Esta investigación fue apoyada [en parte] por el programa de investigación intramuros del NIH, Instituto Nacional de Ciencias de salud ambiental. Agradecimiento especial a Shyamal Peddada para el análisis estadístico. También queremos agradecer a Humphrey Yao, Gary Ave y Yuki Arao para la revisión de este manuscrito y Franco DeMayo por su continuo apoyo y asesoramiento.

Todas las operaciones se realizaron como parte del funcionamiento normal de la instalación de NIEHS Knock Out Mouse base. Todos los ratones fueron mantenidos en un 12:12 ciclo de h luz: oscuridad y se alimentan una dieta de agua y NIH-31 ad libitum. Todos los experimentos fueron realizados según el cuidado Animal y Comité de uso del nacional Instituto de Ciencias de salud ambiental.
1. animal preparación
<ol><li>Raza de ratones donantes, B6 (Cg)-Tyr < c-2J > ratones femeninos/j 8-10 semanas de edad naturalmente a B6 (Cg)-Tyr < c-2J > /J ratones machos entre 8 y 26 semanas de edad. Verificación se conecta visualmente a la mañana siguiente (E0.5).</li>
	<li>Se crían ratones receptores, Swiss Webster ratones hembra entre 6 y 9 semanas de edad se crían naturalmente a vasectomía ratones machos Swiss Webster. Verificación se conecta visualmente a la mañana siguiente (E0.5).</li>
</ol>2. ES la célula preparación
<ol><li>Para derieved 129 AB2.2 ES cells, cultura células en DMEM suplementado con 15% FBS, 1% glutamina, 1% Penn/strep y 0.1% β-mercaptoetanol. Cultura todas las células de otras ES siguiendo las instrucciones del proveedor de celular ES, utilizando los protocolos recomendados.</li>
</ol>3. embrión colección
<ol><li>
Disección de animales
	<ol>
<li>Preparar varios platos de 60 mm, aproximadamente 1 por 5 ratones más suplemento 3, con 10 mL ráfaga colección los medios de comunicación (BCM) (10% FBS en DMEM), y un 4 plato bien con 0.5 mL de BCM por pozo. Equilibrar a 37 ° C, 5% CO2.</li>
		<li>Eutanasia a B6 (Cg)-Tyr < c-2J > ratones femeninos /J en E3.5 CO2 asfixia, con un caudal de 10%.</li>
		<li>Después euthanizing, coloque el ratón en la posición supina y mojado el abdomen con etanol al 70%.</li>
		<li>Hacer la primera incisión a través de la piel, en el punto medio del abdomen, haciendo la apertura tan amplia como sea posible. A continuación abra a través de la pared abdominal, otra vez hacer la incisión lo más amplia posible. Nota: Hacerlo en dos pasos ayuda a reducir o eliminar la contaminación de la piel.</li>
		<li>A partir de un ovario y sostiene la almohadilla grasa del ovario con fórceps romos, retire con cuidado el ovario, oviducto y útero, teniendo mucho cuidado para mantener el tejido adiposo a un mínimo. Extirpar el útero como una sola unidad, o como los cuernos, sin cambio en el procedimiento siguiente.</li>
		<li>Después del retiro, colocar el útero en un plato de 60 mm que contiene medios de colección ráfaga.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eliminación de embriones
	<ol>
<li>Preparar una jeringa de 10 mL llenada de BCM y montar con una aguja de 25 G.</li>
		<li>Un útero a la vez, les quite el plato de sujeción de BCM, seque en un paño para quitar el exceso de sangre y coloque en un plato de 60 mm con un aumento bajo microscopio de disección.</li>
		<li>Sujetando con cuidado y suavemente del útero justo por debajo del extremo distal (cerca del oviducto) con pinzas de disección, inserte la aguja en el centro del útero en como paralelo un plano como sea posible. Insertar la aguja más allá de las puntas de las pinzas.</li>
		<li>Aplicar presión a las pinzas para sujetar el útero a la aguja y expulsar aproximadamente 1 mL de BCM a través del cuerno del útero. Nota: Debe tenerse cuidado en este paso, ya que demasiada presión sobre la jeringa causará un flujo incontrolable de los medios de comunicación, a menudo dejando el plato.</li>
