Ringraziamo Shlomi Krispin per l&#39;immagine del tubo neurale. In particolare, noi riconosciamo Yuval Cannella per l&#39;avvio della tecnica di transfezione GFP. Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti la Israel Science Foundation, Association Francaise contre les Myopathies e Forschungsgemeinshaft Deutsche, Centro di Ricerca in collaborazione da 488 a CK

1. Preparazione del Micropipette Tiriamo le nostre pipette su un Narishige standard di pp-83 pipetta estrattore con una regolazione di calore di 13,5. La regolazione precisa deve essere calibrato, mirando ad un diametro di punta della pipetta tra gli 8 ei 10 micron. Noi usiamo filamento contenenti tubi in vetro borosilicato con un diametro esterno di 1,0 mm e diametro interno 0,75-0,78 mm. Le pipette sono quindi memorizzati in un piatto di plastica con le punte protetto dal contatto con i bordi del piatto. 2. Preparazione del DNA Il plasmide di interesse è transfettate in DH5α E. coli utilizzando le procedure standard. Culture durante la notte da singole colonie sono utilizzati per purificare il plasmide con maxi-prep kit (ogni kit commerciale dovrebbe fare). Usiamo un plasmide concentrazione di 1,0 mg / mL per i non-clonale iniezioni. Concentrazioni più elevate aumentano l&#39;intasamento di puntali. Per le applicazioni clonale, le concentrazioni plasmide sono molto più bassi e deve essere regolato (vedi sotto). Per pCAGG-GFP, la concentrazione ottimale producendo risultati clonale è risultato essere di circa 0,05-0,1 mg / mL. Uno a 2 l di plasmide è tipicamente usato per esperimento, e una quantità minima di fast-verde in polvere (aderendo alla punta di una secca, pipetta di vetro taglienti) viene aggiunto il plasmide prima l&#39;esperimento comincia. Il plasmide viene poi immesso in una centrifuga da tavolo per 2 minuti a velocità massima. Questa procedura sembra ridurre pipetta-problemi di intasamento. 3. Iniezione di embrioni 3.1 Preparazione di embrioni Noi usiamo quaglia e uova di gallina per preparazioni iniettabili. Le uova vengono incubate sdraiato sul loro asse lungo fino alla fase di sviluppo desiderato. Le uova sono tamponate con etanolo al 70% e lasciato asciugare. L&#39;estremità appuntita dell&#39;uovo è trafitto con le forbici chirurgiche (questo è necessario solo in uova di gallina) e 1 mL (a quaglie) o 2 ml (pulcino) di albume è tratto da l&#39;uovo con una siringa da 10 ml (19G ago). I fori vengono poi sigillati con paraffina calda. Prima dell&#39;iniezione attuale, si apre una finestra nella parte superiore del guscio d&#39;uovo con le forbici chirurgiche. Posizionamento nastro adesivo sopra la conchiglia e il taglio attraverso di essa può contribuire a ridurre i detriti dalla shell. Tampone PBS contenente antibiotici è pipettati immediatamente nell&#39;uovo. Per accedere l&#39;embrione, la vitellina e / o membrane amniotiche sono tagliati e deviato con perni di insetti 0,14 mm montato su una porta aghi. Inchiostro atossico (Pelican # 17) viene iniettato sotto la Blastoderm per aiutare a visualizzare l&#39;embrione, utilizzando un fuoco tirato capillare montato su un aspiratore. 3.2 Caricamento e montaggio di micropipette L&#39;estrattore micropipette possono essere caricati con il plasmide di fuoco tirato capillari di adeguato diametro, montato su un aspiratore. Una quantità minima di plasmide viene disegnato con il capillare e caricato nella pipetta dal suo opposto, l&#39;apertura alla punta affilata, e si avvicina la punta da dentro il più possibile. La pipetta è quindi caricato su una pressione manuale iniettore montato su un micromanipolatore. Pressione minima si applica, se necessario, al fine di consentire la soluzione di plasmide per raggiungere la punta della pipetta. 3,3 iniezione plasmidi La pipetta è manipolato in ambiente liquido dell&#39;uovo, mentre applicando una certa pressione d&#39;aria per evitare l&#39;intasamento del puntale. Il dominio del tessuto rilevante è trafitto. La variazione di pressione come la punta entra nel tessuto è spesso sufficiente per rilasciare plasmide con verde visibile veloce. Se questo non è il caso, applicare una leggera pressione sulla siringa fino a quando il plasmide / veloce verdi sono espulsi. Questo processo può essere ripetuto lungo l&#39;asse dell&#39;embrione, ad esempio in somiti adiacenti o lungo la portata del tubo neurale. A seguito di iniezioni, PBS può essere aggiunto. La finestra è sigillata con nastro adesivo (parafilm non è auspicabile soprattutto per le uova di quaglia, che aumenta i tassi di morte dell&#39;embrione, probabilmente bloccando lo scambio di ossigeno attraverso la shell). Gli embrioni trattati