وأيد هذا البحث [جزئيا] "برنامج البحوث الداخلية" للمعاهد الوطنية للصحة، المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية. خاص بفضل بيدادى شيامال للتحليل الإحصائي. كما نود أن نشكر ياو همفري والطيور غاري اراو يوكي لاستعراض هذه المخطوطات، و "ديمايو فرانكو" لمواصلة تقديم الدعم والمشورة.

وأجريت جميع العمليات كجزء من العمل العادي لمرفق "نيس تدق الماوس خارج الأساسية". وأبقى جميع الفئران في 12:12 دورة ح الضوء: الظلام، وكانت تتغذى على نظام غذائي من المعاهد الوطنية للصحة-31 والمياه متواصلة ad. جميع التجارب التي أجريت وفقا للعناية بالحيوان واستخدام اللجنة للوطنية معهد لعلوم الصحة البيئية.
1-إعداد الحيوان
<ol><li>تتكاثر الفئران المانحين، B6 (Cg)-صور < ج-2J > الفئران الإناث/J في 8-10 أسابيع عمر بطبيعة الحال إلى B6 (Cg)-صور < ج-2J >/J الفئران الذكور بين 8 و 26 أسبوعا من العمر. افحص المقابس بصريا في صباح اليوم التالي (E0.5).</li>
	<li>تتكاثر الفئران المستفيدة، "بستر السويسرية" هي بطبيعة الحال ولدت الفئران الإناث بين 6 و 9 أسابيع من العمر للفئران الذكور "وبستر السويسرية" استؤصل الاسهر لديهم. افحص المقابس بصريا في صباح اليوم التالي (E0.5).</li>
</ol>2-إعداد الخلية ES
<ol><li>129-ديريفيد AB2.2 ES الخلايا، ثقافة الخلايا في دميم وتستكمل مع 15% FBS، 1% الجلوتامين و 1% بنسلفانيا/بكتيريا و 0.1% β-ميركابتوثانول. ثقافة جميع دإط الخلايا الأخرى كل تعليمات ES خلية المورد، باستخدام البروتوكولات الموصى بها.</li>
</ol>3-الأجنة جمع
<ol><li>
تشريح الحيوان
	<ol>
<li>إعداد عدة أطباق 60 ملم، ما يقرب من 1 كل الفئران 5 زائد 3 إضافية، مع 10 مل انفجار جمع وسائل الإعلام (بليون متر مكعب) (10% FBS في دميم)، وكذلك طبق 4 واحد مع مل 0.5 بليون متر مكعب في بئر. حجته على 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5%2.</li>
		<li>Euthanize B6 (Cg)-صور < ج-2J > الفئران الإناث/J في E3.5 استخدام CO2 الخنق، مع معدل تدفق بنسبة 10%.</li>
		<li>وبعد يوثانيزينج، وضع الفئران في موقف ضعيف والرطب في البطن جيدا مع الإيثانول 70%.</li>
		<li>جعل الشق الأول من خلال الجلد فقط، في منتصف البطن، مما يجعل فتح أوسع نطاق ممكن. بعد فتح من خلال جدار البطن، مرة أخرى مما يجعل شق أوسع نطاق ممكن. ملاحظة: القيام بذلك في خطوتين يساعد على الحد من أو القضاء على التلوث الفراء.</li>
		<li>بدءاً مبيض، ويحمل لوحة الدهون المبيض مع الملقط حادة، بعناية إزالة المبيض، قناة، والرحم، واتخاذ المزيد من الحيطة للحفاظ على الأنسجة الدهنية إلى الحد أدنى. إزالة الرحم كوحدة واحدة، أو كأبواق الفردية، بدون أي تغيير في الإجراء التالي.</li>
		<li>بعد الإزالة، مكان الرحم في طبق 60 ملم تحتوي على انفجار جمع وسائل الإعلام.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
إزالة الجنين
	<ol>
<li>إعداد حقنه 10 مل مليئة بليون متر مكعب، وتناسب مع إبرة 25 جرام.</li>
		<li>الرحم واحد في كل مرة، بإزالتها من طبق عقد بليون متر مكعب، لطخة لهم في أنسجة لإزالة الدم الزائد، ووضعه في طبق 60 ملم تحت تكبير منخفضة تشريح مجهر.</li>