		<li>Después del lavado del útero, útero entero hasta 5 por plato 60 mm, vuelva a colocar el plato en la incubadora hasta la colección.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Colección de embriones
	<ol>
<li>Utilizando una pipeta de cristal dibujado de la mano y un aparato de pipetas de boca, recoger blastocistos en un ámbito de disección, entre 25 X y 35 X. (Figura 1). Nota: Aparato de pipetas de boca consta de 30-40 cm de tubería flexible, menores de 5 mm de diámetro interior Inserte un 1 000 μl Punta de pipeta, punto primero en un extremo y colocar la pipeta de vidrio en él. Agregar un filtro de jeringa en el otro extremo, con un atado 1 cc jeringa barril, sin émbolo, a actuar como una pieza de la boca.</li>
		<li>Eliminar platos de la incubadora y usando un patrón cuadriculado, examinaron cada parte del plato para embriones. Embriones se recogen hasta individualmente y coloque sobre la gota de BCM en un plato secundario.</li>
		<li>Después de recoger de todos los platos, lavar los embriones una vez más en una gota de dulce BCM y luego colocar en el plato bien 4 a la espera de la inyección.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. embrión inyección
<ol><li>Recoger células madre embrionarias individualmente con la aguja de inyección basada en la confirmación.<ol>
<li>Preparar un plato de inyección mediante la adición de 5-7 mL de medio de inyección (DMEM, 10% FBS y 20 mM HEPES) a un plato de inyección de fondo de cristal. Las inyecciones se realizan a temperatura ambiente.</li>
		<li>Uso microinyector aire o aceite, aplique vacío a la aguja para extraer células madre embrionarias. Tenga cuidado de mantener como poco espacio como sea posible entre las células. Cuentan las células ES aquí o en la etapa de inyección.</li>
		<li>Seleccione las celdas ES que son de mediano a pequeño tamaño en comparación con la población en general de las células, con una superficie lisa y sin defectos obvios como las vacuolas. Nota: Poblaciones celulares ES varían mucho en calidad morfológica, y las normas utilizadas tendrán que ajustar con ellos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inyectar los embriones con aproximadamente 15 células madre embrionarias (figura 1).<ol>
<li>Colocar una pipeta de sujeción punta un microinyector segundo de aire y coloque un embrión cerca de la abertura del titular. Se aplica vacío para sujetar el embrión al titular.</li>
		<li>Ajuste para el eje z moviendo la pipeta holding hacia arriba o hacia abajo para que el embrión apenas toca la diapositiva, seguida de concentración de la multa en la zona. A continuación, ajuste el eje Z de la aguja de inyección para que células madre embrionarias cerca de la punta están en foco.</li>
		<li>Ajuste el embrión ahora empujando suavemente de la aguja de inyección en la parte superior o inferior, girando para poner el ICM en la posición deseada.</li>
		<li>Inserte la aguja a través de la zona y el ICM o trofoblasto, usando una presión firme pero controlada. Aplicar una ligera presión a la microinyectora de la aguja de inyección para ayudar a mantener el blastocoel de derrumbarse.</li>
		<li>Una vez que la aguja ha penetrado el blastocoel, aplicar presión de la microinyectora para transferir células madre embrionarias para el blastocoel del embrión. PAUSE brevemente como el bisel de la aguja empieza a salir el embrión para permitir la presión en el embrión para volver a la normalidad, al tiempo que conserva las células. Nota: Referencia grupo células madre embrionarias fueron inyectados normalmente, siguiendo un tradicional ES la célula de inyección protocolo9, teniendo cuidado de no para tocar el ICM. También se inyectaron células madre embrionarias a través del ICM, empuja la aguja directamente a través de la ICM (TICM) (figura 2película suplementario).</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. transferencia de eEmbryos
