn die nichtoperative Embryo Transfer-Technik verwenden, es für den richtigen Empfänger Mäuse wählen wichtiger geworden. Mit chirurgischen Transfers der Chirurg hatte die Gelegenheit zu prüfen, die Maus, um die ordnungsgemäße reproduktiven Status zu überprüfen wo mit nicht-chirurgischen Transfers, dies ist nicht möglich. Mäuse sollte der besten reproduktiven Alter (6-9 Wochen) und sollte nur Mäuse mit sichtbaren Stecker verwendet werden. Der wichtigste Aspekt dieser Technik und alle ES Zelle Injektionen, ist die Qualität von ES-Zellen.
Beim Umgang mit hochwertigen, robusten Zelllinien, diese Technik kann nur minimale Unterschiede ergeben, aber mit suboptimalen ES Zellinien oder schwierig, mit Linien zu arbeiten, gegebenenfalls auch kleinere Verbesserungen, können erheblich sein und machen den Unterschied zwischen Projekterfolg und scheitern. Es ist auch der Hinweis, dass im Laufe dieser Studie mehrere handelsübliche ES-Zell-Linien Keimbahn Chimären generiert, und fast alle kommerziellen ES Linien, die Keimbahn Chimären erzeugt TICM Injektionen wurden. Hier haben wir gezeigt, dass eine einfache Änderung der Technik eine deutliche Verbesserung der Produktivität, ohne zusätzliche Kosten für neue Geräte, Training oder Steigerung des Einsatzes von Tieren führen kann.

Die Schaffung von genetisch gezielte Mäusen ist seit fast 25 Jahren ein langsamer Prozess, oft durch einen Engpass im Blastozysten ES Zell Mikroinjektion-Stadium für die Generation der Keimbahn Übertragung von Chimären behindert. Neue Zuführungen, darunter CRISPR/Cas91,2 targeting in ES-Zellen und Hochdurchsatz-ES Handy-Generation Konsortien wie KOMP, haben die Generation/Verfügbarkeit von gentechnisch veränderten ES-Zellen verbessert. Die Generation der Keimbahn Chimären bleibt jedoch einen Engpass bei der Schaffung von genetisch veränderter Mäusen aus diesen ES Zellen3,4. Hochdurchsatz-ES Zelle stromerzeugungsprojekte haben durch hohe Variabilität in ES-Zellen-Qualität, die entscheidend für die erfolgreiche Erstellung der Keimbahn Chimären ist geplagt. Darüber hinaus sind einige der häufig verwendeten ES-Zelllinien für hohe Aneuploidie und schwierige Produktion der Keimbahn zuständigen Chimären5bekannt.
Viele Methoden wurden entwickelt für die Erstellung von Mäusen mit entweder eine höhere Chimäre oder komplett ES Zelle abgeleitet Mäuse6,7,8,9,10. Während jedes dieser Systeme seine eigenen Vorzüge hat, haben sie auch ihre Schwächen. Die Generation der tetraploiden Chimären, während generieren 100 % ES Zelle Mäuse, abgeleitet ist ineffizient und in der Regel beschränkt auf fremd-Linien 5,6. Neuere Methoden der Morula Injektion können Ausbeute hohen Prozentsatz Chimären, annähernd 100 %, aber erfordern in der Regel erhebliche zusätzliche Ausrüstung (Laser oder Piezos) und Training10,11. Im Labor, wo diese Techniken bereits vorhanden sind, kann diese neue Methode nicht erforderlich sein.
Ziel dieser Studie war es, eine Methode zu finden, die gängige Techniken und leicht verfügbare Ausrüstung zur Erhöhung der Chimäre-Generation, die Chance der Keimbahn Übertragung des mutierten Allels, die anschließende Maus Kolonie zu erhöhen verwendet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ES Cell injection needle</td>
			<td>Humagen</td>
			<td>MSC-20-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSET device</td>
			<td>Paratechs</td>
			<td>60010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>10439-024</td>
			<td>lots should be individually tested for ES Cell compatibility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro injector</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>Cell Tram Air 5176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6(Cg)-Tyr&#60;c-2J&#62;/J</td>
			<td>Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Taconic, USA</td>
			<td>Tac:SW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Dish</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P50G-0-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trans-inner cell mass injection of embryonic stem cells leads to higher chimerism rates