		<li>أثناء الضغط بعناية ولطف الرحم أسفل النهاية البعيدة (بالقرب من قناة) مع تشريح الملقط، إدراج الإبرة من الرحم في وسط التوازي طائرة قدر الإمكان. أدخل إبرة أبعد من مجرد النصائح من الملقط.</li>
		<li>تطبيق بعض الضغوط على الملقط عقد الرحم بالإبرة، وطرد حوالي 1 مل من بليون متر مكعب خلال القرن الأفريقي الرحم. ملاحظة: يجب الحرص في هذه الخطوة، سوف يسبب الكثير من الضغط في المحاقن دفق لا يمكن السيطرة عليها من وسائل الإعلام، وكثيراً ما يترك الطبق.</li>
		<li>بعد التنظيف الرحم، والتي تصل إلى 5 كله كل طبق 60 مم، ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة حتى جمع.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
جمع الجنين
	<ol>
<li>استخدام ماصة زجاج مرسومة يد، وجهاز ماصة فم، جمع blastocysts تحت نطاق تشريح، تعيين بين 25 X و 35 س. (الشكل 1). ملاحظة: الفم ماصة جهاز يتألف من 30-40 سم أنابيب مرنة، وإدراج تحت 5 ملم معرف من 1، 000 نصيحة ماصة ميليلتر، تشير أولاً إلى نهاية واحدة، وإلصاق ماصة زجاجية في ذلك. إضافة عامل تصفية حقنه في الطرف الآخر، مع مرفقة 1 cc حقنه لبرميل، لا المكبس، بمثابة قطعة فم.</li>
		<li>إزالة الأطباق من الحاضنة، واستخدام نمط شبكة، تفحص كل جزء من الطبق للأجنة. يتم انتقاء الأجنة فردياً، ووضع على قطره من بليون متر مكعب في طبق ثانوي.</li>
		<li>بعد جمع من جميع الأطباق، تغسل الأجنة مرة أخرى في قطره جديدة بليون متر مكعب، ومن ثم ضع الطبق جيدا 4 انتظارا لحقن.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4-الجنين حقن
<ol><li>التقاط دإط الخلايا على حدة مع إبرة حقن استناداً إلى تأكيد.<ol>
<li>تحضير طبق حقن بإضافة 5-7 مل من حقن وسائل الإعلام (دميم، 10% FBS و 20 ملم حبيس) إلى طبق حقن أسفل زجاج. الحقن تتم في درجة حرارة الغرفة.</li>
		<li>باستخدام الهواء أو زيت ميكروينجيكتور، تنطبق فراغ إبرة حقن رسم خلايا ES. الحرص على الحفاظ على مساحة صغيرة قدر الإمكان بين الخلايا. عد الخلايا ES هنا، أو في خطوة الحقن.</li>
		<li>حدد دإط الخلايا التي هي المتوسطة وصغيرة الحجم بالمقارنة مع السكان عموما من الخلايا، مع سطح أملس، والخالية من العيوب الواضحة مثل فاكوليس. ملاحظة: الخلية ES السكان تختلف اختلافاً كبيرا في نوعية المورفولوجية، والمعايير المستخدمة وسوف تحتاج إلى ضبط معهم.</li>
	</ol>
</li>
	<li>حقن الأجنة بحوالي 15 دإط الخلايا (الشكل 1).<ol>
<li>إرفاق ماصة القابضة نصيحة ميكروينجيكتور جوية ثانية، ووضع جنين قرب افتتاح الحامل. تطبيق فراغ لتأمين الجنين إلى الحامل.</li>
		<li>ضبط للمحور z بتحريك ماصة القابضة لأعلى أو لأسفل حتى أن مجرد لمس الجنين الشريحة، متبوعاً بغرامة يركز زونا. المقبل، ضبط المحور Z من إبرة حقن حيث تكون خلايا ES قرب الحافة في التركيز.</li>
		<li>ضبط الجنين الآن بدفع بلطف من إبرة حقن في الجزء العلوي أو السفلي، الدورية لوضع ICM في الموضع المطلوب.</li>
		<li>أدخل إبرة حقن من خلال زونا، وأما ICM أو تروفوبلست، استخدام ضغط الثابت الخاضعة للرقابة. تطبيق ضغط طفيف على ميكروينجيكتور إبرة الحقن للمساعدة في الحفاظ بلاستوكول من الانهيار.</li>