<ol><li>Transferencia de embriones de ratones Swiss Webster en E2.5, utilizando un dispositivo de transferencia embrionaria no quirúrgica, por procedimientos de fabricación. Este procedimiento no quirúrgico no requiere anestesia ni cuidados especiales después de la operación. Ratones de la casa individualmente después de la transferencia de embriones y a través de la entrega y posterior al destete.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Genome+Engineering+Using+CRISPR/Cas+Systems.">Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.</a> Science. 339 (6), 819-823 (2013).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6), 823-826 (2013).</li><li>Friedel, R., Seisenberger, C., Kaloff, C., Wurst, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EUCOMM+the+European+Conditional+Mouse+Mutagenesis+Program.">EUCOMM the European Conditional Mouse Mutagenesis Program.</a> Brief Funct Genomic Proteomic. 6 (3), 180-185 (2007).</li><li>Austin, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+knockout+mouse+project.">The knockout mouse project.</a> Nat Genet. 36 (9), 921-924 (2004).</li><li>Coleman, J. L., Brennan, K., Ngo, T., Balaji, P., Graham, R. M., Smith, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Knockout+and+Reporter+Mouse+Line+Generation+and+Breeding+Colony+Establishment+Using+EUCOMM+Conditional-Ready+Embryonic+Stem+Cells:+A+Case+Study.">Rapid Knockout and Reporter Mouse Line Generation and Breeding Colony Establishment Using EUCOMM Conditional-Ready Embryonic Stem Cells: A Case Study.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 30, 105 (2015).</li><li>Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+completely+cell+culture-derived+mice+from+early-passage+embryonic+stem+cells.">Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (18), 8424-8428 (1993).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Male+and+female+mice+derived+from+the+same+embryonic+stem+cell+clone+by+tetraploid+embryo+complementation.">Male and female mice derived from the same embryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation.</a> Nat Biotechnol. 20 (5), 455-459 (2002).</li><li>Eggan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+vigor,+fetal+overgrowth,+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation.">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (11), 6209-6214 (2001).</li><li>Eakin, G. S., Hadjantonakis, A. K., Papaioannou, V. E., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+potential+and+behavior+of+tetraploid+cells+in+the+mouse+embryo.">Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo.</a> Dev Biol. 288 (1), 150-159 (2005).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+production+of+mice+from+embryonic+stem+cells+injected+into+four-+or+eight-cell+embryos+by+piezo+micromanipulation.">Efficient production of mice from embryonic stem cells injected into four- or eight-cell embryos by piezo micromanipulation.</a> Stem Cells. 26 (7), 1883-1890 (2008).</li><li>Poueymirou, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F0+generation+mice+fully+derived+from+gene-targeted+embryonic+stem+cells+allowing+immediate+phenotypic+analyses.">F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses.</a> Nat Biotechnol. 25 (1), 91-99 (2007).</li><li>Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the Mouse embryo. , (2014).</li><li>Pease, S., Saunders, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advanced Protocols for Animal Transgenesis. , (2011).</li><li>Young, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+mechanical+stimulation+on+the+reprogramming+of+somatic+cells+into+human-induced+pluripotent+stem+cells.">Effects of mechanical stimulation on the reprogramming of somatic cells into human-induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Res Ther. 8 (1), 139 (2017).</li></ol>