In dem Bemühen zur Steigerung der Effizienz bei der Erstellung von genetisch veränderten Mäusen über ES Zelle Methoden präsentieren wir Ihnen eine Anpassung an das aktuelle Protokoll der Blastozyste-Injektion. Hier berichten wir, dass eine einfache Drehung des Embryo und Injektion durch Trans-innere Zellmasse (TICM) der Anteil der chimeric Mäuse von 31 % bis 50 %, ohne zusätzliche Ausrüstung stieg oder Ausbildung weiter spezialisiert. 26 verschiedene Inzucht Klone und 35 insgesamt Klone wurden über einen Zeitraum von 9 Monaten injiziert. Es gab keinen signifikanten Unterschied in Schwangerschaftsrate oder Verwertungsquote von Embryonen zwischen traditionellen Injektionstechniken und TICM. Daher kann ohne jede große Veränderung in der Einspritzvorgang und eine einfache Positionierung der Blastozyste und Injektion durch das ICM, Freisetzung von ES-Zellen in den blastocöl Hohlraum möglicherweise die Menge der Chimären Produktion und anschließende verbessern Germline Übertragung.

Zell-Linie als des random-Effekts zu behandeln, wurde ein lineares Modell gemischte Effekte verwendet, zum Analysieren der Daten in der Software (z.B. SAS (Version 9.2)). Jede Analyse für die Anzahl der übertragenen Embryonen und die Zell-Linie gesteuert. Die zweite Analyse auch für die Anzahl der Welpen, die überlebt gesteuert.
Für diese Studie jedes ES Zelllinie und Klon wurde sowohl mit traditionellen injiziert und TICM Techniken, abwechselnd zwischen den beiden Methoden nach jedem Embryo. Nach der Injektion waren Embryonen getrennt auf dem Teller und gruppiert nach Übertragung in der Regel zwischen 12 und 15 Embryonen pro Empfänger Weibchen. Embryonen, die nicht über eine deutlich sichtbare blastocöl fehlte eine Zona Pellucida, oder wo die microinjected ES-Zellen konnte nicht in das blastocöl eintreten schieden aus diesem Experiment.
Die ersten Daten geprüft wurde Schwangerschaftsrate. Wie in Abbildung 3dargestellt, wurden Schwangerschaftsraten in die TICM-Gruppe aus der Kontrollgruppe unverändert. Darüber hinaus ein gleicher Anteil der Welpen überlebt, Entwöhnung (P = 0,50, Abbildung 4). Am wichtigsten ist, während die Zahl der Mäuse bei der Entwöhnung bleibt unverändert, die Anzahl der Welpen anzeigen Mantel Farbe Chimärismus stieg von 31 % auf 50 % für die TICM-Gruppe (p = 0,005, Abbildung 5). Der Grad der Mantel Farbe Chimerism galt als zu subjektiv in dieser Studie ausgewertet werden, und nicht wirklich relevant für Keimbahn Chimärismus.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56955/56955fig1.jpg"> Abbildung 1: spezialisierte Ausrüstung. (Links) Injektion Mikroskop Einrichtung, einschließlich Micro-Manipulatoren (A) und (B) Zelle Straßenbahn Luft. (Rechts) Mund-Pipette-Apparat mit gezeichneten Glaspipette (C) , (D) 1000µL PIPETTENSPITZE (E) Schläuche, Filter (F) und (G) Spritze Fass. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56955/56955fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56955/56955fig2.jpg"> Abbildung 2: Beispiel für Blastozysten-Embryo-Injektion. (A, B) Traditionelle Injektionsverfahren, wo die Injektionsnadel tritt gegenüber des ICM, jede Interaktion mit dem ICM zu vermeiden. (C, D) TICM Methode, wo die Injektionsnadel direkt über das ICM in der blastocöl tritt. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56955/56955fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56955/56955fig3.jpg"> Abbildung 3: Schwangerschaftsrate. Die Schwangerschaftsrate zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen traditionellen (39/50) und TICM (64/76). Mittelwerte und Standardfehler des Mittelwertes (SEM). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56955/56955fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56955/56955fig4.jpg"> Abbildung 4: Überlebensrate. Die Überlebensrate beträgt die Anzahl der Welpen, die überlebten, Entwöhnung, wo es ein Wurf zu entwöhnen. Welpen, die nicht überlebten, Entwöhnung und Würfe, wo keine Welpen überlebt, Entwöhnung, waren nicht in diesen Daten enthalten. Mittelwerte und Standardfehler des Mittelwertes (SEM). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56955/56955fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56955/56955fig5.jpg"> Abbildung 5: Chimärismus Preis. Diese Daten stellt nur die Anzahl, wenn Chimären produziert und nicht die Qualität der Chimärismus adressiert. Im Bereich "traditionelle" zeigte 31 % (34/110) der Nachkommen Chimärismus, wo die TICM-Gruppe durchschnittlich 50 % (79/158). Durchschnitt plus Standardfehler des Mittelwertes (SEM). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56955/56955fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erhöhung der Chimäre Produktion ohne den Einsatz von neuen Geräten. Eine einfache Orientierung Änderung des Embryos zur Injektion kann erhöhen Sie die Anzahl der erzeugten Embryonen und potenziell reduzieren die Timeline Germline Übertragung.