		<li>الضغط مرة واحدة قد اخترقت الإبرة بلاستوكول، من ميكروينجيكتور لنقل خلايا ES إلى بلاستوكول للجنين. يبدأ وقفه بإيجاز المجسم مشطوف الحواف الإبرة لخروج الجنين إلى السماح الضغط في الجنين إلى العودة إلى وضعها الطبيعي، في حين لا يزال الإبقاء على الخلايا. ملاحظة: تم حقن خلايا ES المجموعة المرجعية عادة، عقب وفاق تقليدية الخلية حقن البروتوكول9، مع الحرص على عدم لمس ICM. أيضا تم حقن دإط الخلايا عن طريق ICM، دفع الإبرة مباشرة من خلال ICM (تكم) (الشكل 2، فيلم تكميلية).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5-نقل إمبريس
<ol><li>نقل أجنة للفئران "السويسرية وبستر" في E2.5، باستخدام جهاز نقل جنين غير جراحية، كل الإجراءات للتصنيع. لا يتطلب هذا الإجراء غير الجراحي أي تخدير أو الرعاية بعد العملية الخاصة. بيت الفئران على حدة بعد نقل الأجنة، ومن خلال الولادة والفطام اللاحقة.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6), 823-826 (2013).</li><li>Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EUCOMM+the+European+Conditional+Mouse+Mutagenesis+Program.">EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).</li><li>Austin, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).</li><li>Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Knockout+and+Reporter+Mouse+Line+Generation+and+Breeding+Colony+Establishment+Using+EUCOMM+Conditional-Ready+Embryonic+Stem+Cells:+A+Case+Study.">Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).</li><li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells.">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+and+female+mice+derived+from+the+same+embryonic+stem+cell+clone+by+tetraploid+embryo+complementation.">Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vigor,+fetal+overgrowth,+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation.">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).</li><li>Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+potential+and+behavior+of+tetraploid+cells+in+the+mouse+embryo.">Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo.</a> Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+of+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+four-+or+eight-cell+embryos+by+piezo+micromanipulation.">Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation.</a> Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).</li><li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses.">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse embryo. , (2014).</li><li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , (2011).</li><li>Young, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mechanical+stimulation+on+the+reprogramming+of+somatic+cells+into+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).</li></ol>