Los autores tienen intereses que compiten a revelar.

Durante mucho tiempo se ha pensado que cualquier disturbio del ICM podría conducir a la mortalidad, de hecho, los protocolos actuales de microinyección blastocisto todavía advierten de esta12,13. Lo que hemos mostrado aquí es la microinyección a través de la RIC no es perjudicial para el embrión y aumenta la producción de quimeras.
El mecanismo exacto de este efecto no ha sido identificado. Sin embargo, la interrupción mecánica del ICM y el hipoblasto que lo acompaña, debe aumentar la incidencia de la integración de células ES en el ICM recién formado tras microinyección. Trabajos recientes en el campo de iPSCs ha demostrado que estímulo mecánico ayuda a la reprogramación de iPSC humana14. Si la manipulación mecánica tiene un efecto similar en el ICM del embrión de ratón, podría tener el efecto de volver las células de la ICM que potencialmente se empezó a diferenciar, a un estado pluripotente, eliminando un potencial 'head start' del donante blastocisto células derivadas en la formación del tejido embrionario. Por último, es posible que la inyección a través de los resultados ICM en la muerte de un número desconocido de células en el ICM, bajar el nivel de competencia para el microinyectados genéticamente modificado células madre embrionarias.
Los principales beneficios de la modificación de este método son que no requiere de nuevos aprendizajes, resolución de problemas o equipo. Todas las técnicas se transportan de inyección estándar de blastocistos. Los pasos más críticos también permanecen inalterados; adecuada y oportuna colección de embriones y las condiciones de cultivo adecuado para los embriones, antes, durante y después de la inyección. Cuando se utiliza la técnica de transferencia embrionaria no quirúrgica, es más crítico para seleccionar los ratones receptores adecuados. Con las transferencias de quirúrgicas, el cirujano tuvo la oportunidad de examinar el ratón para comprobar el correcto estado reproductivo, donde con las transferencias no-quirúrgico, esto no es posible. Ratones deben ser privilegiada edad de procrear (6-9 semanas) y deben utilizarse solamente ratones con enchufes visibles. El aspecto más importante de esta técnica e inyecciones de células ES todos, es la calidad de las células madre embrionarias.
Cuando tratando con alta calidad, líneas celulares sólidas, esta técnica puede rendir sólo mínimas diferencias, pero con ES subóptima de células o difícil de trabajar con líneas, cualquiera, incluso menores de mejoras, puede ser significativa y hacer la diferencia entre el éxito del proyecto y el fracaso. También es de nota, que en el transcurso de este estudio, varias líneas de celulares disponibles en el mercado ES generan del germline quimeras, y casi todas las líneas ES comerciales que genera quimeras del germline las inyecciones TICM. Aquí hemos demostrado que un simple cambio en la técnica puede resultar en una mejora significativa en la productividad, sin incurrir en costes adicionales para el equipo nuevo, entrenamiento o aumentar el uso de animales.

Durante casi 25 años, la creación de ratones genéticamente apuntados ha sido un proceso lento, a menudo obstaculizado por un cuello de botella en la etapa de blastocistos ES células microinyección para la generación de germline transmisión de quimeras. Los avances recientes, incluyendo CRISPR/Cas91,2 en células madre embrionarias y de alto rendimiento ES célula consorcios de generación como KOMP, han mejorado la generación y disponibilidad de modificados genéticamente células madre embrionarias. Sin embargo, la generación de quimeras del germline sigue siendo un cuello de botella en la creación de ratones modificados genéticamente de estas células ES3,4. Proyectos de generación de alto rendimiento ES la célula han estado plagados de alta variabilidad en la calidad de células ES, que es crítica para la exitosa creación de quimeras del germline. Además, algunas de las líneas de células ES comúnmente utilizadas son conocidos por aneuploidia alta y la difícil producción de germline quimeras competentes5.
Muchos métodos se han desarrollado para la creación de ratones con una quimera o superior, o totalmente celular ES derivado ratones6,7,8,9,10. Mientras que cada uno de estos sistemas tiene sus propios méritos, también tienen sus defectos. La generación de quimeras tetraploides, mientras que la generación de celulares ES de 100% derivados de ratones, es ineficiente y generalmente limitado a líneas exogámica 5,6. Más nuevos métodos de inyección de mórula pueden producir alto porcentaje quimeras, cercana al 100%, pero generalmente requieren equipo adicional significativa (láser o piezoeléctricos) y capacitación10,11. En laboratorios donde estas técnicas ya están en marcha, esta nueva metodología puede no ser necesaria.
Objetivo de este estudio fue encontrar un método que utiliza técnicas comunes y equipos disponibles para aumentar la velocidad de generación de quimera, aumentando la posibilidad de transmisión del germline del alelo del mutante para establecer la colonia de ratón posterior.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>ES Cell injection needle</td>
			<td>Humagen</td>
			<td>MSC-20-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSET device</td>
			<td>Paratechs</td>
			<td>60010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Gibco (life technologies)</td>
			<td>10439-024</td>
			<td>lots should be individually tested for ES Cell compatibility.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Micro manipulator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro injector</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>Cell Tram Air 5176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM IRB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4 well dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm dish</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6(Cg)-Tyr&#60;c-2J&#62;/J</td>
			<td>Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA</td>
			<td>000058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Swiss Webster mice</td>
			<td>Taconic, USA</td>
			<td>Tac:SW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection Dish</td>
			<td>MatTek Corp.</td>
			<td>P50G-0-30-F</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

trans-inner cell mass injection of embryonic stem cells leads to higher chimerism rates