sono tornato a un incubatore. Evitare di ventilazione e luogo piccoli contenitori con l&#39;acqua in incubatrice poiché aiutano a mantenere l&#39;umidità e aumentare le rese. 4. La regolazione dei parametri di iniezione e monitoraggio Percentuali di successo Asessing e calibrare i parametri di iniezione diversi è fondamentale per le applicazioni volte a cella singola analisi. Non tutti gli eventi iniezione porterà ad etichettatura di successo di una singola cella. Concentrazione plasmide che è troppo alto può portare a non clonale etichettatura, mentre molto basso risultato concentrazioni elevate percentuali di insuccesso. La concentrazione del plasmide iniettato deve essere ottimizzato per le iniezioni clonale. Si consiglia la diluizione dell&#39;intero magazzino plasmide purificato piuttosto che diluire prepara individuo a una determinata concentrazione. Quest&#39;ultimopotrebbe introdurre alcuni varianza dei tassi di successo, probabilmente dovuto alle variazioni di purezza e di altri parametri come la percentuale di plasmide superavvolto. 4,1 i tassi di successo Valutazione osservazione diretta integrale montaggio La valutazione iniziale di embrioni iniettati possono essere eseguite da tutto il montaggio di osservazione con un binocolo fluorescente. Da sei a otto ore dopo l&#39;iniezione sono sufficienti per valutare le percentuali di successo con un pCAGG avanzata costruire GFP. Questo è fornito il sito di destinazione è abbastanza superficiale da risultare evidente (ad esempio il somite dorsale, dorsale del tubo neurale, ecc ectoderma, vedi Figura 1A-C).. Questa fase è particolarmente utile per la valutazione sperimentale della serie espositiva sia troppe cellule etichettate o, in alternativa, mancando di cellule fluorescenti. Se si desidera ulteriore incubazione, antibiotici soluzione contenente PBS deve essere aggiunto l&#39;uovo, dopo la visualizzazione e il nastro di tenuta deve essere sostituito. 4,2 clonalità Valutare da serial-sezione di analisi Il modo migliore per valutare i tassi di iniezioni di successo è da serie-sezionamento e l&#39;utilizzo di embrioni iniettati immunoistochimica per visualizzare le cellule etichettati. In queste condizioni, tempi di incubazione possono essere il più breve di 4 ore dopo l&#39;iniezione. Gli embrioni sono fissi e trattati per sezionamento paraffina (o criosezionamento). Vetro montati sezioni sono poi de-paraffinized e immuno-colorato per la visualizzazione reporter. Metodi di amplificazione come biotina-streptavidina potrebbe essere auspicabile. Infine, le sezioni seriali vengono analizzati per rilevare le cellule etichettate in segmenti iniettato. Se a seguito di prove iniziali di più piuttosto che singole cellule si ottengono, lo stock plasmide deve essere diluito e il processo ripetuto fino a quando si ottengono risultati adeguati. Da due a 10 volte diluizioni della soluzione madre plasmide può essere necessaria in caso di tassi di successo troppo elevata. Per ogni plasmide di essere transfettate, una calibrazione completa che garantisce clonalità dovrebbe essere ripetuto. 5. Rappresentante Risultati Noi di solito effettuare una singola iniezione di pCAGG-GFP per somite, avendo cura di individuare i segmenti 6-12 per ogni embrione 1 2. Con questa impostazione, un chiaro segnale può essere rilevato da tutta l&#39;osservazione montare 8 ore dopo l&#39;iniezione, in almeno un segmento di un embrione su dieci. In queste condizioni, l&#39;etichettatura è stata ulteriormente confermata da clonale (Figura 1B, C). Quando si utilizzano elevate concentrazioni di DNA, la maggior parte degli embrioni possono presentare almeno una iniezione di successo, aumentando la possibilità che più celle sono state transfettate. Analisi sezione seriale ha rivelato che trasfezioni clonale sono stati raggiunti quando il tasso di successo era del 10%. Questo significa che per raggiungere clonalità, la tecnica è per definizione, altamente inefficiente. D&#39;altra parte, in queste condizioni, oltre il 93% degli eventi etichettatura positivi sono risultati essere clonale 1. <img src="/files/ftp_upload/2133/2133fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Iniezioni clonale di pCAGGS-GFP in progenitori neurali e scheletrico. (AC) sezioni trasversali che mostra l&#39;etichettatura del tubo neurale dorsale (NT) (A), dominio ventrolaterale del dermomyotome (DM) (B), o centrale foglio DM (C) , 6 ore dopo la microiniezione di pCAGGS-GFP per un solo progenitore. (D) Due giorni dopo la transfezione clonale del DM centrale, progenitori singolo generato derivati ​​sia derma (D), così come muscolare (M) (vedi rif. 1 per i dettagli).