الكتاب قد لا المصالح المتنافسة الكشف.

وكان يعتقد منذ فترة طويلة أن أي اضطراب الرياضيات يمكن أن يؤدي إلى وفيات، في الواقع، بروتوكولات microinjection الكيسة الحالي ما زال التحذير من هذا12،13. ما أثبتنا هنا أن microinjection من خلال مؤسسة أي سي أم لا يضر بالجنين، وزيادة عائد التركيبات.
لا تم التعرف على الآلية الدقيقة لهذا الغرض. ومع ذلك، تعطل الميكانيكية في الرياضيات، و hypoblast المصاحبة لها، ينبغي زيادة حدوث وفاق خلية إدماج ICM المشكل حديثا بعد microinjection. وقد أظهرت عمل مؤخرا في مجال إيبسكس أن التحفيز الميكانيكي ويساعد في إعادة برمجة الإنسان [ايبسك]14. إذا كان التلاعب ميكانيكية تأثير مماثل في مؤسسة أي سي أم للجنين الماوس، فإنه يمكن أن يترتب عليها عودة خلايا ICM التي يحتمل أن تكون قد بدأت في التفريق، مرة أخرى إلى حالة pluripotent، إزالة احتمال 'السبق' من الجهة المانحة الكيسة المشتقة من الخلايا في تشكيل الأنسجة الجنينية. وأخيراً، فمن الممكن أن الحقن من خلال نتائج ICM في وفاة عدد غير معروف من الخلايا في ICM، خفض مستوى المنافسة ميكروينجيكتيد وراثيا تعديل دإط الخلايا.
الفوائد الرئيسية لتعديل هذا الأسلوب أنه يتطلب لا التعلم الجديدة، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها، أو المعدات. جميع التقنيات التي تحمل أكثر من حقن الكيسة القياسية. الخطوات الأكثر أهمية أيضا تظل دون تغيير؛ جمع المناسب وفي الوقت المناسب للأجنة، وشروط الثقافة المناسبة للأجنة قبل وأثناء وبعد الحقن. عند استخدام تقنية نقل الأجنة غير الجراحية، فأصبح أكثر أهمية لتحديد الفئران المستلم الصحيح. كان الجراح بالتحويلات الجراحية، الفرصة لدراسة الماوس للتحقق من حالة الإنجابية السليمة، حيث مع التحويلات غير الجراحية، هذا غير ممكن. ينبغي أن تكون الفئران في سن الإنجاب رئيس الوزراء (6-9 أسابيع)، وينبغي أن تستخدم فقط من الفئران مع المقابس مرئية. الجانب الأكثر أهمية لهذا الأسلوب، ووفاق كل خلية الحقن، هو نوعية دإط الخلايا.
عند التعامل مع جودة عالية، وخطوط الخلايا قوية، هذا الأسلوب قد تسفر عن الاختلافات الحد الأدنى فقط، ولكن مع وفاق الأمثل الخلية خطوط أو صعوبة في العمل مع خطوط، أي، حتى التحسينات الطفيفة، يمكن أن تكون كبيرة وجعل الفرق بين نجاح المشروع وفشل. وأيضا من ملاحظة، أن خلال هذه الدراسة، عدة خطوط الخلايا ES المتاحة تجارياً إنشاء التركيبات germline، وجميعهم تقريبا الخطوط ES التجارية التي ولدت التركيبات germline حقن تكم. هنا أننا أظهرنا أن تغيير بسيط في أسلوب يمكن أن يؤدي في تحسن كبير في الإنتاجية، دون تكبد أي تكاليف إضافية لمعدات جديدة، أو التدريب، أو زيادة استخدام الحيوانات.

لما يقرب من 25 عاماً، تم إنشاء الفئران وراثيا المستهدف عملية بطيئة، كثيرا ما تعرقل باختناق في مرحلة microinjection blastocysts دإط الخلايا لتوليد germline تحيل التركيبات. التطورات الأخيرة، بما في ذلك كريسبر/Cas91،2 استهداف دإط الخلايا ووفاق الفائق الخلية اتحادات جيل مثل كومب، تحسنت الجيل/توافر دإط الخلايا المحورة وراثيا. ومع ذلك، يظل توليد التركيبات germline عنق زجاجة في خلق الفئران المعدلة وراثيا من هذه الخلايا ES3،4. مشاريع توليد خلايا ES الفائق ابتليت بتقلب عالية في وفاق خلية الجودة، هو أمر حاسم لنجاح إنشاء التركيبات germline. بالإضافة إلى ذلك، بعض خطوط الخلية ES المستخدمة عادة معروفة انيوبلويدي العالية، وصعوبة إنتاج germline التركيبات المختصة5.
تم تطوير العديد من الأساليب لخلق الفئران مع أما حلما أعلى، أو تماما المستمدة خلية ES الفئران6،،من78،،من910. بينما كل من هذه الأنظمة له مزاياه الخاصة، كما أن لها عيوبها. توليد التركيبات تيترابلويد، في حين توليد 100% وفاق الخلية المستمدة من الفئران، غير فعالة، وتقتصر عموما على خطوط أووتبريد 5،6. أحدث أساليب الحقن morula يمكن أن تسفر عن ارتفاع نسبة التركيبات، تقترب من 100%، لكن عموما تتطلب معدات إضافية هامة (أشعة الليزر أو بيزوس) وتدريب10،11. في المختبرات حيث هذه التقنيات موجودة بالفعل، قد لا تكون هذه المنهجية الجديدة الضرورية.
وكان الهدف من هذه الدراسة لإيجاد أسلوب يستخدم التقنيات الشائعة والمعدات متاحة بسهولة لزيادة معدل توليد الوهم، وزيادة فرصة انتقال germline اليل متحولة لإنشاء مستعمرة الماوس اللاحقة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ES Cell injection needle</td>
			<td>Humagen</td>
			<td>MSC-20-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSET device</td>
			<td>Paratechs</td>
			<td>60010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>10439-024</td>
			<td>lots should be individually tested for ES Cell compatibility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro injector</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>Cell Tram Air 5176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6(Cg)-Tyr&#60;c-2J&#62;/J</td>
			<td>Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Taconic, USA</td>
			<td>Tac:SW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Dish</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P50G-0-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trans-inner cell mass injection of embryonic stem cells leads to higher chimerism rates