En un esfuerzo por aumentar la eficiencia en la creación de ratones modificados genéticamente a través de metodologías ES celular, presentamos una adaptación del protocolo actual de inyección de blastocisto. Aquí divulgamos que una simple rotación del embrión y de la inyección a través de la masa celular de Trans-interno (TICM) aumentó el porcentaje de ratones quiméricos del 31% al 50%, con ningún equipo adicional o formación más especializada. endogámicas de 26 diferentes clones y clones total 35 fueron inyectados en un período de 9 meses. No hubo diferencias significativas en la tasa de embarazo o índice de recuperación de embriones entre técnicas de inyección tradicional y TICM. Por lo tanto, sin ninguna alteración importante en el proceso de inyección y un simple posicionamiento del blastocisto e inyectar a través del ICM, liberación de las células madre embrionarias en la cavidad del blastocoel puede mejorar potencialmente la cantidad de producción quimérica y posterior transmisión de la línea germinal.

Tratamiento de la línea celular como el efecto aleatorio, un modelo lineal de efectos mixtos se utilizó para analizar los datos en el software (e.g. SAS (versión 9.2)). Cada análisis para el número de embriones transferidos y la línea celular. El segundo análisis también controlado por el número de cachorros que sobrevivieron.
Para este estudio, cada línea ES celular y el clon fue inyectado con tradicionales y técnicas TICM, alternando entre los dos métodos después de cada embrión. Después de la inyección, los embriones fueron separados en el plato y agrupados por transferencia, generalmente entre 12 y 15 embriones por hembra receptora. Embriones que no tenía una visible blastocoel, carecía de una Zona pelúcida, o donde las células ES microinyectadas ha podido entrar el blastocoel, se eliminaron de este experimento.
Los primeros datos examinados fueron la tasa de embarazo. Como se muestra en la figura 3, las tasas de embarazo fueron inalteradas en el grupo TICM desde el grupo de control. Además, sobrevivió a una proporción de crías al destete (P = 0.50, figura 4). Lo más importante, mientras que el número de ratones al destete permanece sin cambios, el número de crías mostrando capa color chimerism aumentó de 31% a 50% para el grupo TICM (p = 0.005, figura 5). El grado de quimerismo de color de capa era considerado demasiado subjetiva para ser evaluados en este estudio y no verdaderamente relevante a quimerismo de línea germinal.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56955/56955fig1.jpg"> Figura 1: equipos especializados. (Izquierda) Configuración del microscopio de inyección, como manipuladores de Micro (A) y (B) célula tranvía aire. (Derecha) Aparato de pipetas de boca, con pipeta de vidrio estirado (C) , (D) 1000μl pipeta, tubo (E) , filtro (F) y (G) jeringa de barril. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56955/56955fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56955/56955fig2.jpg"> Figura 2: ejemplo de inyección de embrión blastocisto. (A, B) Método de inyección tradicional, donde la aguja entra en frente del ICM, evitando cualquier interacción con el ICM. (C, D) Método del TICM, donde la aguja entra directamente a través del ICM al blastocoel. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56955/56955fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56955/56955fig3.jpg"> Figura 3: tasa de embarazo. La tasa de embarazo no mostró diferencias significativas entre el tradicional (39/50) y TICM (64/76). Medias y error estándar de la media (SEM). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56955/56955fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56955/56955fig4.jpg"> Figura 4: tasa de supervivencia. La tasa de supervivencia es el número de crías que sobrevivieron hasta el destete, donde había una camada de destetar. Que no sobreviven al destete los cachorros y camadas donde no sobrevivieron crías al destete, no se incluyeron en estos datos. Medias y error estándar de la media (SEM). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56955/56955fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56955/56955fig5.jpg"> Figura 5: tasa de Chimerism. Estos datos sólo representan el número si quimeras producción y no responde a la calidad de quimerismo. En el grupo tradicional, 31% (34/110) de la descendencia demostraron chimerism, donde el grupo TICM tuvo un promedio de 50% (79/158). Promedio y error estándar de la media (SEM). <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56955/56955fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Aquí presentamos un protocolo para aumentar la producción de quimeras sin el uso de nuevos equipos. Un cambio de orientación simple del embrión para la inyección puede aumentar el número de embriones producidos y potencialmente reducir la línea de tiempo a la transmisión de la línea germinal.