Trans-innere Zelle Masse Injektion von embryonalen Stammzellen führt zu höheren Chimerism Raten

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

trans-inner-cell-mass-injection-embryonic-stem-cells-leads-to-higher

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K Aufrufe.  NIEHS/NIH. Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Erhöhung der Chimäre Produktion ohne den Einsatz von neuen Geräten. Eine einfache Orientierung Änderung des Embryos zur Injektion kann erhöhen Sie die Anzahl der erzeugten Embryonen und potenziell reduzieren die Timeline Germline Übertragung.

Serie: Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

Vermehrung von humanen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen)

Forschung

Biologie

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Chromatin Immunopräzipitation von humanen embryonalen Stammzellen

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This pathology causes symptoms such as intermittent claudication (pain with walking), painful ischemic ulcerations, or even limb-threatening gangrene. It is generally believed that the vascular endothelium, a monolayer of endothelial cells that invests the luminal surface of all blood and lymphatic vessels, plays a dominant role in vascular homeostasis and vascular regeneration. As a result, stem cell-based regeneration of the endothelium may be a promising approach for treating PAD.In this video, we demonstrate the transplantation of embryonic stem cell (ESC)-derived endothelial cells for treatment of unilateral hindimb ischemia as a model of PAD, followed by non-invasive tracking of cell homing and survival by bioluminescence imaging. The specific materials and procedures for cell delivery and imaging will be described. This protocol follows another publication in describing the induction of hindlimb ischemia by Niiyama et al.1

The surgical procedure for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial cells to the ischemic hindlimb is demonstrated, with non-invasive tracking by bioluminescence imaging.

Embryonale Stammzellen gewonnenen Endothelzellen zur Behandlung von Ischämie Hinterlauf

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Differenzierung von embryonalen Stammzellen in Oligodendrozyten Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Fate Mapping von humanen embryonalen Stammzellen durch Teratom Formation

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

Verwendung LysoTracker zum programmierten Zelltod in Embryonen Erkennen und Differenzieren embryonalen Stammzellen

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...