في محاولة لزيادة الكفاءة في خلق الفئران المعدلة وراثيا عن طريق منهجيات خلية دإط، نقدم لتكيف لبروتوكول الحقن الكيسة الحالي. هنا يمكننا تقرير أن دوران بسيطة للجنين، وحقن من خلال كتلة الخلايا الداخلية عبر (تكم) زيادة النسبة المئوية للفئران تشيميريك من 31 في المائة إلى 50 في المائة، مع أي معدات إضافية أو مزيدا من التدريب المتخصص. 26 مختلفة فطري الحيوانات المستنسخة، وتم حقن الحيوانات المستنسخة إجمالي 35 خلال فترة 9 أشهر. كان هناك لا اختلاف كبير في معدل الحمل أو معدل الاسترداد الأجنة بين تقنيات الحقن التقليدية وتكم. ولذلك، دون أي تغيير رئيسي في عملية الحقن والمواقع بسيطة الكيسة والحقن من خلال ICM، الإفراج عن خلايا ES في تجويف blastocoel يمكن أن يحتمل أن تحسين كمية الإنتاج تشيميريك واللاحقة نقل الخط.

علاج خط الخلية كأثر عشوائي، استخدم نموذج خطي آثار مختلطة لتحليل البيانات في البرنامج (مثل محركات أقراص SAS (الإصدار 9.2)). تحليل كل الخاضعة لعدد الأجنة المنقولة وخط الخلية. التحليل الثاني يسيطر أيضا على عدد من الجراء التي نجت.
لهذه الدراسة، كل خط الخلية وفاق واستنساخ تم حقن على حد سواء مع التقليدية وتقنيات تيكم، بالتناوب بين هاتين الطريقتين بعد كل الأجنة. بعد الحقن، فصل في الطبق وتجميعها بواسطة نقل، وعموما بين الأجنة 12 و 15 كل مستلم الإناث الأجنة. الأجنة التي لم يكن بلاستوكويل واضحة للعيان، تفتقر إلى Zona pellucida، أو حيث فشلت دإط الخلايا ميكروينجيكتيد للدخول بلاستوكويل، وأزيلت من هذه التجربة.
وكان أول بيانات فحص معدل الحمل. كما هو موضح في الشكل 3، كانت معدلات الحمل دون تغيير في المجموعة تكم من السيطرة على المجموعة. بالإضافة إلى ذلك، نجا نسبة متساوية من الجراء للفطام (P = 0.50، الرقم 4). الأهم من ذلك، بينما عدد الفئران في الفطام لم يتغير، عدد الجراء عرض تشيميريسم لون معطف ارتفع من 31% إلى 50% للمجموعة تكم (p = 0.005، الرقم 5). واعتبر درجة تشيميريسم لون معطف ذاتية جداً ليتم تقييمه في هذه الدراسة، وليس حقاً ذات الصلة بالفعل تشيميريسم.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56955/56955fig1.jpg"> رقم 1: المعدات المتخصصة. (اليسار) حقن مجهر الإعداد، بما في ذلك المتلاعبين الصغرى (A) والهواء الترام الخلية (ب) . (اليمين) أجهزة ماصة الفم، مع ماصة زجاجية مرسومة (ج) ، (د) 1000µL ماصة نصيحة والأنابيب (ه) ، التصفية (و) والمحاقن (ز) للبرميل. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56955/56955fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56955/56955fig2.jpg"> الشكل 2: مثال لحقن الأجنة الكيسة. (أ وب) أسلوب الحقن التقليدية، حيث يدخل إبرة حقن مقابل من ICM، تجنب أي تفاعل مع ICM. (ج، د) أسلوب تكم، حيث يدخل إبرة حقن مباشرة من خلال مؤسسة أي سي أم في blastocoel. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56955/56955fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56955/56955fig3.jpg"> الشكل 3: معدل الحمل. أن معدل الحمل أظهرت لا يوجد فرق كبير بين التقليدية (39/50) وتكم (64/76). المتوسطات بالإضافة إلى الخطأ المعياري للوسط (SEM). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56955/56955fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56955/56955fig4.jpg"> الشكل 4: معدل البقاء على قيد الحياة- معدل البقاء على قيد الحياة هو عدد الجراء التي نجت للفطام، حيث كان هناك القمامة إلى فطم. الجراء التي لم ينج للفطام، وليتر حيث نجا لا الجراء للفطام، لم تدرج في هذه البيانات. المتوسطات بالإضافة إلى الخطأ المعياري للوسط (SEM). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56955/56955fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56955/56955fig5.jpg"> رقم 5: معدل تشيميريسم- تمثل هذه البيانات فقط العدد إذا التركيبات أنتجت، ولا تعالج نوعية تشيميريسم. في المجموعة التقليدية، أظهرت 31% (34/110) من النسل تشيميريسم، حيث كان الفريق تيكم بمعدل 50% (79/158). في المتوسط، بالإضافة إلى الخطأ المعياري للوسط (SEM). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56955/56955fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>