Trans-interno celular masiva inyección de células madre embrionarias conduce a mayores tasas de quimerismo

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

trans-inner-cell-mass-injection-embryonic-stem-cells-leads-to-higher

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.1K vistas.  NIEHS/NIH. Aquí presentamos un protocolo para aumentar la producción de quimeras sin el uso de nuevos equipos. Un cambio de orientación simple del embrión para la inyección puede aumentar el número de embriones producidos y potencialmente reducir la línea de tiempo a la transmisión de la línea germinal.

Video: Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Yeah, so I'm Lauren Deon. I'm in charge of the Human Amgen stem cell co facility at MGH. Yeah, so I'm Lauren, I'm in charge of the Human AM stem cell co facility at MGH.So I've been working with human Amgen stem cells for years now since I was a postdoc in George De Lab before, from four, four years. And so right now we have two cell lines, H one and H nine, which are both from Y cell. And so the way we are expanding or maintaining these cells in culture is by, at least the way we are splitting these cells is by using collagenous.So what I usually do is for the first few passage after throwing the cells, I use a technical, the picking colonies. So in this case, I can check under the microscope which colonies are good and differentiate and nice shape, and I will collect only these colonies and I will cut them in few pieces and put them back in, in a fresh flat. And the, the colonies that look kind of differentiate it are just left them alone.The other way to pass the cells is by using trypsin. So I don't use this technique here. I think collagenase is a little bit safer because human being stem cells don't like to be individualized or they don't like to be alone.So if you do trypsin, if you use trypsin for a little bit too long, if you use it for like three to four minutes, which is the way we use strips in for other type of cells, human stem cells will be individualized and most of them will die or just differentiate or will not attach to the myth. So the idea is you have to keep the cells as clumps. You don't want them to be alone in the in, in the flask.So using collagenase, the advantage is to keep cells as plants. Using chipsy, you just select for cells that will survive this very, very harsh process of g opsonization. So these cells are usually very highly proliferative.So you get, you can adapt your cells to this tripsin process. The problem is that you have cells that they behave differently, they go much faster. And one risk is that you can get some commercial abnormality to, to this, to this very high division process.So you say that ization can cause selection of cells in culture for most proliferative cells.Right. More ative and probably also higher survival rates than other cells. So after proliferation, basically culture after proliferation in tripsin, after several passages become a different culture, these different properties.So it's, it's hard to figure out if they are exactly identical. If you do the test, the usual test, let's say you check markers, regular markers of end differentiated cells like OC four, nano one 60 SC four C, C3, all this molecule might still be expressed. If you do TER formation, this cells might still differentiate and be formed like al like normal cells.If you look at the karyotype, you might have some abnormality, but you might still have a normal karyotype. The, the, the selective advantage might be due to just a mutation that you cannot see by doing a karyotype. So the fact that they grow much faster is by itself I think a little bit worser.And if we want to use these cells for transplantation at some point, I would definitely not use this type of cells.Okay. So would you like to tell me what are the main technical problems with using this technique for, for passages of cells? So using S, yes.It's just a little bit longer and also it's, since the cells are not going as fast, it's just much longer to get a high number of cells to do some experiment. So it's just less convenient I would say. Would you like to tell me about few words about the goals of your experiment?How do you use CS cells? Okay, so my main project here is to get endothelial cells from human AB stem cells. And the idea is to be able to make blood.And we are working a lot with tissue bioengineering labs and one of their goal is to make tissue in vitro. But one of the limitation to this is the lack of blood vessels going through this tissues. So if we can bring endothelial cells or put endothelial cells in this tissue, we would have better growth of this tissue.So the idea few sources of cells are known for endothelial cells like cold blood or pressure blood, but it would be interesting to have another source of cells like human years. And the advantage is since human years can be expanded and most infinitely, you could modify these cells, make some inducible system and be able to use it. Then in your final product, your material cells, in this case.