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	<li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+analysis+of+the+avian+dermomyotome+sheet+reveals+the+existence+of+single+cells+with+both+dermal+and+muscle+progenitor+fates.">Lineage analysis of the avian dermomyotome sheet reveals the existence of single cells with both dermal and muscle progenitor fates.</a> Development. 132, 689-701 (2005).</li><li>Ben-Yair, R., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+and+bone+morphogenetic+protein+differentially+act+on+dermomyotome+cells+to+generate+endothelium,+smooth,+and+striated+muscle.">Notch and bone morphogenetic protein differentially act on dermomyotome cells to generate endothelium, smooth, and striated muscle.</a> J Cell Biol. 180, 607-618 (2008).</li><li>Cinnamon, Y., Kahane, N., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+early+development+of+specific+hypaxial+muscles+from+the+ventrolateral+myotome.+.">Characterization of the early development of specific hypaxial muscles from the ventrolateral myotome. .</a> Development. 126, 4305-4315 (1999).</li><li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+green+fluorescent+protein+as+a+single-cell+marker+in+living+embryos.">Photoactivatable green fluorescent protein as a single-cell marker in living embryos.</a> Dev Dyn. 233, 983-992 (2005).</li><li>Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+electroporation+in+Xenopus+tadpoles+in+vivo--from+single+cells+to+the+entire+brain.">Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo--from single cells to the entire brain.</a> Differentiation. 70, 148-154 (2002).</li><li>Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+electroporation+for+gene+transfer+in+vivo.">Single-cell electroporation for gene transfer in vivo.</a> Neuron. 29, 583-591 (2001).</li><li>Hewapathirane, D. S., Haas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+electroporation+in+vivo+within+the+intact+developing+brain.">Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain.</a> J Vis Exp. , (2008).</li><li>Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications.">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nat Biotechnol. 20, 87-90 (2002).</li><li>Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+integration+and+conditional+expression+of+electroporated+transgenes+in+chicken+embryos.">Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos.</a> Dev Biol. 305, 616-624 (2007).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo descritto sopra è una modifica di una tecnica descritta in precedenza per la consegna di coloranti lipofilici a sottoinsiemi di cellule piccole o progenitori singolo 3. Ha tre vantaggi principali rispetto alla tecnica standard di elettroporazione. In primo luogo, fornisce un mezzo per l&#39;etichettatura con siti discreta fiducia nei tessuti bersaglio, consentendo maggiore risoluzione spaziale di elettroporazione (vedi ad esempio Figura 1B, C). In secondo luogo, permette l&#39;etichettatura delle singole cellule, permettendo di tracciare il loro lignaggio in vivo in condizioni normali altrimenti 1 2 (Figura 1 C, D). In terzo luogo, miss-espressione del gene a livello di singola cellula fornisce uno strumento per indagare i meccanismi molecolari di segregazione lignaggio, per studiare il ruolo dei fattori di crescita o di altri geni sul comportamento cellulare in un contesto altrimenti normale, ecc Pertanto, questo metodo è complementare la tecnica di elettroporazione ampiamente applicata, e sfrutta ulteriormente l&#39;accessibilità dell&#39;embrione aviaria a spazio-temporalmente guadagno regolato e la perdita della funzione del gene in vivo. Una domanda sempre più rilevante è l&#39;analisi dei comportamenti cellulari a livello di singola cellula (migrazione cellulare, guida assonale, la divisione cellulare, ecc) utilizzando nuove tecnologie di imaging dal vivo 4 5 6 7. In alcune di queste impostazioni sperimentali, potrebbe essere opportuno utilizzare una rapida attivazione specie giornalista (come Venere-GFP) 8 in modo da consentire una visualizzazione precedente della cellula iniettata. Data la semplicità del metodo qui descritto, è molto probabile che possa essere applicato anche ad altri modelli animali, come Zebrafish e Xenopus. Il sistema è molto facile da configurare e utilizzare, e la difficoltà principale sta generando serie sufficientemente grande di embrioni etichettati, così come la scansione per la progenie etichettati in applicazioni che richiedono un serial-sezioni. Nelle nostre mani, le cellule iniettate esposto un segnale GFP facilmente rilevabile per un massimo di 3 giorni, ma questo parametro è probabile che dipendono dai tassi di proliferazione cellulare. Utilizzando un giornalista di lunga durata come il Lac-Z, o trasposoni-mediato trasferimento genico che consentano un&#39;integrazione stabile 9, potrebbe essere possibile per prolungare tracciamento della progenie.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Pipette tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>B100-75-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillaries</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Drummond Scientific</td>
<td>2-000-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Insect needles</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Watkins &amp; Doncaster</td>
<td>E6871</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen-Strep solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biological Industries</td>
<td>03-031-1B</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