Watch this Scientific Journal Video about Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates at JoVE.com

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

نقدم هنا بروتوكولا لزيادة إنتاج الوهم دون الاستخدام المعدات الجديدة. يمكن تغيير اتجاه بسيط للجنين لحقن زيادة عدد الأجنة المنتجة، ويساعد على تقليل الفترة الزمنية لنقل الخط.

حقن الخلية الداخلية عبر كتلة من الخلايا الجذعية الجنينية يؤدي إلى ارتفاع في أسعار تشيميريسم

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

trans-inner-cell-mass-injection-embryonic-stem-cells-leads-to-higher

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K Views.  NIEHS/NIH. نقدم هنا بروتوكولا لزيادة إنتاج الوهم دون الاستخدام المعدات الجديدة. يمكن تغيير اتجاه بسيط للجنين لحقن زيادة عدد الأجنة المنتجة، ويساعد على تقليل الفترة الزمنية لنقل الخط.

Video: Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

انتشار الخلايا الجنينية البشرية (ES) الجذعية

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

اشتقاق خلايا الجذعية المكونة للدم من الفئران خلايا الجذعية الجنينية

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

اشتقاق الخلايا الجذعية الجنينية البشرية التي Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

مناعي لونين من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This pathology causes symptoms such as intermittent claudication (pain with walking), painful ischemic ulcerations, or even limb-threatening gangrene. It is generally believed that the vascular endothelium, a monolayer of endothelial cells that invests the luminal surface of all blood and lymphatic vessels, plays a dominant role in vascular homeostasis and vascular regeneration. As a result, stem cell-based regeneration of the endothelium may be a promising approach for treating PAD.In this video, we demonstrate the transplantation of embryonic stem cell (ESC)-derived endothelial cells for treatment of unilateral hindimb ischemia as a model of PAD, followed by non-invasive tracking of cell homing and survival by bioluminescence imaging. The specific materials and procedures for cell delivery and imaging will be described. This protocol follows another publication in describing the induction of hindlimb ischemia by Niiyama et al.1

The surgical procedure for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial cells to the ischemic hindlimb is demonstrated, with non-invasive tracking by bioluminescence imaging.

الخلايا الجذعية الجنينية المستمدة من الخلايا البطانية لعلاج نقص التروية Hindlimb

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

العزلة واشتقاق خلايا الفأر الجنينية بيرشوت

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

تمايز الخلايا الجذعية الجنينية في السلائف Oligodendrocyte

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

رسم مصير الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال تكوين ورم مسخي

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

استخدام LysoTracker لكشف موت الخلية المبرمج في الأجنة والخلايا الجذعية الجنينية التفريق

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

الاستقراء وتحليل الظهارية الوسيطة الانتقالية ل

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...