Propagación de la madre embrionarias humanas (ES) Células

Investigación

Biología

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Derivación de células madre hematopoyéticas de células madre embrionarias murinas

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Derivación de células estaminales embrionarias humanas por Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Inmunoprecipitación de la cromatina de células estaminales embrionarias humanas

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This pathology causes symptoms such as intermittent claudication (pain with walking), painful ischemic ulcerations, or even limb-threatening gangrene. It is generally believed that the vascular endothelium, a monolayer of endothelial cells that invests the luminal surface of all blood and lymphatic vessels, plays a dominant role in vascular homeostasis and vascular regeneration. As a result, stem cell-based regeneration of the endothelium may be a promising approach for treating PAD.In this video, we demonstrate the transplantation of embryonic stem cell (ESC)-derived endothelial cells for treatment of unilateral hindimb ischemia as a model of PAD, followed by non-invasive tracking of cell homing and survival by bioluminescence imaging. The specific materials and procedures for cell delivery and imaging will be described. This protocol follows another publication in describing the induction of hindlimb ischemia by Niiyama et al.1

The surgical procedure for delivery of embryonic stem cell-derived endothelial cells to the ischemic hindlimb is demonstrated, with non-invasive tracking by bioluminescence imaging.

Células madre embrionarias-las células endoteliales derivadas de tratamiento de la isquemia Miembro Posterior

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

El aislamiento y la derivación de células embrionarias de ratón Germinal

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

La diferenciación de células madre embrionarias en los precursores de oligodendrocitos

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

El destino de la asignación de células estaminales embrionarias humanas mediante la formación de teratoma

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Use of LysoTracker to Detect Programmed Cell Death in Embryos and Differentiating Embryonic Stem Cells

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and organs1,2,6,7. During development, toxic chemicals or genetic alterations can cause an increase in PCD or change PCD patterns resulting in developmental abnormalities and birth defects3-5. To understand the etiology of these defects, the study of embryos can be complemented with in vitro assays that use differentiating embryonic stem (ES) cells.
Apoptosis is a well-studied form of PCD that involves both intrinsic and extrinsic signaling to activate the caspase enzyme cascade. Characteristic cell changes include membrane blebbing, nuclear shrinking, and DNA fragmentation. Other forms of PCD do not involve caspase activation and may be the end-result of prolonged autophagy. Regardless of the PCD pathway, dying cells need to be removed. In adults, the immune cells perform this function, while in embryos, where the immune system has not yet developed, removal occurs by an alternative mechanism. This mechanism involves neighboring cells (called "non-professional phagocytes") taking on a phagocytic role-they recognize the 'eat me' signal on the surface of the dying cell and engulf it8-10. After engulfment, the debris is brought to the lysosome for degradation. Thus regardless of PCD mechanism, an increase in lysosomal activity can be correlated with increased cell death.
To study PCD, a simple assay to visualize lysosomes in thick tissues and multilayer differentiating cultures can be useful. LysoTracker dye is a highly soluble small molecule that is retained in acidic subcellular compartments such as the lysosome11-13. The dye is taken up by diffusion and through the circulation. Since penetration is not a hindrance, visualization of PCD in thick tissues and multi-layer cultures is possible12,13. In contrast, TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) analysis14, is limited to small samples, histological sections, and monolayer cultures because the procedure requires the entry/permeability of a terminal transferase.
In contrast to Aniline blue, which diffuses and is dissolved by solvents, LysoTracker Red DND-99 is fixable, bright, and stable. Staining can be visualized with standard fluorescent or confocal microscopy in whole-mount or section using aqueous or solvent-based mounting media12,13. Here we describe protocols using this dye to look at PCD in normal and sonic hedgehog null mouse embryos. In addition, we demonstrate analysis of PCD in differentiating ES cell cultures and present a simple quantification method. In summary, LysoTracker staining can be a great complement to other methods of detecting PCD.

We present a simple protocol to visualize regions of programmed cell death (PCD) in mouse embryos and differentiating embryonic stem (ES) cell cultures using a highly soluble dye called LysoTracker.

El uso de LysoTracker para detectar la muerte celular programada en embriones y la diferenciación de células madre embrionarias

Programmed cell death (PCD) occurs in adults to maintain normal tissue homeostasis and during embryological development to shape tissues and ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...