single cell transfection in chick embryos

Un tema centrale in biologia dello sviluppo è la diversificazione delle linee e la delucidazione dei meccanismi molecolari alla base. Ciò comporta un&#39;analisi approfondita dei destini di singole cellule in condizioni normali e sperimentali. A tal fine, i metodi di trasfezione che l&#39;obiettivo progenitori singole sono un prerequisito. Descriviamo qui un metodo tecnicamente semplice per trasfezione singole cellule nei tessuti pollo in-ovo, permettendo lignaggio tracciamento affidabile così come la manipolazione genetica. Domini tessuto specifici sono mirati all&#39;interno del somite o tubo neurale, e il DNA è iniettato direttamente nel epitelio di interesse, con conseguente trasfezione sporadici di singole cellule. Utilizzando i giornalisti, le popolazioni clonale può quindi essere fatta per un massimo di tre giorni, e il comportamento delle popolazioni geneticamente manipolati clonale può essere paragonata a quella dei controlli. Questo metodo sfrutta l&#39;accessibilità del embrione di pollo con strumenti emergenti per la manipolazione genetica. Noi confrontare e discutere i vantaggi rispetto al metodo ampiamente utilizzato elettroporazione, e le possibili applicazioni e l&#39;uso in ulteriori in-vivo i modelli sono inoltre suggerito. Noi sosteniamo l&#39;utilizzo di questo metodo come un&#39;aggiunta significativa e complemento per lignaggio tracciamento e gli strumenti esistenti interferenze genetiche.

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Single Cell Transfection in Chick Embryos

Utilizzando punta fine micropipette iniettiamo DNA plasmidico in sottodomini di somiti pollo o tubi neurali. La concentrazione del plasmide è regolata per generare solo cellule transfettate. Abbiamo poi permettere alle cellule di trasformarsi in popolazioni clonale.

Cella Transfection singola in embrioni di pollo

A central theme in developmental biology is the diversification of lineages and the elucidation of underlying molecular mechanisms. This entails a ...

single-cell-transfection-in-chick-embryos

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

11.1K Views.  Hadassah Medical School - Hebrew University. Utilizzando punta fine micropipette iniettiamo DNA plasmidico in sottodomini di somiti pollo o tubi neurali. La concentrazione del plasmide è regolata per generare solo cellule transfettate. Abbiamo poi permettere alle cellule di trasformarsi in popolazioni clonale.

Video: Single Cell Transfection in Chick Embryos

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissezione di 6,5 embrioni di topo dpc

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Ricerca

Biologia

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

In Electroporations Ovo della Fase HH 10 embrioni di pollo

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

Metodo per la Cultura di Chick primi embrioni ex vivo (Nuova Cultura)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

Doppia Monte intero ibridazione in situ di embrioni di pollo primi

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparazione di embrioni per la microscopia elettronica del Drosophila Tubo cuore embrionale

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment are open and allow cations to flow steadily inwards across the membrane, depolarizing the cell. Light exposure triggers the closure of the CNG channels, blocks the inward cation current flow, and thus results in cell hyperpolarization. Based on the polarity of photoreceptors, a suction recording method was developed in 1970s that, unlike the classic patch-clamp technique, does not require penetrating the plasma membrane 1. Drawing the outer segment into a tightly-fitting glass pipette filled with extracellular solution allows recording the current changes in individual cells upon test-flash exposure. However, this well-established "outer-segment-in (OS-in)" suction recording is not suitable for mouse cone recordings, because of the low percentage of cones in the mouse retina (3%) and the difficulties in identifying the cone outer segments. Recently, an inner-segment-in (IS-in) recording configuration was developed to draw the inner segment/nuclear region of the photoreceptor into the recording pipette 2,3. In this video, we will show how to record from individual mouse cone photoresponses using single-cell suction electrode.

We will show how to record flash responses from single mouse cones using a suction electrode.

Unicellulari registrazioni di aspirazione da Fotorecettori Cone mouse

Rod and cone photoreceptors in the retina are responsible for light detection. In darkness, cyclic nucleotide-gated (CNG) channels in the outer segment ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Due-Photon-Based fotoattivazione in Live embrioni di zebrafish

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Imaging Forma Modifica cella in Living Drosophila Embrioni

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. To identify where signaling pathways and tissues act during patterning of the developing face, a 'face transplant' technique has been developed in embryos of the frog Xenopus laevis. A region of presumptive facial tissue (the "Extreme Anterior Domain" (EAD)) is removed from a donor embryo at tailbud stage, and transplanted to a host embryo of the same stage, from which the equivalent region has been removed. This can be used to generate a chimeric face where the host or donor tissue has a loss or gain of function in a gene, and/or includes a lineage label. After healing, the outcome of development is monitored, and indicates roles of the signaling pathway within the donor or surrounding host tissues. Xenopus is a valuable model for face development, as the facial region is large and readily accessible for micromanipulation. Many embryos can be assayed, over a short time period since development occurs rapidly. Findings in the frog are relevant to human development, since craniofacial processes appear conserved between Xenopus and mammals.

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

A technique for transplanting "Extreme Anterior Domain" facial tissue between Xenopus laevis embryos has been developed. Tissue can be moved from one gene expression background into another, allowing the study of local requirements for craniofacial development and for signaling interactions between facial regions.

Trapianti viso a<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embrioni

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...